基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及製備的製作方法

2023-05-21 09:38:36

專利名稱：：基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及製備的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程蛋白質藥物領域，更具體地，本發明涉及基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及其製備方法，這些融合蛋白的胺基酸序列由三部分組成從N-端開始依次為膠原蛋白序列、(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和人胂瘤壞死因子-a(TNF-ct)序列，進一步涉及這些融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核細胞中的表達、融合蛋白的分離純化，以及對惡性腫瘤細胞具有靶向作用和特異殺傷作用的證據。
背景技術：
：惡性腫瘤是對人類健康與生命危害最大的疾病之一。隨著腫瘤免疫學、分子生物學和基因工程技術的飛速發展，細胞因子療法成為抗腫瘤的分子治療學研究熱點。而利用生物工程技術在分子水平改造細胞因子結構以增強其抗瘤活性和降低毒性的有效探索，有望為細胞因子治療腫瘤開闢一條新的途徑。1.腫瘤壞死因子的研究進展腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)是一種多功能細胞因子，具有廣泛的生物活性，參與機體的免疫調節和抗腫瘤作用，它是迄今為止發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子。(1)腫瘤壞死因子的生物學功能TNF自1975年發現以來，一直受到世界各國學者的重視。TNF有TNF-a和TNF-g兩種類型。前者又被稱為惡病質素，主要由單核巨噬細胞產生；後者又被稱作淋巴細胞毒素，由活化的淋巴細胞產生。1984年獲得了人TNF-ci的cDNA克隆並在大腸桿菌中成功表達。在此基礎上人們對TNF的理化性質、生物活性及臨床應用進行了廣泛研究。TNF具有廣泛的生物活性，其最顯著特徵是在體內外能特異性地直接殺傷腫瘤細胞，TNF的抗腫瘤作用主要是由於①TNF為激發性細胞因子，可啟動廣泛的免疫炎性反應，介導天然細胞毒細胞、單核細胞和巨噬細胞對癌細胞的殺傷和溶瘤作用；②TNF可作用於血管內皮細胞，使腫瘤的血管變形受損或形成血栓，導致腫瘤發生出血性壞死或因營養缺乏而消退；③TNF可通過誘導某些腫瘤細胞凋亡來抑制癌細胞增生。由於其廣泛的抗腫瘤作用和免疫調節作用，故TNF-ci治療腫瘤的動物實驗和臨床研究巳在許多國家進行，美國FDA早在1984年就批准用TNF-a治療腫瘤的臨床試驗。動物實驗和臨床研究表明，TNF-ci對神經纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用。但是，由於TNF-ci的毒副作用大而嚴重限制了其臨床應用，毒副作用包括發熱、頭痛、噁心、嘔吐、全身倦怠和肌肉酸痛等症狀，大劑量使用可導至嚴重的低血壓、休克、DIC形成甚至死亡。TNF-a的上述缺陷，為其直接進入臨床應用造成了很大困難。但考慮到TNF-a是迄今為止發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子，因此，人們一直在努力開發其潛能。降低TNF-a的毒副作用和增強腫瘤靶向性是解決這一難題的兩個關鍵。(2)腫瘤壞死因子分子結構與作用機制人TNF-a基因定位於人類第6號染色體上，與HLA基因連鎖。編碼產物先是由233個胺基酸殘基組成的前體，含有一段由76個胺基酸殘基組成的信號肽，切除信號肽後轉化成成熟的TNF-ci，其分子量為17kD，含157個胺基酸殘基，無糖基化位點，第69位的cys和第101位的cys形成分子內二硫健。人TNF-ct的活性形式是由三個17kD亞基以同源三聚體的形式存在，每個亞基通過P摺疊以邊對面的堆積方式形成的外觀近似金字塔(三角錐)的三聚體分子。TNF-a的各種生物學效應是通過與耙細胞膜上的TNF受體結合而產生的，其受體存在於多種正常細胞及腫瘤細胞表面，分為兩種類型TNFR1和TNFR2。TNF-a與兩種受體的結合併無特異性，其受體結合部位位於金字塔的底部，N末端的(7個)胺基酸序列游離於底部並且可能影響其與受體的結合。TNFR1胞內結構域中含有一個約90個胺基酸組成的"死亡域"(deathdomain,DD)，而TNFR2沒有。TNFR1產生的信號介導細胞凋亡和通過激活核轉錄因子NF-kB而使細胞增殖、分化；TNFR2則通過不同於TNFR1，但在某些環節可發生交叉反應的信號傳導途徑激活NF-KB,使細胞增殖和分化。(3)腫瘤壞死因子融合蛋白的研究進展通過基因重組技術將TNF-cl與其他細胞因子或有導向性的短肽基因連接起來表達具有複合功能的融合蛋白，為TNF-d治療腫瘤開創了新思路。1995年Yaiig等構建了抗腫瘤相關抗原TAG72的單鏈抗體與TNF-ct融合的雙功能抗體，對表達TAG抗原的腫瘤細胞具有導向殺傷作用。1997年劉麗等針對TNF-a在腫瘤治療劑量下產生的嚴重毒副作用及一些腫瘤細胞白細胞介素-6(IL-6)受體明顯增高的事實，採用PCR技術將TNF-a突變體與人IL-6成熟肽編碼區cDNA通過人工接頭進行融合，並將融合蛋白在大腸桿菌中表達，經活性檢測結果證實該融合蛋白既具有TNF-a的抗腫瘤活性，又具有對高表達IL-6受體的腫瘤細胞特異性地殺傷作用。範彬等將hTNF-a與hPgnK5基因構建在一起，希望得到既有殺傷腫瘤細胞又可抑制腫瘤新生血管的融合蛋白，結果所獲得的新型hTNF-a較天然hTNF-ci的活性提高了IOO倍，而毒性卻為天然hTNF-a的1/3，是目前通過抑制腫瘤新生血管生長治療腫瘤的蛋白質藥物中較有前景的一種。以上研究表明TNF-a融合蛋白不失為一種很有前途的抗腫瘤導向製劑。本發明所設計的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的技術背景之一，就是根據人TNF-(i的活性形式的上述特點外觀近似金字塔(三角錐)的三聚體分子，且其受體結合部位位於金字塔的底部，N末端的(7個)胺基酸游離於底部並且可能影響其與受體的結合。因此，試圖通過基因工程手段產生重組融合蛋白的方式，在hTNF-a的N末端連接一段起封閉受體結合部位作用的膠原蛋白序列——(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除Gly(甘氨酸)以外的任意胺基酸(以脯氨酸最好)，n為任意正整數(代表重複次數)。當TNF-a形成三聚體化的活性形式時，膠原蛋白序列形成右手三股螺旋，起到封閉TNF-a受體結合部位的作用，TNF-a失去與受體結合的能力。2.基質金屬蛋白酶與腫瘤基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)是一類具有Zn2+依賴性的內源性蛋白水解酶，在細胞外基質代謝中的相互作用是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵因素，研究MMPs在不同類型腫瘤中的表達和分泌水平，對腫瘤的防治具有重要意義。(1)MMPs系統的生物學特性MMPs具有高度的同源性，迄今為止，在人類至少發現有19種之多，按作用底物不同主要分為五大類①膠原酶，包括間質膠原酶(MMP-1)、中性粒細胞膠原酶(MMP-8)和3型膠原酶(MMP-3)，主要降解I、II、III型等多種類型間質膠原和蛋白多糖的核心蛋白；②明膠酶(IV型膠原酶)，包括明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)，降解明膠和IV、V、訓、X型基底膜膠原；③基質降解素(間質溶素)，分l、2、3與matrilysin(MMP-3、-10、-11、-7)型，降解彈性纖維、纖維連接蛋白、層粘蛋白等基質糖蛋白和蛋白多糖的核心蛋白-,④膜型基質金屬蛋白酶(MT-MMP)，包括MTI-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-17)，能降解細胞外基質和活化其他MMPs;⑤其他酶類(MMP-12、-18、-19)，作用不詳。(2)MMPs系統與惡性腫瘤研究發現，MMPs產生於正常組織細胞和腫瘤細胞中，以酶原形式分泌於細胞外間隙，激活後才能降解細胞外基質。一般地，腫瘤組織高分泌一種或幾種MMPs，而正常組織不分泌或分泌量少。MMPs的活性調節受酶基因表達與調控、酶原合成與激活及抑制因子等多種因素的作用。MMPs系統紊亂，可出現相應的病理狀態，尤其在腫瘤浸潤、轉移中的作用更為突出。研究發現，MMPs系統是肺癌進展的一個重要因素，MMP-9可作為肺癌進展的預測因素，並有助於治療方案的選擇。胃癌患者血清MMP-2和MMP-9前體物質含量均顯著高於正常對照，故認為檢測血清MMP-2和fflP-9前體水平可作為腫瘤標誌物。結腸直腸癌的組織分化程度與間質膠原酶降解I型膠原蛋白的分解活性有顯著相關性。原位雜交研究表明，原發性前列腺癌的上皮細胞和一些上皮增生不良灶內可見matrilysin表達，而基質中無此酶活性。MMPs可調節基質和腫瘤間的相互作用，在肝癌的生長和侵襲中起重要作用。如基質金屬蛋白酶A(MMP-2)和基質金屬蛋白酶B(MMP-9)已被認為是惡性腫瘤侵襲轉移和預後的重要指標。綜上所述，MMPs與腫瘤的發生發展、浸潤轉移密切相關。然而，我們亦可以把MMPs與腫瘤的這種密切關係加以利用，如利用腫瘤組織高分泌一種或幾種MMPs，而正常組織不分泌或分泌量少的特點，進行抗腫瘤藥物的靶向治療。本發明所設計的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的技術背景之二，就是利用腫瘤組織高分泌一種或幾種MMPs，而正常組織不分泌或分泌量少的特點，在TNF-a與膠原蛋白序列之間，引入一種或一類腿Ps的適宜底物序列，起腫瘤靶向作用。在腫瘤組織，融合蛋白能被腫瘤組織分泌的基質金屬蛋白酶特異性切割，暴露出TNF-a的受體結合部位，表現出細胞毒作用；而在基質金屬蛋白酶活性很低的大多數正常組織，融合蛋白不表現出細胞毒作用。3.抗腫瘤導向藥物的研究進展由於全身應用抗腫瘤藥物有較大的毒副作用，導向治療(亦稱靶向治療)成為腫瘤治療的熱點。導向治療就是利用某一載體與抗腫瘤藥物結合，將藥物特異性地運載到腫瘤靶細胞上，在腫瘤局部釋放藥物從而充分發揮藥物獨特的藥理作用，針對性地殺死腫瘤細胞。導向治療的效果依賴於其載體的導向性強弱和"彈頭"的殺傷能力大小。目前常用的導向藥物是以單克隆抗體為特異性載體製成的抗腫瘤單抗導向藥物。1975年Kohler和Milstein建立單克隆抗體製作技術以來，單克隆抗體技術已經超出免疫學及細胞生物學範疇而應用於廣泛領域並對推動其進步作出了巨大貢獻。抗腫瘤單抗導向藥物一般可包括兩類一是以抗腫瘤單抗為治療劑；二是抗腫瘤單抗偶聯物，或稱免疫偶聯物。免疫偶聯物分子由單抗與"彈頭"藥物兩部分構成。這些單抗所針對的靶標通常為腫瘤細胞表面的腫瘤相關抗原或特定的受體。用作"彈頭"的物質主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素。有關單抗導向藥物的實驗與臨床研究結果已為應用於治療腫瘤展示良好的前景，但仍有些問題需要進一步研究解決。單抗導向藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面問題主要是人抗鼠抗體(HAMA)反應。因為多年來用於臨床研究的偶聯物多數使用小鼠單抗製備，往往導致HAMA反應。此外，腫瘤細胞群體在抗原性方面的異質性，腫瘤細胞的抗原性弱等也可能影響偶聯物的療效。藥理學方面的問題主要是到達腫瘤的藥量不足。為解決單抗導向藥物應用中的問題和障礙，當前研究主要趨向包括3方面①降低單抗偶聯物的免疫原性；②提高單抗偶聯物在腫瘤的濃度；③導向策略的探索。其中導向策略又包括①活化酶與前體藥物聯合使用，在靶腫瘤進行酶活化。前體藥物(prodrug)是指該藥無治療活性或僅有較低活性，需在體內經過代謝轉化為活性型才顯示藥物活性。藥物前體化策略在藥物化學與化療領域已得到應用，其優越性是可能降低毒性和延長藥物體內作用的時間。②以特定受體或特定的基因表達蛋白為耙標。③以血管內皮細胞為靶標。本發明所設計的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白同時解決了腫瘤導向性和降低TNF-ci毒副作用二個存在的主要問題，具備基質金屬蛋白酶導向性的腫瘤靶向特徵和殺傷腫瘤細胞作用，具有開發成腫瘤靶向治療藥物的前景。
發明內容本發明的內容主要涉及一類基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白及其製備方法，進一步涉及所述融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核細胞中的表達、融合蛋白的分離純化及體內外活性測定，因此，本發明的內容主要有以下幾個方面本發明最重要的內容在於提供系列基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白，該系列融合蛋白是一類全新的分子，其特徵在於胺基酸序列由三部分組成從N-端開始依次為膠原蛋白序列、(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a(TNF-a),各序列之間有012個起連接作用的甘氨酸或任意胺基酸殘基。其特徵在於當腫瘤壞死因子-a形成三聚體化的活性形式時，其N-端膠原蛋白序列形成右手三股螺旋，腫瘤壞死因子-a的受體結合部位被膠原蛋白三股螺旋和基質金屬蛋白酶底物序列所封閉，失去與腫瘤壞死因子受體(TNFR)識別和結合的能力。在腫瘤組織，融合蛋白能被腫瘤組織分泌的基質金屬蛋白酶所切割，從而暴露出腫瘤壞死因子-a的受體結合部位而活化、表現出細胞毒作用；而在不分泌基質金屬蛋白酶或活性很低的絕大多數正常組織，該融合蛋白不表現出細胞毒作用。與因為毒副作用過大而無法應用於臨床腫瘤治療的原型腫瘤壞死因子-a相比較，本發明製備的融合蛋白具有腫瘤靶向性、提高腫瘤特異性、減少全身用藥量、降低毒副反應等優點，在臨床腫瘤治療方面有很好的應用前景。本發明的第二個內容在於提供一系列基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-ct融合蛋白基因的原核表達質粒(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)，其特徵在於每一個原核表達質粒均含編碼膠原蛋白序列、(一種或一類)編碼基質金屬蛋白酶底物序列和編碼人腫瘤壞死因子-a序列的融合蛋白基因，並能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白。本發明的第三內容在於提供一系列表達基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白的工程菌，其特徵在於為帶有一種pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF質粒的ADE3大腸桿菌，每一種工程菌均能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白。本發明的第四個內容在於提供基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白對惡性腫瘤細胞具有靶向作用和特異殺傷作用的證據。本發明第五個內容在於提供一種獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，應用基因克隆技術，構建含膠原蛋白序列、基質金屬蛋白酶底物序列和腫瘤壞死因子-a序列的融合基因的原核表達載體，並在大腸桿菌中獲得高效表達，再經分離純化獲得融合蛋白。所述的獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，按以下步驟製備(1)人腫瘤壞死因子-acDNA的克隆(pGEM-hTNF-a)採用RT-PCR法，從LPS誘導的單核細胞擴增hTNF-ctcDNA的編碼區，並克隆到pGEM-TEasy載體，獲得hTNF-a編碼區的重組質粒，命名為pGEM-hTNF-a;(2)膠原蛋白編碼序列重組質粒pGEM-collagen的構建人工合成膠原蛋白編碼序列的正負互補鏈(兩端分別加上NcoI和EcoRI半酶切位點)，退火成雙鏈，定向克隆至pGEM-TEasy載體(NcoI和EcoRI雙酶切)中，獲得膠原蛋白編碼序列的重組質粒，命名為pGEM-collagen;(3)目的融合蛋白基因質粒系列(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的構建通過引物5'-端修飾的方式，上遊引物引入針對一個或一類人金屬蛋白酶的適宜底物序列中的一個，且上遊和下遊引物分別添加EcoRI和SacI酶切位點，以pGEM-hTNF-ct質粒為模板，通過PCR擴增所需的腫瘤壞死因子-a編碼區，PCR產物經雙酶切後，定向插入至pGEM-T-collagen重組質粒的相應雙酶位點，獲得編碼膠原蛋白序列、人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a序列的目的融合蛋白基因克隆質粒系列，命名為pGEM-collagen-MMPnm-hTNF克隆質粒系列(其中MMPnm對應於相應的MMP及其序列編號)；(4)目的融合蛋白基因原核表達質粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnra-hTNF)的構建pGEM-collagen-MMPnm-hTNF質粒系列的每一種質粒分別進行Ncol和SacI雙酶切，並將目的片段定向克隆至pET-32a(+)質粒，獲得一系列目的融合蛋白基因原核表達質粒，命名為pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表達質粒系列；(5)目的融合蛋白表達工程菌系列的獲得用編碼正確的pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF質粒DNA，轉化入DE3感受態大腸桿菌，篩選出經DNA測序確定序列正確的菌落作為工程菌，工程菌系列的每一種工程菌均能表達一種人基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白，命名為collagen-MMPnm-hTNF蛋白系列；(6)目的融合蛋白的誘導表達工程菌為IPTG誘導型表達菌，所述目的融合蛋白通過IPTG誘導表達；(7)目的融合蛋白的分離和純化工程菌經IPTG誘導表達的融合蛋白，通過細菌裂解釋放可溶性蛋白和包涵體；再通過Trx，Tag標籤或Hi"Tag標籤或S*Tag標籤親和層析純化；然後通過腸激酶切除來自載體的標籤部分，並通過S印hadexG-100或S印hadexG-75柱層析純化目的融合蛋白。所述目的融合蛋白基因原核表達質粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnin-hTNF)，為含編碼膠原蛋白序列、編碼(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和編碼人腫瘤壞死因子-a序列的融合蛋白基因的一系列質粒。所述目的融合蛋白表達工程菌系列為一系列帶有pET-32a(+)_collagen-MMPnm-hTNF質粒的大腸桿菌，每一種工程菌均能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白。利用基因工程技術，本發明製備的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白具備基質金屬蛋白酶導向性的腫瘤靶向特徵和殺傷腫瘤細胞作用，具有開發成臨床腫瘤靶向治療藥物的前景。圖1(即摘要附圖)示出基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的胺基酸序列由三部分組成從N-端開始依次為膠原蛋白序列、人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a序列；圖2示出重組pET-32a(+)-collagen-MMPl，8a-hTNF表達質粒插入基因測序圖譜；圖3示出重組pET-32a(+)-collagen-MMP1,8b-hTNF表達質粒插入基因測序圖譜；圖4示出重組pET-32a(+)-collagen-MMP2,9a_hTNF表達質粒插入基因測序圖譜；圖5示出重組pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF表達質粒插入基因測序圖譜；圖6示出4種工程菌粗蛋白提取物SDS-PAGE電泳圖譜，圖譜中各泳道分別為M為分子標準，1和3分別為工程菌(帶pET-32a(+)-collagen-MMPl,8a-hTNF表達質粒)經ImMIPTG誘導4h(33。C)的和未經誘導的粗蛋白提取物，2和4分別為工程菌(帶pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF表達質粒)經lmMIPTG誘導4h(33°C)的和未經誘導的粗蛋白提取物，5和6分別為工程菌(帶pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF表達質粒)經lmMIPTG誘導4h(33°C)的和未經誘導的粗蛋白提取物，7和8分別為工程菌(帶pET-32a(+)-collagen-MMPl，8b-hTNF表達質粒)經lmMIPTG誘導4h(33tO的和未經誘導的粗蛋白提取物。具體實施例方式本發明採用RT-PCR法，從LPS誘導的單核細胞擴增hTNF-acDNA的編碼區，並克隆到pGEM-TEasy載體，獲得hTNF-cl編碼區的重組質粒，命名為pGEM-hTNF-a，基因序列與GenBank數據(GI:25952110)完全一致。本發明採用人工合成膠原蛋白編碼序列的正負互補鏈(兩端分別加上NcoI和EcoRI雙酶切位點)，退火成雙鏈，定向克隆至pGEM-TEasy載體(NcoI和EcoRI雙酶切)中，獲得膠原蛋白編碼序列的重組質粒，命名為pGEM-collagen,基因序列與設計一致。本發明採用通過引物5'-端修飾的方式，上遊引物引入金屬蛋白酶底物序列，且上下遊引物分別添加EcoRI和SacI雙酶切位點，以pGEM-hTNF-a質粒為模板，通過PCR擴增所需的腫瘤壞死因子-a編碼區，PCR產物經雙酶切後，定向插入至pGEM-T-collagen重組質粒的相應雙酶位點，獲得編碼膠原蛋白序列、基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a序列的目的融合蛋白基因克隆質粒，命名為pGEM-collagen-MMPmn-hTNF克隆質粒系列(其中MMPnm對應於相應的MMP及其序列編號)。由於已發現的MMPs有19種之多，可分為5類，因此，對每一種或每一類MMPs均分別設計2-4個相應的適宜底物序列並構建相應的重組質粒，如以膠原酶類(主要包括MMP-1和MMP-8)的2個底物序列構建的質粒分別命名為pGEM-collagen-MMPl，8a-hTNF和pGEM-collagen-MMPl，8b-hTNF，依此類推。每種pGEM-co11agen-MMPmn-hTNF質粒分別進行NcoI和SacI雙酶切，並將目的片段定向克隆至pET-32a(+)質粒，獲得一系列目的融合蛋白基因原核表達質粒，命名為pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表達質粒系列，命名規則同前。本發明採用編碼正確的pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表達質粒DNA，分別轉化入DE3感受態大腸桿菌，篩選出經DNA測序確定序列正確的菌落作為工程菌，每一種工程菌均能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白，蛋白質命名為collagen-MMPmn-hTNF蛋白系列。本發明採用工程菌為IPTG誘導型表達菌，目的融合蛋白通過IPTG誘導表達，目的蛋白佔總蛋白的50%左右，其中可溶性蛋白較少(:佔總蛋白的10%左右)，包涵體蛋白較多(佔總蛋白的40%左右)。工程菌經IPTG誘導表達的融合蛋白，通過細菌裂解釋放可溶性蛋白和包涵體；再通過Trx，Tag標籤或His，Tag標籤或S'Tag標籤親和層析純化；然後通過腸激酶切除來自載體的標籤部分，並通過S印hadexG-100或S印hadexG-75柱層析純化目的融合蛋白。對4種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-ci融合蛋白(collagen-MMP1，8a-hTNF、和collagen-MMP1，8b-hTNF、ollagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白)進行了酶學分析和體外瘤實驗。結果顯示，未經相應的MMP活化的融合蛋白對多種腫瘤細胞的細胞毒作用很低(細胞殺傷率20%以下)，而經MMP活化的融合蛋白對L929細胞系具很高的細胞毒作用(細胞殺傷率70%以上)。本發明的collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白是針對MMP-2和MMP-9設計的，分子中含MMP-2和MMP-9識別胺基酸序列。collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白對正常培養的H08910卵巢癌細胞(未抑制MMPs)，最大劑量組細胞殺傷率分別達(74.3±11.2，%)和(81.0±15.0,%);而對BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的H08910卵巢癌細胞，最大劑量組細胞殺傷率分別僅(26.4±8.1，％)和(25.6±4.0，％)。以上結果提示，對本發明製備的系列基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白具備基質金屬蛋白酶導向的腫瘤靶向性特徵和殺傷腫瘤細胞作用，具有開發成腫瘤靶向治療藥物的前景。以下將按實施例詳細描述本發明實施例l.人腫瘤壞死因子-acDNA(pGEM-hTNF-a)的克隆1.PCR引物及其序列(擴增產物650bp)Senseprimer:5'CGGAATTCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCG3'下劃線處為EcoRI酶切位點Anti-senseprimer:5'GCGAGCTCGTTTGAGCCAGAAGAGGTTGAGGG3'下劃線處為SacI酶切位點2.KT-PCR按常規方法從人靜脈血中分離單核細胞，LPS(100ng/ml)刺激3h後，提取細胞總RNA;以此為模板進行RT-PCR反應，反應總體積50ul。反應條件為94。C變性lmin，65。C退火lmin,72。C延伸lmin，共30次循環。3.克隆PCR產物經純化後，EcoRI和SacI雙酶切，再與雙酶切pGEM-TEasy載體(:NcoI和EcoRI雙酶切)連接，並轉化至大腸桿菌DH5ci中。陽性克隆經測序確定後，得到hTNF-acDNA的重組質粒，命名為pGEM-hTNF-a。實施例2.膠原蛋白編碼序列重組質粒pGEM-collagen的構建1.膠原蛋白重複序列寡核苷酸序列膠原蛋白序列其特徵為胺基酸序列為(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除Gly(甘氨酸)以外的任意胺基酸(以脯氨酸最好)，n為任意正整數(代表重複次數)。因此，有多種符合此特徵的序列，舉例正鏈(65nt):5'CATGGGTCGTCGTGGTCCACCTGGTCCACCTGGCCCACCTGGCCCACCTGGTCCACCTGGTCCGG3'負鏈(65nt):5'AATTCCGGACCAGGTGGACCAGGTGGGCCAGGTGGGCCAGGTGGACCAGGTGGACCACGACGACC3'退火形成雙鏈(雙鏈兩分別帶的NcoI酶位點和EcoRI酶位點)2.克隆將退火形成的雙鏈定向連接至pGEM-TEasy載體(Ncol和EcoRI雙酶切)，並轉化至大腸桿菌DH5ci中。陽性克隆經測序確定後，獲得膠原蛋白編碼序列的重組質粒，命名為pGEM-collagen。實施例3.目的融合蛋白基因質粒(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的構建1.PCR引物及其序列由於已發現的MMPs有十多種，可分五大類，因此，每一類MMP均分別設計2~~4個相應的適宜底物序列(通過引物設計實現)並構建相應的重組質粒，舉例Anti-senseprimer(對應於hTNF-a全長CDNA終止密碼子及其後3個鹼基位置)5'GCGAGCTCTCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG3'下劃線處為SacI酶切位點Senseprimers(對應於hTNF-a全長cDNA位置410-431):5'CGGAATTCGGTGGT............AGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG3'其中，劃線處為EcoRI酶切位，............代表一類MMP的適宜底物序列(有許多種)。引物舉例(代表膠原酶和膠原酶適宜底物序列)1)含I型膠原酶適宜底物序列Senseprimers(fflPl,8a和麗Pl,8b):5'CGGAATTCGGTGGTCCACTGGCACTGTGGGCACGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG3'5'CGGAATTCGGTGGTCCACTGGCATATTGGGCACGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG3'2)含IV型膠原酶適宜底物序列Senseprimers(MMP2，9a和MMP2.9b):5'CGGAATTCGGTGGTCCACTGGGTCTGTGGGCACGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG3'5'CGGAATTCGGTGGTCCACTGGGTATGTGGAGCCGTAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTG3'2.克隆通過引物5'-端修飾的方式，上遊引物引入金屬蛋白酶底物序列，且上下遊引物分別添加EcoRI和SacI雙酶切位點，以pGEM-hTNF-a質粒為模板，通過PCR擴增所需的腫瘤壞死因子-a編碼區，PCK產物經雙酶切後，定向插入至pGEM-T-collagen重組質粒的相應雙酶位點，獲得編碼膠原蛋白序列、基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a序列的目的融合蛋白基因克隆質粒，命名為pGEM-collagen-MMPnm-hTNF(其中MMPnm對應於相應的MMP及其序列編號)。由於已發現的MMPs有十多種，可分五大類，因此，每一類MMP均分別設計2""4個相應的適宜底物序列並構建相應的重組質粒，如膠原酶(主要是MMP-1和MMP-8)的2個適宜底物序列構建的質粒分別命名為pGEM-collagen-MMPl,8a-hTNF和pGEM-collagen-MMPl，8b-hTNF，以明膠酶(主要是MMP-2和MMP-9)的2個適宜底物序列構建的質粒分別命名為pGEM-colkgen-MMP2,9a-hTNF和pGEM-collagen-MMP2,9b-hTNF，依此類推。實施例4.目的融合蛋白基因原核表達質粒(pET-32a(+)-colkgen-MMPnm-hTNF)的構建每種pGEM-collagen-MMPnm-hTNF質粒分別進行Ncol和SacI雙酶切，並將目的片段定向克隆至pET-32a(+)質粒，獲得一系列目的融合蛋白基因原核表達質粒，命名為pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF，命名規則同實施例3。舉例pET隱32a(+)-collagen-MMPl,8a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMPl，8b-hTNF表達質粒，均能表達帶有膠原酶(主要是MMP-1和MMP-8)底物序列融合蛋白，並分別命名為collagen-MMPl,8a-hTNF蛋白和collagen-MMPl,8b-hTNF蛋白；pET-32a(+)畫collagen-MMP2,9a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP2,9b-hTNF表達質粒，均能表達帶有明膠酶(主要是MMP-2和MMP-9)底物序列融合蛋白，並分別命名為collagen-MMP2,9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2,9b-hTNF蛋白。4種原核表達質粒(pET-32a(+)-collagen-MMPl,8a-hTNF、pET國32a(+)誦collagen匪MMPl,8b-hTNF、pET-32a(+)咖collagen-MMP2,9a畫hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP2,9b-hTNF)的融合蛋白基因序列分別如序列表之序列1、序列2、序列3和序列4所示，測序圖譜分別如圖2,圖3,圖4和圖5所示，其表達的融合蛋白(collagen-MMPl,8a-hTNF蛋白、collagen-MMPl,8b-hTNF蛋白、collagen-MMP2,9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2,9b-hTNF)胺基酸序列分別如序列表之序列5、序列6、序列7和序列8所示。實施例5.目的融合蛋白表達工程菌的獲得用實施例4中所述的每一種pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF質粒DNA，分別轉化ADE3感受態大腸桿菌，篩選出經DNA測序確定序列正確的菌落作為工程菌，每一種工程菌均能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白。實施例6.目的融合蛋白的誘導表達將測序正確的入DE3工程菌在含適當Amp的LB平板中重新劃線後,挑取單克隆，接種入5mL含50|ig/tnLAmp的LB液體培養基中，37。C搖床中振蕩，培養過夜。取5mL過夜培養物接入500ml含氨苄青黴素(50ug/mL)的LB液體培養基中，37°C，250rpm，培養約3h，至對數生長中期(A^K).6)，吸出lml未經誘導的培養物放在一個1.5ml離心管中，14000g離心10min，棄上清，倒置使液體流幹，過多的培養基由紙巾吸乾。加入IPTG至終濃度O.5mmol/L，30。C,250卬m繼續培養，4h。將菌液置於冰上10min，4'C，10OOOg離心10min收集菌體。重懸細胞於0.25倍體積的預冷PBS中，4'C，10OOOg離心10min。按每克菌體沉澱加入5mLBugBusterProteinExtractionReagent重懸細胞，用槍尖吸打或渦旋。對於小量培養用1/5菌液量的BugBusterProteinExtractionreagent(例如1.5ml菌液用300ulreagent),沒必要提高用液比例以求更好的提取效果。重懸細胞時，每毫升reagent加入mLBenzonaseNuclease,以降低容菌產物的粘滯度。室溫下，搖床上孵育重懸菌液，10-20min。4。C，16,000g離心20min，將上清轉移至另一新離心管中(可溶性蛋白部分)，保存沉澱(包涵體)。進行SDS-PAGE分析，結果顯示目的蛋白佔總蛋白的50%左右(如附圖6所示)，進一步分析其中可溶性蛋白較少(約佔總蛋白的10%左右)，包涵體蛋白較多(約佔總蛋白的40%左右)。實施例7.目的融合蛋白的純化工程菌IPTG誘導表達的融合蛋白，通過細菌裂解釋放可溶性蛋白和包涵體；再通His，Tag標籤親和層析純化；然後通過腸激酶切除載體所帶標籤部分，並通過SephadexG-100層析純化；-70匸冷凍乾燥後低溫保存。1.蛋白純化按Novagen公司BugBusterHis.BindPurificationKits試劑盒方法進行，NovagenChromatographyColumns可容納2.5ml樹脂，艮卩5ml填料，用於20mg目的蛋白的純化，具體操作步驟①首先用去離子水潤洗cohmm，輕輕將指帽套在column頂端，用大口徑的移液器將適量的填料裝入columii(加入填料之前要將填料輕輕顛倒數次，充分混勻)，待樹脂自然下沉壓平，去掉指帽。②當樹脂儲存緩衝液剛好流出柱頂時，用3倍體積去離子水、5倍體積1Xchargebuffer、3倍體積1Xbindingbuffer,依次洗柱，使之平衡。③當緩衝液剛剛流出柱頂時，上樣。注意最大流速不超過10倍體積/小時。④用10倍體積1Xbindingbuffer、6倍體積1Xwashbuffer依次洗柱。⑤用6倍體積1Xelutebuffer洗脫目的蛋白。⑥收集洗脫液，對20mMTris-HCl(pH8.0)，lmEDTA溶液透析除鹽。2.腸激酶切除載體標籤由於表達產物是帶有pET-32a(+)載體的Trx，Tag標籤、His，Tag標籤和S*Tag標籤(標籤分子量為17.5KDa)，需要通過腸激酶切除和層析純化，具體操作步驟腸激酶酶切，按Novagen公司重組腸激酶使用說明書進行，反應體系融合蛋白11.5mg/ml，重組腸激酶23U,10X緩衝液10ul,溫度(。C)23，時間812小時，酶切效果經SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。3.SephadexG-100層析純化酶切產物上充分平衡的SephadexG-100柱，洗脫液為20mMPB(pH6.0)，0.1MNaCl溶液，連續洗脫4-5個柱床體積，收集畚洗脫峰(280nm監測)，進行SDS-PAGE電泳檢測，分子量20KDa的蛋白峰為目的蛋白(第二個蛋白峰)，-70匸冷凍乾燥後低溫保存。舉例說明4種冷凍粉可分別稱為collagen-MMPl，8a-hTNF蛋白、collagen-MMPl,8b-hTNF蛋白、collagen畫MMP2,9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2,9b-hTNF蛋白。實施例8.金屬蛋白酶對融合蛋白的去封閉效果研究為了解本發明所述融合蛋白對受體結合部位的封閉效果及其MMPs的去封閉效果去，進行了人血清和MMPs酶的酶切融合蛋白實驗。反應體系為O.1mol/LTrisHC1緩衝液(pH7.1)，0.05mol/LCaCl2，10mg/L融合蛋白，加終濃度l(B血清或10u/LMMP(與融合蛋白底物序列相一致的MMP)，37'C溫育10分鐘。反應產物稱為去封閉融合蛋白。檢測反應產物通過普通的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，電泳後凝膠經考馬斯亮蘭染色，通過與蛋白質標準及融合蛋白(未經酶切)對比判斷酶切效果，融合蛋白酶切後由原來一條帶(20KDa)轉變為二條帶(17KDa和3KDa)。舉例說明結果血清對4種融合蛋白均無切割作用；MMP-l和MMP-8均能切割collagen-MMPl,8a-hTNF蛋白和collagen-MMPl,8b-hTNF蛋白，MMP-2和MMP-9底物序列融合蛋白，均能切割collagen-MMP2,9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2,9b-hTNF蛋白。實施例9.基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白的TNF-ci樣活性檢測為了解本發明所述融合蛋白(未被酶切去封閉)和去封閉融合蛋白的TNF-d樣生物學活性，進行了ActD致敏的L929細胞系進行細胞毒活性測定。實驗步驟對數生長期L929細胞，按2xl0"cells/孔(RPMI-1640培養基)加入96孔板中，374C5%二氧化碳培養6小時；更換新鮮培養基後每孔加入終濃度1.(Hig/mlActD致敏，並分別加入融合蛋白和去封閉融合蛋白,終濃度為0.08pg/ml、0.4嗎/ml、2.0pg/ml、10^ig/ml、50嗎/ml，以標準品TNF-a作對照(劑量設置與與融合蛋白相同)，每個劑量3個平行孔，繼續培養24小時；每孔均按終濃度50(Hig/ml加入MTT，繼續培養4小時；棄去培養液後，每孔加DMSO200P1，37t:溫育30分鐘，於酶標儀測A57。，換算出細胞殺傷率。結果舉例說明，4種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白的TNF-ci樣活性檢測結果如表1所示，未被酶切去封閉的4種融合蛋白對L929細胞系的殺傷率均很低，各劑量組細胞殺傷率均低於20%;4種去封閉的融合蛋白對L929細胞系的殺傷率均較標準品TNF-a高其中最大劑量組細胞殺傷率分別為標準品TNF-a(67.6±12.5，％)、collagen-MMPl,8a-hTNF蛋白(72.7士2(X2，％)、collagen-MMPl,8b陽hTNF蛋白(752t20.5，％)、collagen-MMP2,9a-hTNF蛋白(832±142，％)和collagen-MMP2，9b-hTNF蛋白(88.9^14.0，％)。表14種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白的TNF-a樣活性U±s,n=3)細胞殺傷率(％)^免,STNF-acollagen-MMP1,8collagen-MMP1,8collagen-MMP2,9collagen-MMP2,9a-hTNFb-hTNFa-hTNFb-hTNF標準品封閉型去封閉封閉型去封閉封閉型去封閉封閉型去封閉0.000000000000.086.2U.95.5±4.09.SM.76.0±3.213.6±356.2±0.9lt).2i2.58.2U.815.2t3.70.4017.1±2.74.6±2.519.3kt3.823.4irf.55.2M.416.2i2.115.2t3.523.&L5.12.0026.3±14.011雖225.4±5.99.5±4.264魏110.2M.033.2M.513.1±4.243.7±11.410.050.5±11.817.2￡3..461.4±16.014.7±4..977.2±9.713.2t6.853.2±10.716.4士7.663.2±16.550.067肚12.518.7±6.772.7攬219.6±5.075.2t20.5163.±4.683.2±14.217.6±4..188.處14.0實施例10.基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白殺傷腫瘤細胞與MMP分泌的關係研究為實驗融合蛋白質的靶向性效果，需對融合蛋白殺傷腫瘤細胞與MMP分泌的關係進行研究。由於MMP-2和MMP-9已被認為是惡性腫瘤侵襲轉移和預後的重要指標，故選用高分泌MMP-2和MMP-9的HO8910卵巢癌細胞。Batimastat(BB294)是新近研製的一種人工合成的基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，其化學結構類似於MMPs膠原底物酶切位點附近的三個胺基酸的基本結構，因此，對MMPs起到競爭抑制作用。根據相關報導，本實驗使用100mg/LBB294加入H08910卵巢癌細胞培養液中，抑制MMP-2和MMP-9活性。分別用正常培養的H08910卵巢癌細胞，及被BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的H08910卵巢癌細胞，進行融合蛋白的殺傷腫瘤細胞的TNF-a樣生物學活性實驗。實驗方案之細胞培養、融合蛋白使用劑量、細胞殺傷效果檢測和細胞殺傷率計算基本上與實施例9相同。結果舉例說明，本發明的collagen-MMP2，9a-hTNF蛋白和colkgen-MMP2,9b-hTNF蛋白是針對MMP-2和MMP-9設計的，分子中含MMP-2和MMP-9識別的胺基酸序列。2種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白對HO8910卵巢癌細胞的殺傷作用，結果如表2所示，collagen-MMP2,9a-hTNF蛋白和collagen-MMP2,9b-hTNF蛋白對正常培養的H08910卵巢癌細胞(未抑制MMPs)，最大劑量組細胞殺傷率分別達(74.3±11.2,%)和(:81.0土15.0，％);而對BB294抑制MMP-2和MMP-9活性的H08910卵巢癌細胞，最大劑量組細胞殺傷率分別僅(26.4±8丄％)和(25.6±4.0，％)。提示融合蛋白分子中的MMP-2和MMP-9識別胺基酸序列具有導向作用。表22.種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白tableseeoriginaldocumentpage23廣東醫學院專利.SEQdO〉廣東醫學院禍質金厲蛋白酶導向性萬:組人腫癇壞死因子融合蛋'白及製備<160〉8<210〉12<211〉557陽〈213>人工序列2gccatgggtcgtcgtggtccacctggtccacctggcccacctggcccaccggtccggaattcggtggtccactggcatattgggcacgtagtgacaagccgttgtagcaaaccctcaa蛐災刈機酥琢齷鄧酪麿尤諍g鞍準捌渲票？<160〉8tggtccacct60tgtagcccat120557〈212>DNA人丁.序列3<2ii〉557眺人.丁.序列gCC8tgggtCggtccggaatgttgt.agcssCtCCtggCC8t3CCt-C3tCtctcacccacagccat.caagagagcccatctatcaatcggcgccctgtgagtcggtggtccaccctcaagcatggcgtggeiactcccaggtccatcagccggcccctgccaatctgggaggccgactatctgagagctacctggtccaactgggtctgtg鄉ggC3ggctgagagatcctcttcaagcatcgccgtcgaggg鄉ccggtcttccagcgactttgcccctggcccactgggcacgtactccagtggcaaccagctggggccaaggcttcctaccagactggagaagggagtctgggcctggcccaccgtgac幼gcctgaaccgccgtggtgccatcgcccctccacccaaggtcaactg鄉cc肪gtgaccgactaggtctactttggtccacct60tgtagcccat120ggccaatgcc180卿gggcctg240ccatgtgctc300cctcctctct360gccctggtat420cagcgctgag480tgggatcatt540557<210〉4557<212〉瞧〈213〉人T.序列182PRT<213〉人工序列5AlaMet.GlyArgArgGl_yProPro15ProProGlyProProG1yProGlu20TrpAlaArgSerAspLysProVal35GinAlaGluGlyGinLeuGinTrp50Leu匕euAlaAsnG1yVaiGlulieu65ProSerGluGlyLeuTyrLeulie80GlyGinGlyCysProSerThrHis95SerArglieAlaValSerTyrGin110AlalieLysSerProCysGinArg125ProTrpTyrGluProlie140LeuGluLysGlyAspArg乙euSer155TyrLeuAspPheAlaGluSerGly170AlaLeu6〈2U〉182PRT〈213〉人i:序列6AlaMetGlyAi'gArgG1yProPro5ProProGlyProProGlyProGlu20TrpAlaArgSerAspLysProVal35GinAlaGluGlyGinLeuGinTrp50LeuLeuAlaAsnGlvVaiGluLeu65PvoSerGluGlyLeuTyrLeulie80GbGinGlyCysProSerThrHis95SerArglieAlaValSerTyrGinnoAlalieLysSerProCysGinArg125AlaLysProTrpTyrGluProlie"0LeuGluLysGlyAspArgLeuSer155TyrLeuAspPheAlaGluSerGly170Al3Leu7182〈212>PRT〈213〉人T序列〈400>7AlaMetGlyArgArgGlyProPro15ProProGlyProProGlyProGlu20TrpAlaArgSerAspLysProVal35GinAlaGluGlyGinLeuGinTrp50廣東醫學院專利.SEQGlyProProGlyProProGlv1015PheGlyGlyProLeuAlaLeu2530AlaHisValValAlaAsnPro4045LeuAsnArgArgAlaAsnAla5560ArgAspAsnGinLeuValVal7075Tyi'SerGinValLeuPheLvs859i)ValLeuLeuThrHisThrlie100105ThrLysValAsn匕euLeuSer115120GluThrProGluGlyAlaGlu130135TyrLeuGlyGlyValPheGin145150AlaGlulieAsnArgProAsp160165GinValTyrPheGlylielie175180GlyProProGlyProProGlv1015PheGlvGlyProLeuAlaTyr253i)AlaHisValValAlaAsnPro4045LeuAsnArgArgAlaAsnAla5560ArgAspAsnGinLeuValVal7075TyrSerGinValLeuPhe匕ys8590ValLeuLeuThrHisThrlie100105ThrLysValAsnLeuLeuSer115120GluThrProGluGlyAlaGlu130135TyrLeuGlyGlyValPheGin145150AlaGlulieAsnArgProAsp160165GinValTyrPheGlylielie175180GlyProProGlyProProGlv1015PheGlyGlyProLeuGlyLeu2530AlaHisValValAlaAsnPro4045LeuAsnArgArgAlaAsnAla5560廣東醫學院專利.SEQLeuLeuAlaAsnGlvValGluLeuArgAspAsnGinleuValVal657075ProSerGluG1yLeuTyrLeulieTyrSerGinValLeiiPheLys80859bGlyGinGlyCysProSerThrHisValILeuLeuThrHisThrlie95100105SerArglieAlaValSerTyrGinThrLysValAsnLeu匕euSer110115120AlalieLysSerProCysGinArgGluThrPi-0GluGlyAlaGlu125130135AlaLysProTrpTyrGluProlieTyrLeuGlyGlyValPheGin140145150LeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGlulieAsnArgProAsp155160165TvrLeuAspPheAlaGluSer(JlyGinValTyrPheGlylielie170175180《210>8〈2U〉182〈212>PRT〈213〉人T.序列〈8AlaMetGlyArgArgGlyProProGlyProProGlyProProGlv151015ProProGlyProProGlyProGluPheGlvGlyProLeuGlyMet202530TrpSerArgSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnPro354045GiniUaGluGlyGinLeuGinTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAla505560LeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuArgAspAsnGinLeuValVal657075ProSerGluGlyLeuTyrLeulieTyrSerGinValLeuPheLys808590GlyGinGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlie95100105Ser(VrgUe"aValSerTyrGinThrLysValAsnLeuLeuSer110115120AlalieLysSei'ProCysG]nArgGluThrProGluGlyAlaGlu125130135AlaLysProTrpTvrGluProlieTyrLeuGlyGlyValPheGin"0145150LeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGlulieAsnArgProAsp155160165TyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGinValTyrPheGlylielie170175180Ai3Leu權利要求1、一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白，其特徵在於這些新型融合蛋白的胺基酸序列由三部分組成從N-端開始依次為膠原蛋白序列、人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-α序列，各序列之間有0～12個起連接作用的甘氨酸或任意胺基酸殘基。2、據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白，其特徵在於膠原蛋白序列的胺基酸序列為(Gly-X-Y)n，其中X和Y代表除甘氨酸以外的任意胺基酸，n為任意正整數(代表重複次數)；當腫瘤壞死因子-a形成三聚體化的活性形式時，膠原蛋白序列形成右手三股螺旋，並與人基質金屬蛋白酶底物序列一起起到封閉腫瘤壞死因子-a受體結合部位的作用，腫瘤壞死因子-a失去與受體結合的能力。3、據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白，其特徵在於基質金屬蛋白酶底物序列的胺基酸序列中含有(一種或一類)人基質金屬蛋白酶能識別和切割的胺基酸序列。4、據權利要求1所述的基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白，其特徵在於人腫瘤壞死因子-a為野生型或突變型人腫瘤壞死因子-5、一種獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，其特徵在於應用基因克隆技術，構建含膠原蛋白序列、基質金屬蛋白酶底物序列和腫瘤壞死因子-a序列的融合基因的原核表達載體，並在大腸桿菌中獲得高效表達，再經分離純化獲得融合蛋白。6、據權利要求5所述的獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，其特徵在於按以下步驟製備(1)人腫瘤壞死因子-acDNA的克隆採用RT-PCR法，從LPS誘導的單核細胞擴增人腫瘤壞死因子-ci(hTNF-ex)cDNA的編碼區，並克隆到pGEM-TEasy載體，獲得hTNF-a編碼區的重組質粒，命名為pGEM-hTNF-a;(2)膠原蛋白編碼序列重組質粒pGEM-collagen的構建人工合成膠原蛋白編碼序列的正負互補鏈(兩端分別加上NcoI和EcoRI半酶切位點)，退火成雙鏈，定向克隆至pGEM-TEasy載體(NcoI和EcoRI雙酶切)，獲得膠原蛋白編碼序列的重組質粒，命名為pGEM-collagen;(3)目的融合蛋白基因質粒系列(pGEM-collagen-MMPnm-hTNF)的構建通過引物5'-端修飾的方式，上遊引物引入針對一個或一類人金屬蛋白酶的適宜底物序列中的一個，且上遊和下遊引物分別添加EcoRI和SacI酶切位點，以pGEM-hTNF-ct質粒為模板，通過PCR擴增所需的腫瘤壞死因子-a編碼區，PCR產物經雙酶切後，定向插入至pGEM-T-collagen重組質粒的相應雙酶位點，獲得編碼膠原蛋白序列、人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-a序列的目的融合蛋白基因的克隆質粒系列，命名為pGEM-collagen-MMPnm-hTNF克隆質粒系列(其中MMPnm對應於相應的MMP及其序列編號)；(4)目的融合蛋白基因原核表達質粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)的構建pGEM-collagen-腿Pnm-hTNF質粒系列的每一種質粒分別進行Nco1和SacI雙酶切，並將目的片段定向克隆至pET-32a(+)質粒，獲得一系列目的融合蛋白基因的原核表達質粒，命名為pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF原核表達質粒系列；(5)目的融合蛋白表達工程菌系列的獲得用編碼正確的pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF質粒DNA，轉化入DE3感受態大腸桿菌，篩選出經DNA測序確定序列正確的菌落作為工程菌，工程菌系列的每一種工程菌均能表達一種人基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白，命名為collagen-醒Pnm-hTNF蛋白系列；(6)目的融合蛋白的誘導表達工程菌為IPTG誘導型表達菌，所述目的融合蛋白通過IPTG誘導表達；(7)目的融合蛋白的分離和純化工程菌經IPTG誘導表達的融合蛋白，通過細菌裂解釋放可溶性蛋白和包涵體；再通過Trx'Tag標籤或His'Tag標籤或S4ag標籤親和層析純化；然後通過腸激酶切除來自載體的標籤部分，並通過S印hadexG-100或S印hadexG-75柱層析純化目的融合蛋白。7、據權利要求6所述的獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，其特徵在於目的融合蛋白基因原核表達質粒系列(pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF)，為含編碼膠原蛋白序列、編碼(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和編碼人腫瘤壞死因子-a序列的融合蛋白基因的一系列質粒。8、據權利要求6所述的獲得基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白的製備方法，其特徵在於目的融合蛋白表達工程菌系列為一系列帶有pET-32a(+)-collagen-MMPnm-hTNF質粒的大腸桿菌，每一種工程菌均能表達一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子-a融合蛋白。全文摘要一種基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及製備方法，融合蛋白的胺基酸序列由三部分組成從N-端開始依次為膠原蛋白序列、(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-α序列(如圖1所示)。當腫瘤壞死因子-α形成三聚體化的活性形式時，膠原蛋白序列形成右手三股螺旋，並與人基質金屬蛋白酶底物序列起封閉腫瘤壞死因子-α受體結合部位的作用。在腫瘤組織，融合蛋白能被腫瘤組織分泌的基質金屬蛋白酶特異性切割，暴露出腫瘤壞死因子-α的受體結合部位並表現細胞毒活性。而大多數正常組織，融合蛋白不表現出細胞毒活性。這些融合蛋白具備腫瘤靶向特徵和殺傷腫瘤細胞作用，在腫瘤治療方面有好的應用前景。文檔編號C07K19/00GK101302255SQ20071002803公開日2008年11月12日申請日期2007年5月11日優先權日2007年5月11日發明者敢侯,黃迪南申請人:廣東醫學院