一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法

2023-05-21 09:26:56

專利名稱：一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法
技術領域：
本發明涉及生物基因工程技術領域，具體的說是一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法。
背景技術：
在能進行光合作用的真核細胞中，細胞核、葉綠體和線粒體三種細胞器均含有DNA分子，構成了既獨立又相互聯繫的遺傳體系。自20世紀70年代基因工程技術誕生以來，向細胞核導入外源基因的轉化技術已經得到普遍應用。然而隨著研究的深入發展，人們逐漸認識到核基因組中的基因工程操作有著如下難以克服的困難1.細胞核基因組龐大，背景複雜；2.導入的外源基因隨機插入到核基因組中；3.外源基因表達效率低，且表達不穩定；4.有時外源基因的插入會引起其它性狀的變異，從而影響其經濟價值；5.安全性不好，夕卜 源基因容易擴散等。這些問題嚴重製約著外源基因轉化技術的改進及其在實踐中的應用。1988年，Boynton等構建了萊茵衣藻的葉綠體穩定轉化體系，首次證明了葉綠體轉化的可行性。在此之後，葉綠體轉化技術在菸草等高等植物中得到了廣泛應用。與核轉化相比，葉綠體轉化技術具有如下特點1.外源基因可以定向插入；2.外源基因表達效率高、變異小；3.葉綠體基因組屬於原核表達系統，便於遺傳操作；4.生物安全性高。葉綠體轉化系統包括以下三個關鍵因素1)同源片段葉綠體轉化基於同源重組的原理，在葉綠體表達載體時，外源基因兩側各具有一段葉綠體的同源片段，長度約IKb左右，較長的同源片段有利於同源重組的發生。2)選擇標記基因由於葉綠體自身的結構與遺傳特點，選擇標記的選擇與使用與核轉化明顯不同，也是影響葉綠體轉化效率的關鍵因素。3)葉綠體基因表達調控序列外源基因需要能夠在葉綠體中起作用的原核型啟動子和終止子，來保障外源基因整合後在葉綠體中的穩定和高效表達。亞心型扁藻(Platymonassubcordiformis),又名亞心型四爿藻(Tetraselmissubcordiformis),是一種海洋單細胞綠藻,在分類學上屬於綠藻門(Chlorophyta),青綠藻綱(Prasinophyceae),扁藻屬(Platymonas)。亞心型扁藻具有重要的應用價值,是應用於魚、對蝦、貝類等養殖中的重要餌料微藻，其多糖含量非常高，具有抗腫瘤活性，還可作為油脂代謝調控的貯藏物質來源。另外，亞心型扁藻還可進行光合產氫，在解偶聯劑CCCP的誘導下，其產氫效率可達50±3ml/l。儘管目前尚缺乏對亞心型扁藻葉綠體基因組序列的了解，但參照高等植物以及其它單細胞綠藻的相關研究，可以有把握地推測，亞心型扁藻葉綠體中編碼許多與光合固碳、油脂代謝等重要過程相關的基因，因此，在亞心型扁藻中構建葉綠體表達系統可以為其遺傳改造提供有力的工具，工程藻株有望在構建高效微藻反應器(生產高值蛋白、油脂或氫氣)、開發口服型漁藥等方面發揮獨特優勢。特別是，亞心型扁藻細胞中只有一個巨大的杯型葉綠體，這一結構也有利於葉綠體遺傳轉化體系的建立，其技術關鍵是發展葉綠體同源整合平臺，以及可在葉綠體內進行篩選的相關機制，最終實現外源基因在葉綠體基因組中的整合與穩定表達。但至目前為止，亞心型扁藻遺傳轉化研究僅限於核基因組操作，葉綠體基因組操作研究領域尚屬完全空白。

發明內容
本發明的目的是提供一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法利用SEQ ID NO :I所不的序列、SEQ ID NO :2所不的序列和帶有選擇標記的外源基因構建的DNA重組片段，將其插入克隆載體如pMD-18T，pBluscript KS, pBluescript SK+,並導入亞心型扁藻細胞，轉化後經培養篩選獲得轉基因亞心型扁藻。所述利用的SEQ ID NO : I所示的序列採用由SEQ ID NO 1所示的序列3』端起始，向5』端延伸至不小於Ikb的連續片段所代替。所述利用的SEQ ID NO 2所示的序列採用由SEQ ID NO 2所示的序列5』端起始，向3』端延伸至不小於Ikb的連續片段所代替。所述帶有選擇標記的外源基因為外源葉綠體啟動功能的啟動子、終止子和選擇標記的DNA片段。其中外源葉綠體啟動功能的啟動子和終止子，可以來源於模式衣藻的葉綠體基因組，或者來源於研究較清楚的高等植物葉綠體，如擬南芥，菸草，或油菜等。所述選擇標記基因為草丁膦抗性基因bar基因。所述篩選試劑為除草劑草丁膦。本發明方法成功構建了亞心型扁藻的葉綠體穩定表達系統。通過本發明能夠有效的將外源基因重組到亞心型扁藻的葉綠體基因組中，並通過篩選獲得轉基因藻株。與現有技術相比，本發明實現了亞心型扁藻基因工程技術的重點突破，具有如下有益效果I、本發明提供用於亞心型扁藻葉綠體轉化的葉綠體基因組序列。2、本發明利用亞心型扁藻對除草劑草丁膦的敏感性，採用一種可行的選擇標記基因-選擇壓力組合(bar基因-草丁膦)用於葉綠體轉化體系的構建，依靠在葉綠體中表達翻譯的抗性蛋白幫助轉化子在除草劑篩選壓力下存活是本發明的又一技術特點。3、本發明能將外源基因定點整合到亞心型扁藻的葉綠體基因組上，並能實現外源基因的穩定表達。4、本發明能使外源基因在亞心型扁藻葉綠體中高效表達，並能大量積累目的蛋白。5、本發明能在亞心型扁藻葉綠體中同時表達多個外源基因。6、本發明利用葉綠體遺傳表達的原核性質，外源重組DNA可以是多順反子，操作簡便，表達效率高。


圖I為本發明實施例提供的含有本發明的同源重組片段的亞心型扁藻葉綠體基因組DNA片段。其中l_1608bp下劃線標註部分，為16S-trnI區域的片段，即SEQ ID NO:I ；1629-3729bp斜體標註部分，為trnA_23S區域的片段，即SEQ ID NO :2。圖2為本發明實施例提供的質粒p64D物理圖譜。圖3為本發明實施例提供的質粒pSVbar物理圖譜。
圖4為本發明實施例提供的質粒pPSCB物理圖譜。圖5為本發明實施例提供的PCR產物電泳圖(其中引物為5』atpA for和3』rbcLrev，泳道1-11為草丁膦抗性藻株；泳道12為野生型藻株；泳道M為分子標記DL2000)。圖6為本發明實施例提供的PCR產物電泳圖(其中引物為con_16s for和COn-23s-rev，泳道I為空白對照；泳道2為野生型藻株；泳道3和4為陽性轉基因藻株；泳道5為質粒pPSCB ;泳道M為分子標記DL2000)。圖7為本發明實施例提供的轉基因亞心型扁藻Southern雜交圖，(其中泳道I為野生型藻株；泳道2和3為陽性轉基因藻株；泳道4為質粒pPSCB)。
具體實施例方式本發明獲得的亞心型扁藻葉綠體轉化藻株，是指利用基因槍法或珠磨法等其他直接導入方法，將含有本發明的亞心型扁藻葉綠體同源重組片段的載體導入亞心型扁藻葉綠體中，通過同源重組，將帶有外源基因的外源DNA片段定點插入到亞心型扁藻葉綠體基因組中，特別是trn I和trnA之間的間隔區。下面結合實施例對本發明的方法及該方法所達到的效果作進一步詳細說明。實施例實現除草劑抗性基因在亞心型扁藻葉綠體中的穩定表達一、亞心型扁藻兩段葉綠體同源重組片段的擴增與克隆設計併合成如下兩對弓I物Pl :5』 -CGGGGTACCTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3』 (下劃線為 Kpn I 酶切位點)P2 :5』 -GCGTCGACTTGAGGCAAATGGGCTATGC-3』 (下劃線為 Sal I 酶切位點)P3 :5』 -TTGCGGCCGCACAACGGAGTTTCGGAATA-3』 (下劃線為 Not I 酶切位點)P4 :5』 -CGAGCTCCGTTACTCAAACCGACATTC-3，(下劃線為 Sac I 酶切位點)其中引物Pl和P2的擴增產物是SEQ ID NO :1，即片段16S_trnI ;引物P3和？4的擴增產物是SEQ ID NO :2，即片段trnA-23S(參見圖I)。以亞心型扁藻基因組總DNA為模板，經引物Pl和P2進行PCR擴增，反應程序為940C IOmin 預變性；94°C lmin，5(TC 90sec，72°C 90sec，共 30 個循環；72°C IOmin 延伸。PCR擴增產物約為1288bp，即為片段16S-trnI，將片段經瓊脂糖凝膠電泳後，經膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR產物用Kpn I和Sal I酶切，與經過同樣酶切的pBluescript SK載體(Sigma公司)連接，獲得含有片段16S-trnI的重組質粒pSK16I。以亞心型扁藻基因組總DNA為模板，經引物P3和P4進行PCR擴增，反應程序為940C IOmin 預變性；94°C lmin，50°C 100sec,72°C lOOsec，共 30 個循環；72°C IOmin 延伸。PCR擴增產物約為1405bp，即為片段trnA-23S，將片段經瓊脂糖凝膠電泳後，經膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR產物用Not I和Sac I酶切，與經過同樣酶切的pSK16I連接，獲得含有片段trnA-23S和片段16S_trnI的重組質粒pSK16I/A23。上述獲得的重組質粒pSK16I/A23上，兩段插入序列trnA_23S和16S_trnI之間有一段多克隆位點，包括Sal I, EcoRV, BamH I和Xba I等，可以繼續插入外源DNA片段。二、含有除草劑草丁膦抗性基因(bar)的亞心型扁藻葉綠體定點轉化載體pPSCB的構建載體pPSCB的構建是以上述重組質粒PSK16I/A23為基礎的。載體pPSCB的構建過程分為3步。首先，設 計併合成以下引物。5』 atp A for :5』 -GCGTCGACAAGCTTATCGATGACTTTATTAG-3』 (下劃線為 Sal I 酶切位點)5』 atp A rev :5』 -CCGATATCGGACATTTTCACTTCTGGAGT-3』 (下劃線為 EcoRV 酶切位點)Bar for :5』 -CCGATATCATGAGCCCAGAACGACGCC-3，(下劃線為 EcoRV 酶切位點)Bar rev 5，-CGGGATCCTCATCAAATCTCGGTGACGGG-3，(下劃線為 BamH I 酶切位點)3』 rbcL for :5』 -CGGGATCCGTACTCAAGCTCGTAACGAAG-3』 (下劃線為 BamH I 酶切位點)3』rbcL rev 5，~GCTCTAGAGGATCGCACTCTACCGATT~3，(下劃線為 Xba I 酶切位點)其中，引物5』atpA for和5』atpA rev的擴增產物是5』atpA,為來源於萊茵衣藻葉綠體的具有葉綠體啟動功能的啟動子；引物3』 rbcL for和3』 rbcL rev的擴增產物是3』 rbcL,為來源於萊茵衣藻葉綠體的具有葉綠體啟動功能的終止子；引物Bar for和Barrev的擴增產物是bar基因，為草丁膦抗性基因。質粒p64D為模式藻種萊茵衣藻的葉綠體轉化載體，由中國農業科學院生物技術所所得(質粒圖譜參見附圖2)。這個載體上有葉綠體啟動功能的啟動子5』atpA和終止子3』rbcL。質粒pSVbar (質粒圖譜參見附圖3)含有草丁膦抗性基因bar基因，其構建過程為載體pSV40LacZ經Sac II酶切、回收、補平；載體pGEM/bar經Nco I和Ncot I酶切、回收小片段(帶有bar基因)、補平；T4連接酶連接上述大小片段，其中載體pSV4LacZ和pGEM/bar均購自Clotech公司。以質粒p64D為模板,經引物5』atpA for和5』atpA rev進行PCR擴增,擴增產物即為萊茵衣藻葉綠體啟動功能的啟動子片段，PCR反應程序為94°C 5min預變性；94°C lmin,50°C40sec，72°C50sec，共30個循環；72°C IOmin延伸，產物為668bp。瓊脂糖凝膠電泳後，經膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR產物用Sal I和EcoR V酶切，與經過同樣酶切的上述pSK16I/A23連接，獲得含有萊茵衣藻葉綠體啟動功能的啟動子的重組質粒pSK1623atp。以質粒p64D為模板經引物3』 rbcL for和3』 rbcL rev進行PCR擴增,擴增產物即為萊茵衣藻葉綠體啟動功能的終止子；PCR反應程序為94°C 5min預變性；94°C lmin,50°C 30sec，72°C 40sec，共30個循環；72°C IOmin延伸，產物為450bp。瓊脂糖凝膠電泳後，經膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR產物用BamH I和Xba I酶切，與經過同樣酶切的上述pSK1623atp連接，獲得重組萊茵衣藻葉綠體啟動功能的終止子的質粒pSK1623_53。以質粒pSVbar為模板經引物Bar for和Bar rev進行PCR擴增，擴增產物即為草丁膦抗性基因bar基因，PCR反應程序為94°C 5min預變性；94°C lmin, 50°C 30sec,72°C40sec，共30個循環；72°C IOmin延伸，產物為560bp。瓊脂糖凝膠電泳後，經膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR產物用EcoRV和BamH I酶切，與經過同樣酶切的pSK1623_53連接，獲得含有草丁膦抗性基因bar基因的重組質粒pPSCB (質粒圖譜見附圖4)。質粒pPSCB上，在片段3』rbcL與trnA-23S之間有Cla I和Not I等多克隆位點，用以插入外源基因。三、基因槍轉化法將質粒pPSCB導入亞心型扁藻在轉化前lh，取濃度約為5. OX IO5Cell πιΓ1的對數生長期的亞心型扁藻藻液，離心力6000g離心5min，棄上清，用f/2培養液調整濃度到I X IO8ceIlml'然後取O. 2ml藻液塗在f/2固體培養平板的中央，呈直徑約3cm的圓形。塗好的平板置於超淨工作檯中備用。微粒子彈的製備取50 μ L金粉懸浮液(約含3mg金粉)邊渦旋邊加入5 μ L質粒(質粒濃度>=Iyg μ Γ1), 50 μ L 2. 5Μ CaCl2, 20 μ L O. IM亞精胺。然後繼續渦旋3min。離心5-6sec,棄上清。然後用250 μ L無水乙醇洗兩次,最後用60 μ L無水乙醇重懸。這樣一管包被了質粒的微粒子彈可用於5-6次轟擊。在無菌條件下(超淨工作檯中)，用高壓氦氣式基因槍進行轟擊。轟擊後，藻細胞先在固體培養平板上黑暗條件下培養8h，然後再轉到f/2培養液中繼續培養40h，使細胞生長狀態得以恢復。 四、葉綠體轉化藻株的獲得經過恢復培養的亞心型扁藻細胞，轉到選擇性培養液中，以殺死未轉化的藻細胞。選擇性培養液即為含有15 μ g πιΓ1草丁膦的f/2培養液。15d後，對照組細胞全部死亡，實驗組仍有活的藻細胞。將培養液以6000g離心5min，棄上清。收集到的藻體塗布到含有15ug mr1草丁膦的f/2固體培養平板上，使抗性的藻細胞分散生長，得到抗性單藻落。約培養20d後，平板上長出單藻落。再將單藻落挑出，並劃線到含有5yg πιΓ1草丁膦的f/2固體培養平板上，使抗性藻落進一步純化並增強抗性。20d後，挑取單藻落至f/2培養液中繼續培養約20d,6000g離心5min,收集藻體,每個藻體溼重> =IOOmg,然後置於液氮中冷凍備用。提取轉基因亞心型扁藻的基因組總DNA，用以進行分子鑑定。首先用PCR方法來鑑定質粒的整合情況。PCR中使用的上遊引物為5』 atpA for，下遊引物為3』 rbcL rev，產物為包括5』 atpA和3』 rbcL在內的bar基因表達盒。PCR反應程序為94°C IOmin預變性；94°C lmin, 55 °C 100sec,72°C llOsec，共 30 個循環；72°C IOmin 延伸。PCR 產物約為1700bp(參見圖5)。在一部分抗性亞心型扁藻基因組中擴增到了這個片段，在未轉化的亞心型扁藻中均未發現該片段。然後在SEQ ID NO :13』端附近和SEQ ID NO :25』端附近分別設計併合成引物，弓丨物序列如下con-16s for ACAAGCAACGGGCTATTA ；con-23s rev :TTTAGGCTGTTCCCATTT。這對引物con_16s for和con_23s rev在野生型亞心型扁藻基因組總DNA中擴增到包括trnl-trnA的片段，長度約為500bp ;在實現同質化的轉基因亞心型扁藻基因組總DNA 中，擴增到 trnI-5』 atpA-bar-3』 rbcL-trnA 的片段，長度約為 2000bp。以陽性轉基因藻的全基因組DNA為模板，以引物con_16s for和con-23s_rev進行 PCR 擴增。PCR 反應程序為-MV IOmin 預變性；94°C lmin,50°C 110sec，72°C 120sec,共30個循環；72°C IOmin延伸。PCR產物經電泳分離有兩條帶，一條約為2000bp，另一條約為500bp(參見圖6)。較長的條帶說明bar基因的通過同源重組插入到亞心型扁藻葉綠體基因組中，插入位點為片段SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2之間的間隔區位置。
PCR有陽性結果的轉基因亞心型扁藻樣品，要繼續進行Southern雜交鑑定。每個樣品的基因組總DNA至少4 μ g。Southern雜交探針是來源於地高辛標記的質粒pPSCB上bar基因內部的一段序列。雜交結果顯示，一部分草丁膦抗性藻株的基因組，雜交後出現了一條約550bp的條帶，與質粒酶切後的條帶大小一致，而未轉化的藻株的基因組中沒有這個條帶(參見圖7)，這表明在一些陽性藻株中，質粒pPSCB已經整合到葉綠體基因組中。上述所得亞心型扁藻葉綠體表達系統可用於構建微藻反應器，高效生產工業及醫藥用重組蛋白，例如酶、藥用蛋白及疫苗。由於亞心型扁藻是一種應用非常廣泛的餌料藻，也可以通過在葉綠體中高效表達抗菌藥 物或生長激素，並經口服飼喂，以實現新型漁藥的開發。另外，還可應用本系統對葉綠體編碼的內源基因進行定點修飾，從而調控光合固碳、以及油脂代謝的通路與終端產物，獲得表達新性狀的工程藻株。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於利用SEQ ID NO: I所示的序列、SEQ ID NO :2所示的序列和帶有選擇標記的外源基因構建的DNA重組片段，將其插入克隆載體並導入亞心型扁藻細胞，轉化後經培養篩選獲得轉基因亞心型扁藻。
2.按權利要求I所述的構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於所述利用SEQ ID NO 1所示的序列採用由SEQ ID NO 1所示的序列3』端開始，向5』端延伸至不小於Ikb的連續片段所代替。
3.按權利要求I所述的構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於所述利用SEQ ID NO 2所示的序列採用由SEQ ID NO 2所示的序列5』端開始，向3』端延伸至不小於Ikb的片段所代替。
4.按權利要求I或2或3所述的構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於所述帶有選擇標記的外源基因為具有葉綠體啟動功能的啟動子、終止子和選擇標記基因的DNA片段。
5.按權利要求I所述的構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於所述選擇標記基因為草丁膦抗性基因bar基因。
6.按權利要求I所述的構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法，其特徵在於轉化後的亞心型扁藻用除草劑草丁膦進行篩選。
全文摘要
本發明涉及生物基因工程技術領域，具體的說是一種構建亞心型扁藻葉綠體表達系統的方法。利用SEQ ID NO1所示的序列、SEQ ID NO2所示的序列和帶有選擇標記的外源基因構建的DNA重組片段，將其插入克隆載體並導入亞心型扁藻細胞，轉化後經培養篩選獲得轉基因亞心型扁藻。採用本發明的亞心型扁藻葉綠體穩定表達系統，可實現外源基因在亞心型扁藻葉綠體中的穩定和高效表達，並大量積累目的蛋白，對其藻種的品種改良以及基因工程產品開發都具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK102618566SQ20111003655
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月31日 優先權日2011年1月31日
發明者姜鵬, 崔玉琳, 李富超, 秦松, 陳華新 申請人:中國科學院海洋研究所