改良型腈水合酶的製作方法

2023-05-21 03:26:36 1

專利名稱：改良型腈水合酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有耐熱性提高或底物特異性改變的改良型腈水合酶活性的蛋白質； 編碼該蛋白質的基因DNA ;具有該基因DNA的重組載體；具有該重組載體的轉化體或轉導體；提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其製備方法；以及使用了該培養物或該處理物的醯胺化合物的製備方法。
背景技術：
近年來，人們發現了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，該酶可通過水合作用將腈基轉換為醯胺基，並且公開了利用該酶或具有該酶的微生物菌體以腈化合物製備對應的醯胺化合物的方法。與以往的化學合成方法相比，這種製備方法因具有高度的由腈化合物轉化成對應的醯胺化合物的轉化率和選擇率而為人所知。生產腈水合酶的微生物，可列舉例如屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色紅球菌 (Rhodococcus rhodochrous) J-I株已用於丙烯醯胺的工業生產,其有效性已被證實。另外， 編碼生產該菌株的腈水合酶的基因也已查明(請參考專利文獻I)。從降低反應時酶的用量和降低成本的觀點出發，期待能獲取耐熱性進一步提高的酶。另一方面，不僅是利用從自然界存在的微生物離析得到的腈水合酶或其基因，出於改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩定性、底物穩定性、產物穩定性等目的， 人們嘗試對腈水合酶引入突變。(參考專利文獻2和3)專利文獻I :特許第3162091號公報專利文獻2 :國際公開2004/056990號手冊(pamphlet)專利文獻3 :特開2004-222538號公報

發明內容
腈水合酶是已用於丙烯醯胺工業生產的酶，但獲取耐熱性等性質較目前所使用的酶進一步提高的酶可降低酶反應時的成本。因此，本發明的目的在於進一步改良腈水合酶，提供耐熱性更為提高的具有腈水合酶活性的蛋白質，編碼該蛋白質的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉化體或轉導體，提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其製備方法以及使用了該培養物或處理物的醯胺化合物的製備方法。
另外,玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶雖然已用於以丙烯腈為原料的丙烯醯胺的工業生產，但對於芳香腈反應活性低，在期待開發出對於芳香腈反應活性高的酶的同時，從降低催化劑成本的觀點出發，也期待開發出熱穩定、不易失活的酶。因此，本發明以改良腈水合酶獲得耐熱性提高的酶以及/或者獲得對芳香腈反應活性提高的酶為目的。本發明人為解決上述課題經過深入研究，發現在來源於玫瑰色紅球菌 (Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶的胺基酸序列中，通過將其中至少一個以上的胺基酸殘基用選自天然胺基酸組的殘基取代，該酶耐熱性得以提高以及/或者對芳香腈的反應活性得以提高，從而完成了本發明。即，本發明如下所述(I)以下(a)的蛋白質(a)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列上，第42位天冬醯胺殘基、第80位丙氨酸殘基、第118位丙氨酸殘基及第132位天冬氨酸殘基中至少有一個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列如SED ID Ν0:4所示；(2)以下(a)、(b)的蛋白質(a)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列上第167位天冬醯胺殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列上，第144位亮氨酸殘基或第219位纈氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列如SED ID Ν0:2所示；(b)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列上第167位天冬醯胺殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列以及野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列上第129位纈氨酸殘基或第196位亮氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列如SED ID NO :2所示，所述野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列如SED ID NO 4 所示；(3) 一種基因DNA，該基因DNA編碼如權利要求1_2中任一項所述的蛋白質。(4)以下(a)的基因 DNA (a)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因 DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列上，第124 126 位、第238 240位、第352 354位及第394 396位的鹼基中至少有一個被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列如SED ID NO 3所示；(5)以下(a)、(b)的基因 DNA (a)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因 DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列上第499 501位鹼基中至少有一個被其他不同的鹼基取代的鹼基序列上，第430 432位及第655 657 位的鹼基中至少有一個鹼基被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的喊基序列如SED ID NO I所不；
(b)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因 DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列上第499 501位鹼基以及編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列上第385 387位以及第586 588位的鹼基中至少有一個鹼基被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列如SED ID NO: I所示，所述編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的喊基序列如SED ID NO 3所不；(6) 一種重組載體,該重組載體含有如權利要求3-5中任一項所述的基因DNA。(7) 一種轉化體或轉導體，該轉化體或轉導體含有如權利要求6所述的重組載體。(8) 一種製備腈水合酶的方法，該方法培養如權利要求7所述的轉化體或轉導體， 從所得培養物提取腈水合酶。(9) 一種製備醯胺化合物的方法，該方法培養如權利要求7所述的轉化體，使所得的培養物或處理物與腈基化合物接觸，提取通過該接觸生成的醯胺化合物。本發明提供與野生型腈水合酶相比耐熱性提高以及/或者對於芳香腈反應活性提高的突變型腈水合酶以及編碼該酶的基因。本發明進一步提供具有上述突變型腈水合酶基因的重組DNA，具有該重組DNA的轉化(轉導)體，使用該轉化(轉導)體製備醯胺化合物的方法。通過本發明，可以高效製備丙烯醯胺。


圖I為質粒pJH601的組成圖。圖2為質粒p3R的組成圖。圖3為質粒pMH301的組成圖。圖4為質粒p52的組成圖。圖5A為質粒pCF002的組成圖。圖5B為質粒pFY529的組成圖。
具體實施例方式以下詳細說明本發明。本說明書中所引用的文獻、公開公報、國際公開公報等其他專利公報作為參照併入本說明書。本發明通過使野生型腈水合酶的胺基酸序列部分突變，提供與野生型腈水合酶相比耐熱性和/或底物特異性提高的改良型腈水合酶。「腈水合酶」是催化腈化合物轉化為對應醯胺化合物的水合反應 (RCN+H20 - RCONH2)的酶。另外，「腈水合酶」的結構是由α亞基與β亞基聚合形成的高級結構。「野生型腈水合酶」指具有來源於作為酶源的微生物的野生株(親株)的胺基酸序列的腈水合酶以及來源於野生株(親株)的基因序列編碼所得的腈水合酶。「野生型β亞基」或「野生型α亞基」指具有來源於野生株(親株)的胺基酸序列的β亞基或α亞基以及來源於野生株(親株)的基因序列編碼所得的β亞基或α亞基。「野生型腈水合酶」可列舉來源於各種微生物野生型的腈水合酶。微生物不僅限於具有編碼腈水合酶的基因的微生物。優選具有來源於紅球菌屬微生物的胺基酸序列的腈水合酶以及來源於紅球菌屬微生物的基因序列編碼所得的腈水合酶，所述紅球菌屬微生物例如可列舉玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I (FERM BP-1478)、玫瑰色紅球菌 (Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M3 3 (VKM Ac_1515D)或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特開平 2001-292772)等。或者是來源於史密氏桿菌(Bacillus smithii)(特開平09-248188)的腈水合酶亦可。特別優選的是具有來源於玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I 或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的胺基酸序列的腈水合酶以及來源於這兩株的基因序列編碼所得的腈水合酶。另外，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac-1515D)菌是由M8 (SU1731814)菌通過自然突變產生的作為腈水合酶表達株而被篩選出的菌株。該菌株的腈水合酶本身的胺基酸序列和基因序列沒有突變(美國專利第 5827699 號)。在此，耐熱性提高指來源於突變株的加熱處理後的酶的殘留活性比來源於親株的經相同處理的酶的殘留活性高10%以上。「殘留活性」指用經加熱處理後的菌體進行活性測定時醯胺化合物的生成量與用等量未經處理的菌體進行活性測定時醯胺化合物的生成量的比值。作為加熱處理方法可將培養液和收集、洗淨的培養菌體置於容器中，將此容器置於水浴或培養箱等加熱裝置中保溫一定時間即可。此時，為提高酶穩定性也可添加腈化合物或醯胺化合物後進行加熱處理。加熱處理的條件應適當研究處理溫度與處理時間，優選設定使親株活性降低至50%以下的條件。具體而言指在50°C至70°C的範圍內進行5分鐘至30分鐘的處理。未處理菌體使用4°C下冷藏的培養液和收集、洗淨的培養菌體。活性測定使用加熱處理或未處理的菌體，使底物腈化合物與該菌體接觸，轉化為對應的醯胺化合物後定量該醯胺化合物。底物可使用可與腈水合酶發生反應的任何腈化合物，優選丙烯腈。 反應條件例如在底物濃度為2. 5%、反應溫度為10°C至30°C、反應時間為10分鐘至30分鐘的範圍內進行。添加磷酸使酶反應終止，利用HPLC和氣相色譜分析生成的丙烯醯胺。本發明的改良型腈水合酶，例如，可通過改變來源於玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶的胺基酸序列，篩選與親株腈水合酶活性相比耐熱性提高的改良型腈水合酶而得到。上述改變方法可以採用使羥胺或亞硝酸等作為變異源的藥物與Jl菌接觸或作用的方法、紫外線照射突變誘導法、在編碼來源於Jl菌的腈水合酶的基因 (以下稱為腈水合酶基因)中用PCR引入隨機突變的方法等。本發明中，發現了野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列(例如序列編號2)中第167位天冬醯胺被絲氨酸取代的改良型腈水合酶。本發明不僅篩選出上述這種改良型腈水合酶，還篩選出耐熱性進一步提高的改良型腈水合酶。該篩選方法是通過篩選符合上述 「耐熱性」定義的突變體(突變基因)進行的。由此得到的酶，是具有下述胺基酸序列的蛋白質，所述胺基酸序列指腈水合酶的 β亞基的胺基酸序列(例如序列編號2)上，第24位苯丙氨酸殘基、第88位異亮氨酸殘基、 第92位穀氨酸殘基、第93位穀氨酸殘基、第96位組氨酸殘基、第103位穀氨酸殘基、第167 位天冬醯胺殘基及第225位酪氨酸殘基中至少有一個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列。還包括具有下述胺基酸序列的蛋白質，所述胺基酸序列指腈水合酶的α亞基的胺基酸序列(例如序列編號4)上，第42位天冬醯胺殘基、第80位丙氨酸殘基、第118位丙氨酸殘基及第132位天冬氨酸殘基中至少有一個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列。本發明進一步包括具有下述胺基酸序列並且具有腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列(序列編號2)上第167位天冬醯胺殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列中，β亞基的胺基酸序列的第144位亮氨酸殘基、 第219位纈氨酸殘基以及α亞基的胺基酸序列(序列編號4)上第129位纈氨酸殘基及第 196位亮氨酸殘基中至少有一個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列。上述的複合突變體可通過任意方法製備，例如，可通過一條合成的核苷酸鏈進行特定位置的取代的方法或將多個含有不同單突變的DNA片斷利用限制性內切酶切割再重新連接的方法製備。只要不破壞耐熱性，允許在上述突變基礎上出現I個或多個(例如I個或者數個) 胺基酸的取代、缺失以及/或者增加。例如，野生型腈水合酶β亞基的胺基酸序列(例如序列編號2)中或野生型腈水合酶α亞基的胺基酸序列(例如序列編號4)中的I 2個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代是允許的，或者，編碼野生型腈水合酶β亞基的基因(例如序列編號3)或編碼野生型腈水合酶α亞基的基因(例如序列編號3)所示的鹼基序列編碼所得的胺基酸序列中I 2個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代也是允許的。以下，說明優選的胺基酸突變形態。本發明中，為敘述方便，可以使用胺基酸的單字母字符號及α或β亞基的胺基酸序列的胺基酸編號說明突變的形態。例如，F0 24L這一標記表示β亞基(例如序列編號2)的胺基酸序列中的第24位胺基酸由苯丙氨酸被取代為亮氨酸。又如，N0 167S這一標記表示β亞基(例如序列編號2)的胺基酸序列中的第167位胺基酸由天冬醯胺被取代為色氨酸。〈突變與取代的形態(I)>此形態為使腈水合酶的α或β亞基的至少一個的胺基酸殘基突變。單突變1.F3 24L2. I β 88F3. Εβ 92Κ4. Εβ 93G5. Ηβ 96R6. Εβ 103D7. Νβ 167S8. Υβ 225Η9. Na 42D10. A a 80Τll.Aa 118V12. Da 132Ν複合突變I. Εβ 93G, Εβ 103Dz 264位的鹼基序列『 TTC)。
,276位的鹼基序列『 AAA)。
,279位的鹼基序列『
ATC」被取
GAA 」被取
GAG」被取2· Εβ 93G，Da 132N3. Ηβ 96R, Na 42D4. Εβ 92Κ, A a 80T產生上述的胺基酸取代時的鹼基取代如下所述。應予說明，編碼β亞基、a亞基的基因DNA，分別以序列編號I、序列編號3所示的序列為例予以說明。單突變I :序列編號I中，第70 72位的鹼基序列「TTC」被取代為CTT、CTC、CTA 或CTG。特別優選第70位的T被取代為C (TTC — CTC)。單突變2 :序列編號I所示的鹼基序列中，第262 代為TTT或TTC。特別優選第262位的A被取代為T (ATC ■單突變3 :序列編號I所示的鹼基序列中，第274 代為AAA或AAG。特別優選第274位的G被取代為A (GAA ■單突變4 :序列編號I所示的鹼基序列中，第277 代為GGG、GGC、GGA或GGT。特別優選第278位的A被取代為G (GAG — GGG)。單突變5 :序列編號I所示的鹼基序列中，第286 288位的鹼基序列「CAC」被取代為CGC、CGG、CGA或CGT。特別優選第287位的A被取代為G (CAC — CGC)。單突變6 :序列編號I所示的鹼基序列中，第307 309位的鹼基序列「GAG」被取代為GAC或GAT。特別優選第309位的G被取代為T (GAG —單突變7 :序列編號I所示的鹼基序列中，第499
代為AGC或AGT。特別優選第500位的被A取代為G (AAC —單突變8 :序列編號I所示的鹼基序列中，第673
代為CAC或CAT。特別優選第673位的T被取代為C (TAC —單突變9 :序列編號3所示的鹼基序列中，第124
代為GAC或GAT。特別優選第124位的A被取代為G (AAC —單突變10 :序列編號3所示的鹼基序列中，第238 取代為ACC、ACG、ACA或ACT。特別優選第238位的G被取代為A (GCC — ACC)。單突變11 :序列編號3所示的鹼基序列中，第352 354位的鹼基序列「GCC」被取代為GTC、GTG、GTA或GTT。特別優選第353位的C被取代為T (GCC — GTC)。單突變12 :序列編號3所示的鹼基序列中，第394 396位的鹼基序列「GAC」被取代為AAC或AAT。特別優選第394位的G被取代為A (GAC — AAC)。複合變異I 4的鹼基序列的取代與單變異的取代相同。此形態為使腈水合酶的β亞基的胺基酸序列至少2處發生突變或者β亞基的胺基酸序列至少I處並且a亞基的胺基酸序列至少I處發生突變。I. Νβ 167S, 144Η2. Νβ 167S, νβ 219Α3. Νβ 167S, Va 129Α4· Νβ 167S，144Η，νβ 219Α5· N β 167S, L β 144Η, V β 219Α, V a 129Α, L a 196Ρ產生上述的胺基酸取代時的鹼基取代如下所述
GAT)。
,501位的鹼基序列 AGC)。
'675位的鹼基序列 CAC)。
,126位的鹼基序列 GAC)。
240位的鹼基序列
AAC 」被取
TAC 」被取
AAC 」被取
iGCd
N β 167S :序列編號I所示的鹼基序列中，第499 501位的鹼基序列「AAC」被取代為AGC或AGT。特別優選第500位的A被取代為G (AAC — AGC)。L β 144Η :序列編號I所示的鹼基序列中，第430 432位的鹼基序列「CTC」被取代為CAC或CAT。特別優選第431位的T被取代為A (CTC — CAC)。νβ 219A :序列編號I所示的鹼基序列中，第655 657位的鹼基序列「GTC」被取代為GCT、GCC、GCA或GCG。特別優選第656位的T被取代為C (GTC — GCC)。V α 129Α :序列編號3所示的鹼基序列中，第385 387位的鹼基序列「GTG」被取代為GCT、GCC、GCA或GCG。特別優選第386位的T被取代為C (GTG — GCG)。L α 196Ρ :序列編號3所示的鹼基序列中，第586 588位的鹼基序列「CTC」被取代為CCT、CCC、CCA或CCG。特別優選第587位的T被取代為C (CTC — CCC)。〈突變與取代的形態(3)>此變異形態是腈水合酶的β亞基的胺基酸序列中至少第26位或第48位胺基酸殘基被其他胺基酸取代。S卩，本發明提供對於芳香腈反應活性提高以及/或者耐熱性提高的腈水合酶。「腈水合酶」是催化腈化合物轉化為對應醯胺化合物的水合反應(RCN+2H20 — RCONH2)的酶。在此，「對於芳香腈反應活性提高的腈水合酶」是指對3-氰基吡啶的比活性提高
I.5倍以上的酶。篩選方法為篩選符合上述「突變」定義的突變體(突變基因)。通過上述方法得到的對於芳香腈反應活性提高的酶是具有下述胺基酸序列的蛋白質，所述胺基酸序列為序列編號2 ( β亞基)的胺基酸序列上，第48位色氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列。耐熱性提高的酶是具有下述胺基酸序列的蛋白質，所述胺基酸序列為序列編號 2 ( β亞基)的胺基酸序列上，第26位組氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列。序列編號2所示的胺基酸序列(野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列)的第 48位色氨酸被精氨酸取代時，不僅具有使腈水合酶耐熱性提高的效果，在對丙烯腈(短鏈脂肪族腈)具有底物特異性的基礎上，還使腈水合酶對3-氰基吡啶(芳香腈)的反應活性提聞。以下說明優選的胺基酸突變形態。例如，Wi3 48R這一標記表示β亞基(序列編號I)的第48位胺基酸殘基由色氨酸被取代為組氨酸。(I)對於芳香腈反應活性提高的突變W β 48R(2)耐熱性提高的突變Ηβ 26R(3)複合突變48R, Ηβ 26R產生上述的胺基酸取代時的鹼基取代如下所述。ff^48R :序列編號I中，第142 144位的鹼基序列「TGG」被取代為CGT、CGC、CGA、 CGG、AGA或AGG。特別優選第142位的T被取代為C (TGG — CGG)。H β 26R :序列編號I中，第76 78位的鹼基序列「CAC」被取代為CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特別優選第77位的A被取代為G (CAC — CGC)。〈複合突變〉進一步，通過將上述〈突變與取代的形態 > 中(I) (3)中所記載的多個突變組合起來製備複合突變體的方法，可以製得同時具備兩種性質的突變酶。複合突變體可通過任意方法製備，例如，可通過一條合成的核苷酸鏈進行特定位置的取代的方法或將多個分別含有單個突變的DNA片斷利用限制性內切酶切割再重新連接的方法獲得。只要不破壞突變的性質，允許在上述突變基礎上出現胺基酸序列的缺失、被取代、 增加等。例如，在上述已實施突變的胺基酸序列上，允許缺失I個或多個(例如I 10個， 優選I 5個)胺基酸殘基，允許增加I個或多個(例如I 10個，優選I 5個)胺基酸殘基，或者，允許I個或多個(如I 10個，優選I 5個)胺基酸殘基被其他胺基酸殘基所取代。〈引入突變的方法〉上述的引入單個突變或複合突變的腈水合酶基因的製備方法，通過Kunkel 法及Gapped duplex法等公知的方法實現，例如使用具有定點突變功能的試劑盒，如 QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司生產)、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司生產)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等寶生物工程公司生產)來實現突變的引入[Nucleic. Acid. Res. 10,6487 (1982) ；Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。在Jl以外菌株的腈水合酶中，通過上述的突變位點、突變的胺基酸種類、DNA序列也可引起耐熱性的提高。這些菌株包括上述的玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC39484(特開平 2001-292772)、史密氏桿菌 (Bacillus smithii)(特開平 09-248188)等。進一步，本發明的基因DNA還包括上述序列編號I或3所示的鹼基序列中引入突變所得的鹼基序列的互補鹼基序列所得的DNA和嚴謹條件下可雜交的DNA。嚴格條件指 例如鹽(鈉)濃度150 900mM，溫度55 75°C，優選鹽(鈉)濃度250 450mM，溫度在 68。。。〈醯胺化合物耐受性〉本發明的改良型腈水合酶還具有醯胺化合物耐受性的性質。在此，醯胺化合物耐受性指與其他來源於野生株的腈水合酶相比，可以在醯胺化合物存在下保持腈水合酶活性。本發明的突變型腈水合酶所耐受的醯胺化合物並無特別限制，可列舉例如用以下化學式所表示的化合物R-C0NH2(在此，R為取代或未被取代的烷基、取代或未被取代的烯基、取代或未被取代的環烷基、取代或未被取代的芳香基或者取代或未被取代飽和或不飽和雜環基)等。特別的， 優選式中R為CH2 = CH的丙烯醯胺。醯胺化合物耐受性，例如，可通過以下方法來評價，即在丙烯醯胺等醯胺化合物(例如30 50%等高濃度)存在下，分析具有本發明改良型腈水合酶的轉化體的培養物或從轉化體中分離的腈水合酶對丙烯腈等腈化合物底物的消耗量或消耗速度。與來源於母體株的腈水合酶相比，例如，當消耗量或消耗速度超過I. I倍時，可評價為具有醯胺化合物耐受性。以下說明具有上述腈水合酶基因的載體和轉化(轉導)體的製備方法。為使腈水合酶基因能夠在被轉化或轉導的宿主生物中表達，須將其重組入載體。例如，作為載體可列舉質粒DNA、噬菌體DNA、反轉座子DNA、人工染色體DNA等。作為宿主，可使用大腸桿菌、枯草桿菌等細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。大腸桿菌作為宿主時，優選使用表達效率高的表達載體，例如具有trc啟動子的表達載體pKK233-2(安瑪西亞生物科技公司生產)或pTrc99A (安瑪西亞生物科技公司生
廣)等。載體中除腈水合酶基因外還可連接啟動子、終止子、增強子、拼接信號、polyA插入信號、篩選標記、核糖體結合序列(SD序列)等。另外，作為篩選標記可列舉例如卡那黴素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因、氨苄西林抗性基因、新黴素抗性基因等。以下，說明宿主的種類以及重組載體轉化宿主的方法。細菌作宿主時，大腸桿菌可列舉例如大腸桿菌(Escherichia coli)等，紅球菌(Rhodococcus)可列舉例如玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC12674、 玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC17895、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC19140等。這些ATCC菌株從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)得到。重組載體轉化細菌的方法並無特別限制，只要是將DNA導入細菌的方法即可，可使用例如鈣離子法、電穿孔法等。酵母作宿主時,可使用例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等。重組載體轉化酵母的方法並無特別限制，只要是將DNA導入酵母的方法即可，可使用例如電穿孔法、原生質球轉染法、醋酸鋰法等。動物細胞作宿主時可使用綠猴C0S-7細胞、Vero, CHO細胞、小鼠L細胞、大鼠GH3 細胞、人FL細胞等。重組載體轉化動物細胞的方法可使用例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質轉染法等。昆蟲細胞作宿主時可使用Sf9細胞、Sf21細胞等。重組載體轉化昆蟲細胞的方法可使用例如磷酸鈣法、脂質轉染法、電穿孔法等。植物細胞作宿主時可列舉菸草BY-2細胞等，但並不僅限於此。重組載體轉化植物細胞的方法可使用例如農桿菌介導法、粒子槍法、PEG法、電穿孔法等。〈腈水合酶的製備〉下面說明腈水合酶及其製備方法。本發明的腈水合酶可通過培養以上述方法製備的具有腈水合酶基因的轉化(轉導)體，從其培養物提取而得到。10/32 頁在此，培養物任指培養上清、培養細胞或培養菌體和細胞或菌體的破碎物。培養本發明的轉化(轉導)體的方法，可使用以下例舉的宿主依常法進行。培養以大腸桿菌、酵母菌等微生物為宿主的轉化體的培養基含有可以資化微生物的碳源、氮源、無機鹽類等，只要其可直效培養轉化體，可使用任意天然培養基、合成培養基。作為碳源，可列舉葡萄糖、果糖、蔗糖、澱粉等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，除可用氨水、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸銨鹽或其他含氮化合物外還可列舉蛋白腖、肉糜、玉米漿等。作為無機物，可列舉磷酸氫亞鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養通常在振蕩培養或通氣攪拌培養等需氧條件下、30-40°C下進行。pH的調整使用無機或有機酸、鹼溶液等。培養中根據需要可在培養基中添加氨苄西林或四環素等抗生素。培養基中也可添加腈水合酶的補缺金屬即鈷離子或鐵離子，還可添加腈類或醯胺類作為酶誘導劑。以誘導性啟動子作啟動子，用表達載體培養轉化的微生物時，可根據需要在培養基中添加誘導物。例如，培養用具有可被異丙基_β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的啟動子的表達載體轉化的微生物時，可在培養基中添加IPTG。又如，培養用具有可被吲哚乙酸 (IAA)誘導的trp啟動子的表達載體轉化的微生物時，可在培養基中添加IAA。培養以動物細胞作宿主等到的轉化體所用的培養基，可列舉常用的RPMI1640培養基、DMEM培養基或在這些培養基中添加胎牛血清的培養基等。培養通常在5% CO2下， 37°C培養I 30天。培養中可根據需要在培養基中添加卡那黴素、青黴素等抗生素。從培養基中提取腈水合酶的方法可通過反覆超聲波處理、冷凍溶解後勻漿處理， 將菌體或細胞破碎從而提取目標蛋白質。轉化體為植物細胞或植物組織時，培養可使用常用的植物培養用培養基，例如MS 基礎培養基、LS基礎培養基進行。培養方法可採用任意常用的固體培養法或液體培養法。從培養物中提取腈水合酶的方法是，首先，通過以纖維素酶、蛋白酶等酶進行的細胞溶解處理、超聲破碎處理、磨碎處理等破壞細胞。然後，過濾或離心除去不溶物，得到粗蛋白質溶液。從上述粗溶液純化本發明的蛋白質，通過單獨或適當結合使用鹽析、各種色譜 (例如凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜)、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳等方法進行。另外，在菌體外或細胞外生產本發明的蛋白質時，使用培養液本身或通過離心除去菌體或細胞。然後，通過單獨或適當結合使用常用的蛋白質分離純化生物化學方法，例如硫酸銨沉澱、凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜等，可從上述培養物中分離純化本發明的蛋白質。另外，本發明中，也可以利用編碼本發明的腈水合酶的基因DNA或上述載體，通過完全不使用生物細胞的無細胞蛋白質合成體系合成並提取目標蛋白質。無細胞蛋白質合成體系是使用細胞提取液在試管等人工容器內合成蛋白質的體系，例如讀取mRNA的信息，在核糖體上合成蛋白質的體系。應予說明，本發明所使用無細胞蛋白質合成體系也包含以DNA為模版合成RNA的無細胞轉錄體系。上述細胞提取液，可使用來源於真核細胞或來源於原核細胞的提取液，例如，小麥胚芽、兔網狀紅血球、小鼠L-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸桿菌等的萃取液。 應予說明，這些提取液可以經過濃縮或不經濃縮。
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在此,DNA上密碼化的遺傳信息通過轉錄轉化為mRNA,進而翻譯轉化為蛋白質。為在人工容器內再現這一過程合成蛋白質，需要核糖體、tRNA、各種蛋白質因子等，還需要構建可穩定翻譯酶系並根據目的生產mRNA的系統。細胞提取液，例如可通過超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉澱等得到。本發明的無細胞蛋白質合成也可使用市售試劑盒進行。所述試劑盒可列舉例如 PROTEI OS (東洋紡織)，TNT System (Promega普洛麥格)、PG-Mate 合成裝置(東洋紡織)、RTS(Roche Diagnostics 羅氏診斷)等。通過無細胞蛋白質合成得到的突變型腈水合酶可以選擇適當的色譜純化。另外， 突變型腈水合酶的純化可用SDS-PAGE等確認，活性測定可以通過測定腈化合物轉化為醯胺化合物的轉化率來進行。下面，說明利用轉化(轉導)體製備醯胺化合物的方法。上述培養法得到的培養物、酶等作為將腈化合物轉化為對應醯胺化合物時的生物催化劑所使用。作為轉換反應的底物使用的腈化合物，可根據生物催化劑的底物特異性適當選擇。例如，來源於玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株的腈水合酶適合的底物為丙烯腈。生物催化劑的使用形態、反應方式可根據生物催化劑的種類適當選擇。例如，作為生物催化劑的使用形態，既可以使用上述培養物、純化酶本身，也可以將它們固定於合適的載體上作為固定酶使用。實施例下面通過實施例對本發明進行更加詳細地說明，但本發明並不限於以下實施例。 另外應予說明，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-I株，以FERM BP-1478為編號保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東I丁目I番地-I中央第6)(原保藏日1987年9月18日)。[實施例I]改良型腈水合酶基因的獲得(I)(I)染色體DNA的製備玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous) J-I 株接種於 100ml MYK 培養基 (0. 5%多聚蛋白腖、0. 3%酵母提取物、0. 3%麥芽提取物、I %葡萄糖、0. 2% K2HPO4^O. 2% KH2PO4, pH7. 0)中，30°C振蕩培養72小時。培養後，收集菌體，將收集的菌體懸浮於4ml Saline-EDTA溶液(0. IM EDTA、0. 15M NaCl (pH8. O))中。混懸液中加入8mg溶菌酶，在37°C下振蕩I 2小時後，在_20°C下冷凍。接著，邊平穩振蕩邊加入IOml的Tris-SDS溶液(I % SDS、0. IM NaCUO. IM Tris-HCl (pH9. 0))，之後再加入蛋白酶K (Merck公司)(最終濃度0. lmg)，37°C振蕩I小時。接著，加入等量的用TE飽和的苯酚溶液並攪拌(TE 10mM Tris-HClUmM EDTA (pH8. 0))，離心，取上層溶液，加入2倍量的乙醇後，用玻璃棒卷取DNA。以90 %、80 %、 70%的乙醇依次脫除苯酚。接著，將DNA溶解於3ml的TE緩衝液中，加入核糖核酸酶A溶液(已經100°C 15 分鐘加熱處理)至最終濃度10 μ g/ml，並在37°C下振蕩30分鐘。然後，加入蛋白酶K，在37°C下振蕩30分鐘後，加入等量的用TE飽和的苯酚溶液，離心使上層溶液與下層溶液分離。同樣的操作對上層溶液重複兩次之後，加入等量的氯仿(含4%異戊醇)，重複同樣的提取操作(以下該操作稱為苯酚處理)。之後取上層溶液加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取回收DNA，得到染色體DNA樣品。(2)質粒的構建首先，為了用作耐熱性評價的對照，利用通常的PCR方法對野生型的腈水合酶基因進行擴增。PCR反應以下面記載的反應液組成、反應條件進行。應予說明，引物JH1_02(序列編號5)及引物NH_17(序列編號6)各自的序列上已預先引入了限制性內切酶NcoI和限制性內切酶Hindi 11的識別位點，擴增的DNA產物在兩種限制性內切酶的切割下，可輕鬆地插入後述表達載體pTrc99A的NcoI部位-HindIII部位之間。
權利要求
1.以下(a)的蛋白質(a)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列上，第42位天冬醯胺殘基、第80位丙氨酸殘基、 第118位丙氨酸殘基及第132位天冬氨酸殘基中至少有一個胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列如SED ID Ν0:4所示。
2.以下(a)、(b)的蛋白質(a)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列上第167位天冬醯胺殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列上，第144位亮氨酸殘基或第219位纈氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列如SED ID Ν0:2所示；(b)由下述胺基酸序列組成並且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述胺基酸序列指野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列上第167位天冬醯胺殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列以及野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列上第129位纈氨酸殘基或第 196位亮氨酸殘基被其他胺基酸殘基取代的胺基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亞基的胺基酸序列如SED ID NO :2所示，所述野生型腈水合酶的α亞基的胺基酸序列如SED ID NO 4所示。
3.一種基因DNA，該基因DNA編碼如權利要求1_2中任一項所述的蛋白質。
4.以下(a)的基因DNA(a)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列上，第124 126位、第 238 240位、第352 354位及第394 396位的鹼基中至少有一個被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列如SED ID Ν0:3所示。
5.以下(a)、(b)的基因DNA(a)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列上第499 501位鹼基中至少有一個被其他不同的鹼基取代的鹼基序列上，第430 432位及第655 657位的鹼基中至少有一個鹼基被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的喊基序列如SED ID NO I所不；(b)由下述鹼基序列組成並且編碼具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質的基因DNA，所述鹼基序列指編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列上第499 501位鹼基以及編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的鹼基序列上第385 387位以及第586 588 位的鹼基中至少有一個鹼基被其他不同的鹼基取代的鹼基序列，所述編碼野生型腈水合酶的β亞基的基因的鹼基序列如SED ID NO :1所示，所述編碼野生型腈水合酶的α亞基的基因的喊基序列如SED ID NO 3所不。
6.一種重組載體，該重組載體含有如權利要求3-5中任一項所述的基因DNA。
7.一種轉化體或轉導體，該轉化體或轉導體含有如權利要求6所述的重組載體。
8.一種製備腈水合酶的方法，該方法培養如權利要求7所述的轉化體或轉導體，從所得培養物提取腈水合酶。
9.一種製備醯胺化合物的方法，該方法培養如權利要求7所述的轉化體，使所得的培養物或處理物與腈基化合物接觸，提取通過該接觸生成的醯胺化合物。
全文摘要
本發明提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白質，該蛋白質通過改變腈水合酶的胺基酸序列得到，與野生型腈水合酶活性相比耐熱性提高；本發明還提供編碼該蛋白質的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉化體或轉導體，提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其製備方法，以及醯胺化合物的製備方法。
文檔編號C12N1/15GK102604921SQ201210081580
公開日2012年7月25日 申請日期2005年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者中村哲二, 氏原大, 湯不二夫, 渡邊文昭, 酒井美紀 申請人:三菱麗陽株式會社