一種大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒及其應用的製作方法

2023-05-21 11:04:56

專利名稱：一種大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業育種領域，尤其涉及一種大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒及其應用。
背景技術：
大蔥(Alliumfistulosum L. var. giganteum Makino),植物學分類屬於百合科(Liliaceae)、蔥屬(Allium)、蔥種(f istulosum)中的一個變種(var. giganteum Makino)。以葉鞘抱合而成的肥大假莖(蔥白)為主要產品，因在蔥中植株高大而得名。大蔥在蔥蒜類蔬菜中佔有非常重要的位置，是中國人日常生活中不可缺少的重要蔬菜作物之一。在中國普遍栽培，全國常年栽培大蔥約計50多萬hm2，年產大蔥1760多萬 t。大蔥主要分布在中國的秦嶺-淮河以北地區。其中，山東、河南、河北、遼寧等省份栽培較為集中，單產水平也較高。大蔥營養成分豐富，據測定每百克大蔥含蛋白質I 2. 4g，脂肪O. 3g，碳水化合物
6 8. 6g,熱量32千卡，粗纖維O. 5g, I丐12mg,磷46mg,鐵O. 6mg,胡蘿蔔素I. 2mg,硫胺素O. 08mg,核黃素O. 05mg,尼克酸O. 5mg,抗壞血酸14mg,所含胡蘿蔔素高於瓜菜類和豆菜類蔬菜。另外，大蔥還含有揮發性的硫化丙烯等芳香物質，既可作為蔬菜和調味品，也具有良好的藥用效果。大蔥的管狀葉和假莖(蔥白)均可食用，生食或熟食皆宜。大蔥是非常重要的香辛類蔬菜，其味辛，性溫，食用可開胃消食、殺菌防病等。據明代李時珍《本草綱目》記載，蔥之莖白、根須、葉、汁、花均可入藥，對大蔥不同部位的性質和治病作用已進行了詳細闡述，記有54個藥方，可治10餘種疾病。主治傷寒寒熱，除肝邪氣，治霍亂轉筋，利大小便，解耳鳴。現代醫學認為大蔥具有刺激血液循環等功效。對痢疾桿菌、葡萄球菌等有殺滅作用。因為大蔥生長周期較長，開花期較短，單果結籽數較少，自交衰退較明顯等特點，所以開展大蔥育種難度較大，從而限制了大蔥育種研究工作的開展，國內外從事大蔥育種研究的人員較少，因此，大蔥育種研究相對滯後。長期以來，我國大蔥育種一直以選種為主，各地栽培的大蔥名產品種和推廣的新品種，主要是採用選種方法育成。自上世紀70年代日本和我國才陸續開展了大蔥雄性不育系及其利用研究，開始了大蔥一代雜種選育，但是，一代雜種選育進展緩慢，至今在生產上沒有得到較大面積推廣。山東農業大學、山東省農業科學院蔬菜研究所、章丘市農業局、遼寧省農科院園藝系等單位，利用自然群體中的不育株，通過4-5代回交，先後育成大蔥雄性不育系和相應保持系。陳立東、王景峰等育成了超早熟大蔥雄性不育系603A、626A ;張啟沛、魏佑營等育成了大蔥不育系4A、5A、225A、237A ;佟成富、唐成英等育成了大蔥不育系244A[佟成富，唐成英，崔連偉.大蔥雄性不育系244A及其雜交種遼蔥二號(9746F1)的選育及利用.全國蔬菜遺傳育種學術討論會論文集，2002. 301-307];陳運起、高莉敏等育成了大蔥雄性不育系9801A、9802A 等。
為加快大蔥雄性不育系選育進程，蓋樹鵬、孟祥棟等(2004)利用RAPD標記和SCAR標記初步建立了大蔥不育系、保持系分子標記輔助選擇的技術體系[蓋樹鵬，孟祥棟等.大蔥雄性不育分子標記輔助選擇的研究.分子植物育種，2004，2 (2) :223-228]。可以減少工作量，縮短部分大蔥品種的育種年限，但是不能在廣泛的育種材料中實現苗期選擇。加強生物技術與常規育種的結合生物技術的發展給園藝植物遺傳育種帶來了巨大的變化，分子標記技術已成為育種研究的重要組成部分。但是，要使分子標記成為育種的一種常規手段，尚有許多問題有待解決。如重要性狀基因的精細定位，檢測過程的自動化，飽和遺傳圖譜的構建等。生物技術與常規育種相結合，將有力的推動大蔥遺傳育種學的發展。加快雄性不育系與一代雜種選育優良雄性不育系選育是選育一代雜種、利用雜種優勢的重要前提，從大蔥制種田發現不育株後，通過回交或體細胞雜交、細胞器轉移、細胞質基因工程等技術轉育成更多的優良雄性不育系，進而培育出優勢明顯的一代雜種。隨著 大蔥育種研究的不斷深入，大蔥一代雜種選育與利用將進一步加快，大蔥一代雜種的推廣覆蓋率將迅速提高。日本的馬上武彥等(1985)，用大蔥雄性不育材料連續三次回交與7個品種雜交，觀察植株花粉和種子的育性，判定大蔥雄性不育的遺傳模式，研究結果認為大蔥雄性不育是受胞質與核基因互作控制，雄性不育與保持系分別由兩對基因S(mSlmSlmS2mS2)和N(mslmslms2ms2)支配,雄性不育性可用於大蔥雜交育種。近年來，分子生物學的發展為植物遺傳標記提供了一種基於DNA變異的新技術手段，即分子標記技術。DNA分子標記研究與應用的迅速發展為植物遺傳育種注入新的活力，並使傳統育種技術發生了深刻的變化。DNA分子標記的研究始於1980年，現已有數十種標記技術。與傳統的遺傳標記相比，DNA分子標記有很多優點。以PCR為基礎的DNA指紋技術大大加快了 DNA分子標記的研究和利用，廣泛應用於植物遺傳育種、高密度遺傳圖譜的構建、基因定位和克隆、植物親緣關係鑑別及遺傳多樣性研究、分子標記輔助選擇育種等領域。植物育種中分子標記輔助選擇是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記來判斷目標基因是否存在的。通過不同分子標記技術的分析可篩選出與目標基因性狀緊密連鎖的DNA片段，這樣可以作為輔助育種的分子標記。應用這些分子標記進行間接選擇，將得到事半功倍的作用，因為分子標記輔助選擇不受植物生長發育的時期及環境的影響，不存在表達與否的問題。無論是與細胞質位點還是與核基因連鎖的標記的輔助選擇都可減少工作量，提高育種效率。利用與細胞質位點連鎖的標記可鑑別出單株的細胞質類型，淘汰可育材料中S型細胞質，只能從N型細胞質類型的單株中選擇保持系，從而減少測交組合數和自交株數，減少工作量，避免盲目性，提高選擇效果。原有報導的通過提取大蔥線粒體DNA進行PCR擴增，得到2800bp片段的分子標記不能在廣泛的大蔥材料中應用，應用範圍較窄。

發明內容
本發明涉及一種大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒及其應用。為了實現本發明的目的，擬採用如下技術方案本發明一方面涉及一種用於大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒，其特徵在於包括如下的SCAR (Sequence-characterized Amplified Region序列特異性擴增區)標記引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。在本發明的一個優選實施方式中，所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑。在本發明的另一個 優選實施方式中，所述的試劑盒包括PCR擴增所需要的試劑。在本發明的另一個優選實施方式中，所述的試劑盒包括對擴增產物進行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。本發明另一方面還涉及上述試劑盒在大蔥分子標記輔助選擇育種中的應用。在本發明的一個優選實施方式中，所述應用包括用CTAB法提取大蔥總DNA，然後使用所述的SCAR標記引物對所提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行凝膠電泳以確定擴增產物的片段長度，根據檢測結果判斷所檢測的植株是否是細胞質不育類型。本發明的試劑盒可以廣泛應用於我國遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細胞質的育性鑑定。本發明通過提取大蔥總DNA即可，避免了提取線粒體DNA的複雜操作，使操作過程更簡單有效。分子標記輔助選擇操作簡單，節約成本和時間，為大蔥分子標記輔助選擇育種體系奠定了基礎。
具體實施例方式實施例I合成大蔥細胞質雄性不育SCAR標記的引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。選擇已知基因型的個體材料共220份，對大蔥DNA提取採用北京天根生產的植物基因組CTAB法提取試劑盒(也可以使用其它常規的CTAB法提取試劑盒進行提取)以及試劑盒中所述方法進行提取；PCR擴增在美國伯樂TC-XP-D型基因擴增儀上進行，20 μ L體系，其中 2x Taq MasterMixlO μ L, Primerl、2 (10umol/L)各 I. O μ L，樣品 DNAl μ L，反應程序為94°C預變性2min，94°C變性30sec，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸5min，4°C保存；PCR產物在I. 2 %瓊脂糖凝膠進行電泳分離分析，溴化乙啶染色，凝膠成像系統自動成像；特異條帶回收純化，按照Gel Extract ion Kit使用說明；連接、轉化、鑑定按照PGM-T克隆試劑盒說明；DNA序列測定委託北京博尚生物技術有限公司完成。對已知育性的220份材料進行PCR驗證(見表I)，按照本發明實施例中的方法，所有的不育系中均擴增出大小為607bp的片段，而保持系中沒有擴增產物，PCR結果與田間判斷相吻合。說明應用這對引物完全可以鑑別大蔥細胞質雄性不育類型，據此得知擴增出的607bp片段與雄性不育有一定的聯繫。對以上大蔥細胞質雄性不育系980238A、200501A中擴增出的特異片段經過回收、轉化、克隆和測序，得到的結果一致，序列全長607bp，核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，兩端含有引物序列，其鹼基組成為A+T = 55%,C+G = 45%。表I大蔥不育系和保持系單株驗證結果
權利要求
1.一種用於大蔥細胞質雄性不育檢測的試劑盒，其特徵在於包括如下的SCAR標記引物 正向引物WMS607L :5' -CATAAGACTTGCCCTGAG-3'； 反向引物WMS607R :5' -TTCGCTATGTTCTATGTGAG-3'。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑，所述的試劑優選的是北京天根生產的的植物基因組提取試劑盒中的試劑。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括PCR擴增所需要的試劑。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括對擴增產物進行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。
5.權利要求1-4任意一項所述的試劑盒在大蔥分子標記輔助選擇育種中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，所述應用包括用CTAB法提取大蔥總DNA，然後使用所述的SCAR標記引物對所提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行凝膠電泳以確定有無擴增產物以及擴增產物的片段長度，根據檢測結果判斷所使用的大蔥是否屬於細胞質不育系O
全文摘要
本發明公開了一種大蔥細胞質雄性不育的檢測試劑盒及其大蔥輔助選擇育種中的應用，所述的試劑盒包括SCAR標記引物正向引物WMS607L5′CATAAGACTTGCCCTGAG 3′；反向引物WMS607R5′TTCGCTATGTTCTATGTGAG 3′。本發明的試劑盒可以廣泛應用於我國遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細胞質的育性鑑定。本發明通過提取大蔥總DNA即可，避免了提取線粒體DNA的複雜操作，使操作過程更簡單有效。分子標記輔助選擇操作簡單，節約成本和時間，為大蔥分子標記輔助選擇育種體系奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102851379SQ20121034897
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者高莉敏, 陳運起, 董飛, 孔素萍 申請人:山東省農業科學院蔬菜研究所