一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的elisa試劑盒及應用的製作方法

2023-05-20 16:46:56 2

專利名稱：一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的elisa試劑盒及應用的製作方法
—種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA試劑盒及應用技術領域
本發明屬於動物免疫化學分析技術領域。具體涉及豬繁殖與呼吸症候群病毒 (PRRSV)的酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒與應用，本發明的試劑盒適用於臨床豬群的豬繁殖與呼吸症候群病毒的快速檢測。
背景技術：
豬繁殖與呼吸症候群(porcinereproductive and respiratory syndrome,簡稱 PRRS)是由豬繁殖與呼吸症候群病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，簡稱PRRSV)引起的一種嚴重危害養豬業的烈性傳染病。以妊娠母豬流產、死產、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡階段豬的呼吸道症狀為特徵。1987年首次在美國發現，當時由於病原不清楚，故稱為「豬神秘病」，又因為部分發病豬耳部發紺變紫，故又稱之為「藍耳病」。不久PRRS迅速在北美和歐洲暴發流行。1995年國內某些豬場發生了以流產、死胎等為主要症狀的疫病，懷疑是由PRRSV引起的繁殖障礙性疾病。1996年中國農科院哈爾濱獸醫研究所在國內分離到第一株PRRSV病毒(CH-1a株)，證實該病在國內存在。2006年6 月開始，我國南方部分省市發生了以體溫高熱不退、皮膚發紅、呼吸困難為主要臨床症狀的疫情，該病給養豬業造成了巨大經濟損失。經流行病學調查、病毒分離、基因分析、動物試驗等，最終確定是由豬繁殖與呼吸症候群病毒變異株造成的，並定名為高致病性豬藍耳病。
目前檢測PRRSV抗原的主要方法有RT-PCR、免疫過氧化物酶單層試驗 (Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)和病毒分離等。檢測 PRRSV 抗體的方主要是血清學實驗，包括 IPMA、間接免疫突光(indirect immunofluorescence assay, IFA)、 血清中和試驗(serum neutralization test, SN)和酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。IPMA需要首先分離出病毒,而分離病毒所需時間長，且靈敏性差。國內外有部分學者採用RT-PCR技術檢測PRRS病原的存在，並獲得了較好的實驗室檢測效果，然而RT-PCR首先需要反轉錄，其技術要求高、樣本處理難、價格昂貴，因此不適用於大規模檢測。我國現階段缺乏快速、準確、成本低廉的PRRS檢測試劑。近年來，ELISA 法以其靈敏、快速、特異、簡便等優點，在動物疾病的檢測診斷領域已被廣泛應用。目前國內外檢測PRRSV抗原的ELISA方法較多，但已申請專利的檢測PRRSV抗原的ELISA方法只有兩種，分別是楊漢舂等的「豬繁殖與呼吸症候群病毒雙抗體夾心ELISA試劑盒」(專利申請號200910093631.1)和吳豔濤等的「檢測豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA試劑盒及檢測方法」(專利申請號201010252436.1)。與上述兩個專利相比本發明是採用針對高致病性PRRSVN蛋白不同抗原表位的兩株單克隆抗體建立的雙抗體夾心ELISA方法，而吳豔濤等採用的是一株針對PRRSV N蛋白的單克隆抗體和一種針對整個PRRSV的多克隆抗體，在方法的建立方面有本質的不同；楊漢春等採用的是針對PRRSV經典株-BJ-4株的單克隆抗體。 但 是，目前在我國流行的主要是高致病性PRRSV，本專利中請在對高致病性PRRSV進行檢測時具有更高的特異性。
本發明應用免疫學技術篩選出針對PRRSVN蛋白單克隆抗體，研製針對高致病性 PRRSV的快速檢測試劑盒，並對其性能進行測定。試劑盒檢測方位寬，假陽性低，檢測靈敏、 準確、可靠，適用於臨床豬群中豬繁殖與呼吸症候群病毒的檢測。發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，製備專門針對抗PRRSV WUH3株N蛋白單克隆抗體。利用2株針對N蛋白不同抗原表位的單克隆抗體研製一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA試劑盒，作為在臨床豬群中的豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA 檢測方法中的應用。
本發明的技術方案是
申請人通過分子生物學方法，獲得一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的單克隆抗體，該抗體是由保藏號為CCTCC NO C201195和保藏號為CCTCC NO C201194的雜交瘤細胞N4D2和N3H12所分泌的。
所述的雜交瘤細胞N4D2和N3H12於2011年9月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號分別為CCTCC NO :C201195和CCTCC NO C201194o
申請人研製了一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其包含所述的保藏號為CCTCCNO C201195和保藏號為CCTCC NO C201194的雜交瘤細胞N4D2和N3H12 所分泌的的單克隆抗體。
申請人提供了一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的的ELISA試劑盒，該試劑盒由下列部分構成保藏號為CCTCC NO C201195的單克隆抗體包被的酶標板和保藏號為CCTCC NO C201194的單克隆抗體製備的酶標記物，陽性對照，陰性對照，包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液，其中所述的包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液的組分及配比如下
包被液為O. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝液1. 59gNa2C03，2. 93gNaHC03，加三蒸水定容至IOOOmL ；
20 倍濃縮洗滌液稱取 NaCI 160g、KCl 4g、Na2HPO4 · 12H20 58g、KH2P044g,用 800ml三蒸水溶解，調節pH值至7. 4，再加入Tween-2010ml，最後加三蒸水定容至IOOOml ；
封閉液在IOOml洗滌液中加入5g脫脂乳溶解製成；
底物顯色液A =Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，檸檬酸9. 33g，過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解並定容至1000ml，調pH至5. O 5. 4，用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝；IOml/ 瓶；
底物顯色液B :四甲基聯苯二胺20mg,無水乙醇IOml,加注射用水溶解並定容至 IOOOml ;過濾除菌，無菌分裝，IOml/瓶；
終止液2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml,過濾除菌；無菌分裝；10ml/ 瓶。
本發明是通過如下步驟獲得的
一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA檢測方法，其包括製備免疫原、抗體、包被原、酶標板、酶標記物和樣品前處理，其具體製備步驟如下所述
(I)將豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)WUH3株0RF7基因擴增後，連接到 pET-30a載體上，構建原核表達質粒pET-30a-0RF7，轉化大腸桿菌E. coli BL21(DE3)後，將其表達產物(重組的N蛋白)經N1-NTA柱純化後得到免疫原；
(2)將步驟⑴得到的重組N蛋白免疫原經動物免疫、細胞融合和篩選後得到特異性抗N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞N4D2和N3H12(其保藏號分別為CCTCC NO C201195 和 CCTCC NO C201194)；
(3)將步驟(2)得到的抗N蛋白單克隆抗體N4D2，經抗體純化後得到包被原；
(4)將步驟⑵得到的抗N蛋白單克隆抗體N3H12，經抗體純化、酶標後得到酶標記物；
(5)將步驟(3)得到的純化的抗N蛋白單克隆抗體N4D2包被的酶標板；
(6)分別製備陽性對照，陰性對照，包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液，
所述的包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液的組分及配比如下
包被液為O. 05mol/LpH9. 6 的碳酸鹽緩衝液取1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,加三蒸水定容至IOOOmL ；
20 倍濃縮洗滌液-M NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4 · Iffi2O 58g、KH2P044g,用 800ml 三蒸水溶解，調節pH至7. 4,再加入Tween-2010ml,最後加三蒸水定容至IOOOml ；
封閉液在IOOml洗滌液中加入5g脫脂乳溶解製成；
底物顯色液A :取Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，檸檬酸9. 33g，過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解並定容至1000ml,調pH至5. O 5. 4,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌；無菌分裝；10ml/ 瓶；
底物顯色液B :取四甲基聯苯二胺20mg,無水乙醇IOml,加注射用水溶解並定容至 IOOOml ;過濾除菌；無菌分裝；10ml/瓶；
終止液取2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至IOOOml ;過濾除菌；無菌分裝;IOml/瓶。
其中所述的陽性對照和陰性對照是通過如下步驟製備得到的
陽性對照的製備
將實施例1中製備的如序列表SEQ ID NO 1所述核苷酸序列的純化重組N蛋白， 用磷酸鹽緩衝液(PBS)稀釋至50ng/ml後，即為製備本試劑盒的陽性對照。
陰性對照的製備
將原核表達載體pET_30a轉化E. coli BL21 (DE3)，塗布到含卡那黴素(Kna)抗性 (50 μ g/mL)的LB平皿上，挑取單菌落擴大培養，經質粒提取和酶切鑑定正確後的重組菌用於後續的誘導表達。將重組菌按照1: 1000(體積比)的比例加入含有卡那黴素(Kan)抗性(50 μ g/mL)的液體LB培養基中，過夜培養後，第二天，按照1: 100 (體積比)的比例在 37°C進行大量誘導。在OD6tltlnm值在O. 3時加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為O. 8mM/L進行誘導表達。在誘導表達4h後， 將菌液於12000r/min離心lmin，棄掉上清， 加入1/10(體積比)的PBS重懸沉澱。經超聲波破碎儀(儀器廠家JNBI0 HIGH PRESSURE H0M0GEN1ZER-JN300PLUS, main energy :1000 1500)破碎，10000r/min 離心 IOmin 後，取上清用PBS稀釋100倍(體積比)後，即為本試劑盒的陰性對照。
(7)將待檢的豬血液經4000r/min,離心5min,獲得豬血清(樣品)；或者將待檢豬的組織樣品經研磨，離心後取上清即可得到待檢樣品；
(8)用笨發明製備的試劑盒對步驟(7)的待測樣品進行ELISA測定及結果判定。
本發明試劑盒有以下優點
(I)樣品前處理簡單、方便、快捷，縮短了整個檢測過程所需要的時間。
(2)本發明採用兩株抗N蛋白的單克隆抗體所建立的檢測方法具有很好的特異性，與口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)、豬細小病毒(porcine parvovirus, PP V)、豬痕病毒(Hogcholera virus, HCV)、豬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)、豬偽狂犬病病毒 (pseudorabies virus, PRV)和豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV)無交叉反應。
(3)本發明對豬繁殖與呼吸症候群病毒的高致病性變異毒株和經典毒株和均可進行檢測，具有很好的敏感性。


序列表SEQ ID NO :1 是 PRRSV WUH3 株 0RF7 基因序列。
序列表SEQ ID NO :2是PRRSV WUH3株重組N蛋白的胺基酸序列。
圖1 :本發明檢測方法建立的技術路線。
圖2 :本發明擴增到的PRRSVWUH3株0RF7基因瓊脂糖凝膠電泳檢測圖(圖中M : DNALadder ；1 0RF7 基因(372bp) ；2 :陰性對照)。
圖3 :本發明所製備的重組N蛋白的SDS-PAGE電泳檢測圖(途中M :蛋白Marker 1:pET-30a 誘導後 5h ；2 :pET-30a_0RF7 未誘導；3 :pET-30a_0RF7 誘導後 5h ；4 :重組表達菌破碎後離心上清；5 :重組表達菌破碎後離心沉澱；6 :純化後的重組N蛋白)。
圖4 :本發明所構建的原核表達質粒pET-30a_0RF7示意圖。
圖5 :本發明中所使用的單克隆抗體的抗體亞類鑑定結果(N4D2 =IgGl, κ ；Ν3Η12 IgGl, O。
圖6 :本發明的特異性實驗結果。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明，但不是限制本發明。
實施例1免疫原的製備
本實施例中的免疫原(純化的重組N蛋白)的製備按照圖1所示的技術路線。具體方法為
1、0RF7基因的克隆和測序
本發明涉及的0 RF7基因是申請人自己克隆得到的，該基因的序列已在GenBank 資料庫中登錄，登錄號為ΗΜ853673.1。該序列與已知序列有100%的同源性。0RF7基因的克隆與測序具體方法是將發明人所在的華中農業大學農業穩微生物國家重點實驗室病毒室分離到的豬繁殖與呼吸症候群病毒WUH3株(Li B, Xiao SB，Wang Yff, Xu SS, Jiang YB， Chen HC， Fang LR.1mmunogenicity of the highly pathogenic porcine reproductiveand respiratory syndrome virus GP5 protein encoded by a synthetic ORF5 gene. Vaccine. 2009,27(13) :1957-1963.)GenBank 登錄號為 HM853673.1接種已長至單層的 Marc-145細胞(購自衛生部武漢生物製品所)，48h後，待細胞發生皺縮、聚集和脫落等病變時收集病毒，在_80°C條件下凍融3次，1000r/min離心IOmin去除細胞碎片，分裝後存於-80 V保存備用。根據PRRSV WUH3株的序列設計引物，擴增0RF7基因。設計上遊引物P1: GCGGGATCCATGCCAAATAACAACGGC ;下遊引物 P2 GGGAAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGC 在引物 Pl 和P2分別插入BamH I和Hind III位點。兩引物之間包含有0RF7基因完整的閱讀框。取適量的PRRS病毒懸液提取總RNA，按照寶生物工程(大連)有限公司的RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明書中的操作說明進行提取，並擴增出目的基因0RF7 (序列長度為372bp，見圖2)， 將目的基因通過瓊脂糖回收試劑盒(購自TIANGEN公司)回收後，連接到pGEM-T載體(購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司)上，轉化E. coli DH5a (購自寶生物工程(大連) 有限公司)。挑選單菌落，並在含有100 μ g/mL的氨節青黴素(Amp)的LB培養基中培養後， 採用質粒小量提取試劑盒(購自TransGen Biotech公司)提取目的質粒,並經BamH I和 Hind III雙酶切鑑定後，挑選正確的克隆，將重組菌液送金斯瑞公司進行序列測定，並將測序結果與GenBank中的有關數據進行同源性比較和分析，結果與原序列的同源性為100%。
2、原核表達質粒pET-30a_0RF7的構建和重組N蛋白的表達和純化
將pGEM-T-0RF7經BamH I和Hind III雙酶切後，插入原核表達載體pET_30a (購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司)的相同位點，並轉化E. coli DH5a。挑取單菌落擴大培養後，提取質粒並經雙酶切鑑定後，證實pET-30a-0RF7原核表達質粒(圖4)構建成功。將重組質粒pET-30a-0RF7轉化E. coli BL21 (DE3)，塗布到含卡那黴素(Kna)抗性 (50 μ g/mL)的LB平皿上，挑取單菌落擴大培養，經質粒提取和酶切鑑定後正確的重組菌用於後續的誘導表達。將重組菌按照1: 1000(體積比)的比例加入含有卡那黴素(Kan) 抗性(50 μ g/mL)的液體LB培養基中，過夜培養後，第二天，按照1: 100 (體積比)的比例在37°C進行大量誘導。在OD6tltlnm值在0. 3時加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG) 使其終濃度為0. 8mM/L進行誘導表達。在誘導表達4h後，取ImL誘導表達菌，將菌液於 12000r/min離心lmin，棄掉上清，用100 μ L磷酸鹽緩衝液(即PBS :取KCL 0. 2g，NaCL 8g， KH2PO4O. 27g，NaHPO4L 42g於900ml ddH20中，攪拌至完全溶解，定容至1L)將沉澱重懸。加 Λ 25 μ L5XSDS-PAGE Loading Buffer，混勻後，在100°C沸水中煮沸IOmin後，置於冰上， 作為SDS-PAGE檢測的樣品。另外，將用PBS重懸後的菌液經超聲波破碎儀(儀器廠家 JNBIO HIGH PRESSURE H0M0GENIZER-JN300PLUS,main energy : 1000 1500)破碎，10000r/ min離心IOmin後，再次將沉澱重懸，分別取上清和沉澱加入適量的SDS-PAGE Loading Buffer製備樣品，進行SDS-PAGE檢測。經檢測發現重組的N蛋白在誘導後4h獲得高效表達，並是以可溶性蛋白的形式存在。再次誘導200ml重組菌，將菌液離心後按照GE公司(GE Healthcare公司)的可溶性蛋白純化方法(按照產品使用說明書進行操作)，使用N1-NTA 柱對其進行純化。最終獲得純度很好的重組N蛋白(圖3)，即作為本發明的免疫原，另外， 可建立間接ELISA方法用於陽性雜交瘤細胞株的篩選。
實施例2抗N 蛋白單克隆抗體的製備
利用實施例1中製備的免疫原免疫6周齡雌性BALB/C小鼠(購自湖北省疾病預防控制中心)。免疫程序是取重組N蛋白IOOyg的蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑(購自sigma公司)乳化，皮下注射小鼠。間隔14天後進行第二次免疫，換用不完全佐劑(購自sigma公司)乳化，並在二次免疫後的14天用間接ELISA方法測定小鼠血清抗體效價。 最後在融合前的3 5天，腹腔加強免疫，不加佐劑。融合時，取經最後加強免疫的BALB/C 小鼠一隻。眼眶放血致死(收集血清，即為陽性血清)，無菌分離脾細胞，與新鮮製備的無菌的SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛生部武漢生物製品所)按照I 2X IO7個SP2/0與IO8個免疫細胞(數量比1 10 1: 15)的比例用PEG(購自sigma公司)0.8mL在37°C的條件下進行細胞融合。具體方法是第一分鐘逐滴滴入lmL。第二分鐘加lmL，第3 4分鐘加3mL，第5分鐘加其餘的5mL，每次加時需緩慢加入，並不斷輕輕地攪拌。最後加入30mL RPM1-1640液(購自GIBCO公司)，也需慢慢加入。在1000r/min離心5min,去上清，於37°C 放置5 8min。用HAT培養基(購自Sigma公司)懸浮，同時也用HAT培養基懸浮製備好的飼養脾細胞並與融合後的細胞混合，根據需要補加適量的HAT培養基，分種於96孔培養板中，約250 μ I/孔。一次融合可接種4 8塊96孔板。放在細胞培養箱進行培養，並觀察其生長情況，於第四天更換100 μ I HT培養基(購自Sigma公司)。當培養基略變黃時，進行抗體檢測。對篩選出來的陽性孔用有限稀釋法(Che，X. Y.，L. ff. Qiu，Y. X. Pan, K. Wen，ff. Hao， L. Y. Zhang, Y. D. Wang, Z. Y. Liao, X. Hua, V. C. Cheng, and Κ. Y. Yuen. 2004. Sensitive and specifi c monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay for detection of nucleocapsid antigen in sera from patients with severe acute respiratory syndrome. J. Clin. Microbiol. 42 :2629-2635.)進行克隆、篩選。經過 3 4 次的克隆，最終篩選到兩株分泌抗N蛋白的單克隆雜交瘤細胞株，並於2011年9月20日送中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，申請人將其命名為雜交瘤細胞N4D2(保藏編號為CCTCC NO C201195)和雜交瘤細胞N3H12(保藏編號為CCTCC NO :C201194)。對該細胞系進行了染色體計數，結果顯示，SP2/0的染色體的平均數為70,脾細胞染色體為40條,而雜交瘤細胞的染色體數目在90 100之間，均高於兩親本細胞的染色體數目。將這兩株細胞系注射BALB/ C小鼠腹腔，可大量製備單克隆抗體。採用小鼠抗體亞類鑑定試劑盒(購自Thermo公司) 對本發明所得到的單克隆抗體進行亞類鑑定，結果兩株抗體的抗體亞類均為小鼠IgGl亞類(圖5)，輕鏈亞類為κ。並通過相加ELISA的方法(Qiu, L. W.，B. di，K. Wen，X. S. Wang, ff. H. Liang, Y. D. Wang, Y. X. Pan, M. Wang, Y. Q. Ding, and X. Y. Che. 2009. Development of an antigen capture immunoassay based on monoclonal antibodies specifi c for dengue virus serotype 2 nonstructural protein I for early and rapid identifi cation of dengue virus serotype 2 infections. Clin. Vaccine Immunol. 16 :88-95.)石角定了製備的兩株抗體與N蛋白的結合位點不同，可用於後續檢測方法的構建。
實施例3單克隆抗體的純化`
對實施例2製備的抗體腹水採用辛酸一硫酸銨法進行純化。具體操作過程為取製備的腹水5mL12000r/min,離心5min,取上清,約為5mL ;在上清中加入20mL醋酸緩衝液 (pH 4. 5，該醋酸緩衝液的配方稱取NaAc ·3Η20 4. 085g溶於450ml ddH20中，用HCl調pH 至4. 5，用ddH20定容至500ml)，混勻後，緩慢加入825 μ I辛酸，邊加邊攪動；攪拌30min, 於4°C 12000r/min離心30min ;將上清用濾紙過濾,並調節pH至7. O 7. 4之間，按總體積 (45%的比例加入飽和硫酸銨(pH 7. 2)，邊加邊攪拌，攪拌30min，置於4°C冰箱，沉澱4 5h ;於4°C 12000r/min離心30min ;用適量IOmM Tris-HCL (pH :9. 0)將沉澱重懸，裝入透析袋，用IOmM Tris-HCL(pH 9. O)在4°C透析過夜，於12000r/min離心5min,取上清定容至 5mL。並在紫外分光光度儀上測定蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳鑑定為純化的單克隆抗體，純度為95%。分裝後保存於_80°C備用。該純化的抗體N4D2和N3H12可用於製備檢 測豬繁殖與呼吸症候群病毒試劑盒的相關試劑。
實施例4酶標板和酶標記物的製備
1、酶標板的製備
將實施例3中製備的純化的單克隆抗體(N4D2)用包被液稀釋至2 μ g/ml, 100 μ I/ L，加入96孔板，4°C過夜。第二天，拍幹孔內的液體，加入含5%脫脂乳的PBST封閉， 200μ I/孔，37°C lh。用洗滌液洗3遍，每遍2min。風乾孔內的殘存液體，即可獲得用於製備試劑盒的酶標板。
2、酶標記物的製備
將實施例3製備的純化的單克隆抗體(N3H12)進行酶標，製備酶標記物。具體操作過程為取5mg辣根過氧化物酶(HRP，購自sigma公司)溶於O 5mL ddH20中，加入O. 5mL NaIO4(O. 06M)，於4°C 30min後，加入乙二醇(O. 16M)0. 5mL，室溫避光30min以終止氧化反應；加入5mg/mL的IgG ImL,置於4°C冰箱，用碳酸鹽緩衝液(O. 05M,碳酸鹽緩衝液成分取1. 59gNa2C03, 2. 93gNaHC03,溶於800mL三蒸水中，完全溶解後加三蒸水定容至lOOOmL，pH 9. 5)透析過夜；次日，吸出透析袋內的液體，加入O. 2mLNaBH4 (5mg/mL)置於4°C冰箱此後， 加入等體積的飽和硫酸銨(pH 7. 2)置於4°C冰箱30min,於10000r/min離心IOmin棄上清，沉澱用適量磷酸鹽緩衝液(20mM，磷酸鹽緩衝液成分取7. 16g Na2HPO4, 3. 12g NaH2PO4, 溶於800mL三蒸水中，完全溶解後加三蒸水定容至lOOOmL，pH :7. 4)重懸後，用PB在4°C透析過夜；次日，10000r/min離心5min,上清定容至5mL,分裝保存於_80°C。即可獲得用於製備試劑盒的酶標記物。
實施例5包被濃度和酶標記物工作濃度的確定。
將實施例3中製備的純化抗體N4D2作為包被原和實施例4中製備的酶標記物 N3H12,採用方陣滴定的方法按照雙抗體夾心ELISA的操作程序，確定包被原的最佳包被濃度和酶標記物的最佳工作濃度。具體操作過程為將包被原用包被液按照8 μ g/ml>4 μ g/ ml、2 μ g/ml、I μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、0. 0625 μ g/ml 進行稀釋，將稀釋好的抗體100 μ I/孔，橫向加入酶標板中，4°C過夜。第二天，拍幹孔內的液體，用含5 %脫脂乳的PBST封閉，37°C Ih0用洗滌液洗3遍，每遍2min。將擴增的PRRSV和Marc-145細胞按照體積比為1: 40用PBST稀釋，ΙΟΟμ I/孔，分別加入陽性和陰性測定孔，37°C Ih0再次洗滌。將酶標記物按照 I 400,1 800,1 1200,1 1600,1 2000,1 2400 (體積比)進行稀釋，100 μ I/孔，縱向加入酶標板中，37°C Ih0洗滌後，加入底物顯色液A和底物顯色液B各50 μ I/孔,顯色15min,最後以終止液終止反應。在630mn波長下,用酶標儀讀取其吸光值(0D值630nm)。結果見表I。結果顯示包被原N4D2的最佳包被濃度為2 μ g/ ml，酶標記物N3H12的最佳工作濃度為1: 1000。
實施 例6陽性對照和陰性對照的製備
1、陽性對照的製備
將實施例1中製備的將實施例1中製備的如序列表SEQ ID NO :1所述核苷酸序列的純化重組N蛋白，用磷酸鹽緩衝液(PBS)稀釋至50ng/ml後，即為製備本試劑盒的陽性對
2、陰性對照的製備將原核表達載體pET_30a轉化E. coli BL21 (DE3)，塗布到含卡那黴素(Kna)抗性 (50 u g/mL)的LB平皿上，挑取單菌落擴大培養，經質粒提取和酶切鑑定正確後的重組菌用 於後續的誘導表達。將重組菌按照1 :1000(體積比)的比例加入含有卡那黴素(Kan)抗 性(50 u g/mL)的液體LB培養基中，過夜培養後，第二天，按照1 : 100 (體積比)的比例在 37°C進行大量誘導。在0D6(l(lmi值在0. 3時加入異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)使其終濃 度為0. 8mM/L進行誘導表達。在誘導表達4h後，將菌液於12000r/min離心lmin，棄掉上清， 加入1/10 (體積比)的PBS重懸沉澱。經超聲波破碎儀(儀器廠家JNBI0 HIGH PRESSURE H0M0GENIZER-JN300PLUS, main energy 1000 1500)破碎，lOOOOr/min 離心 lOmin 後，取 上清用PBS稀釋100倍(體積比)後，即為本試劑盒的陰性對照。表1包被原最佳包被濃度和酶標記物最佳工作濃度的確定
權利要求
1.一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的單克隆抗體，其特徵在於，它是由保藏號為CCTCC NO C201195和保藏號為CCTCC NO C201194的雜交瘤細胞N4D2和N3H12所分泌的。
2.權利要求1所述的雜交瘤細胞株，其特徵在於，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號分別為 CCTCC NO C201195 和 CCTCC NO :C201194。
3.—種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其包含權利要求1所述的單克隆抗體。
4.一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的的ELISA試劑盒，其特徵在於，該試劑盒由下列部分構成保藏號為CCTCC NO C201195的單克隆抗體包被的酶標板和保藏號為CCTCC NO C201194的單克隆抗體製備的酶標記物，陽性對照，陰性對照，包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液，其中所述的包被液，洗滌液，樣品稀釋液，底物顯色液A、底物顯色液B和終止液的組分及配比如下 包被液為0.05mol/L ρΗ9·6的碳酸鹽緩衝液1.59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3，加三蒸水定容至 IOOOmL ； 20 倍濃縮洗滌液稱取 NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4 · 12H20 58g、KH2P044g，用 800ml 三蒸水溶解，調節pH至7. 4,再加入Tween-2010ml,最後加三蒸水定容至IOOOml ； 封閉液在IOOml洗滌液中加入5g脫脂乳溶解製成； 底物顯色液A =Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，檸檬酸9. 33g，過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解並定容至1000ml,調pH至5. O 5. 4,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌,無菌分裝，IOml/瓶； 底物顯色液B:四甲基聯苯二胺20mg，無水乙醇10ml，加注射用水溶解並定容至1000ml，過濾除菌，無菌分裝，IOml/瓶； 終止液2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml,過濾除菌,無菌分裝，IOml/ 瓶； 其中所述的陽性對照和陰性對照通過如下步驟獲得 陽性對照製備 用磷酸鹽緩衝液(PBS)將序列表SEQ ID NO :1所述核苷酸序列的純化的重組N蛋白稀釋至50ng/ml後，即為陽性對照； 陰性對照製備 將原核表達載體pET-30a轉化E. coli BL21 (DE3)，塗布到含卡那黴素抗性(50 μ g/mL)的LB平皿上，挑取單菌落擴大培養，經質粒提取和酶切鑑定正確後的重組菌用於後續誘導表達，將重組菌按體積比為1: 1000的加入含有卡那黴素的液體LB培養基(50 μ g/mL)中，過夜培養後，於第二天將重組菌按體積比為1: 100加入含有卡那黴素的液體LB培養基(50 μ g/mL)，在37°C下進行大量誘導；在OD600nm值在O. 3時加入異丙基硫代_ β -D-半乳糖苷，使其終濃度為O. 8mM/L進行誘導表達；在誘導表達4h後，將菌液於12000r/min離心Imin,棄上清,加入1/10體積比的PBS重懸沉澱；再用超聲波破碎儀破碎,於10000r/min離心lOmin，取上清用PBS稀釋100倍(體積比)，即為陰性對照。
5.權利要求1所述的單克隆抗體在製備豬繁殖與呼吸症候群病毒的ELISA試劑盒中的應用。
6.權利要求3或4所述的試劑盒在體外檢測豬繁殖與呼吸症候群病毒中的應用。
全文摘要
本發明屬於動物免疫分析技術領域。具體涉及一種用於高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)檢測的酶聯免疫(ELISA)試劑盒及應用。本發明的方法主要包括免疫原、抗體的製備、包被原及酶標抗體的製備和ELISA檢測方法的建立。本發明的試劑盒主要由抗PRRSVN蛋白特異性酶標記物、PRRSV標準陽性對照、包被有抗PRRSVN蛋白特異性單克隆抗體的酶標板組成。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準確等特點，適用於對臨床豬群中的高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的檢測。
文檔編號C12N5/20GK103044544SQ20111031473
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者肖少波, 方六榮, 朱海波, 宋濤, 曾松林, 張玉娟 申請人:華中農業大學