一種土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測方法與流程

2023-05-21 04:45:11 1

本發明屬於生物技術領域，涉及微生物檢測，具體涉及一種土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測方法。

背景技術：

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌即尖孢鐮刀菌西瓜專化型(fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起的一種維管束系統病害，是一種毀滅性的土傳病害，在世界各地均有不同程度發生。近年來，由於種植制度的改變(如高產連作)，該病害發生嚴重，已成為制約我國西瓜產業發展的主要障礙。因此，準確、快速地檢測西瓜枯萎病菌，對於一個地區西瓜枯萎病綜合防治具有重要意義。

目前對西瓜枯萎病菌的定量檢測方法通常採用選擇性培養基進行病菌的分離培養和菌落計數。這種方法準確性低、費時，且易受雜菌影響。隨著分子生物學技術日益成熟，螢光定量pcr技術已廣泛用於植物病原菌動態檢測和預警。

國內外已有研究報導關於西瓜枯萎病菌的分子檢測方法。如中國農業科學院的曹月霞等、中興大學的linyinghong等，以及南京農業大學的zhangzhenggang等建立了可以特異性鑑定西瓜枯萎病菌的普通pcr分子檢測體系。zhangzhenggang等還建立了可以定量檢測西瓜枯萎病菌的螢光定量pcr方法，然而該方法是以西瓜枯萎病菌dna濃度量化待測樣品，所得結果單位為ngdna每克土，而非菌數每克土，不能直觀的了解土壤中西瓜枯萎病菌的濃度。此外，國內尚無西瓜枯萎病菌定量檢測方法的專利。

技術實現要素：

發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測方法，該方法可對土壤中西瓜枯萎病菌數量進行快速檢測定量。

技術方案：為了實現上述目的，本發明所述一種土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)製備含不同濃度西瓜枯萎病菌的系列梯度標準土樣；

(2)利用土壤dna提取試劑盒分別提取系列梯度標準土樣和待測土樣總dna；

(3)選定併合成可用於西瓜枯萎病菌檢測的特異性引物，分別以步驟(2)提取的系列梯度標準土樣總dna以及待測土樣總dna為模板，進行螢光定量pcr反應，分別得到系列梯度標準土樣和待測土樣的ct值；

(4)根據系列梯度標準土樣中西瓜枯萎病菌濃度和相應的ct值製作標準曲線，根據待測土樣螢光定量pcr反應ct值和標準曲線，，通過計算即可獲得待測土樣中西瓜枯萎病菌濃度。

其中，步驟(1)所述含不同濃度西瓜枯萎病菌的系列梯度標準土樣的製備方法為：取耕地土壤風乾後滅菌獲得土樣；將西瓜枯萎病菌菌絲塊接種到裝有綠豆液體培養基的三角瓶中，培養得到西瓜枯萎病菌孢子液，計數後將孢子液依次稀釋，取稀釋後的孢子液加入到土樣中風乾，即獲得含不同濃度西瓜枯萎病菌的系列梯度標準土樣。

所述系列梯度標準土樣中西瓜枯萎病菌濃度依次為2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103和2×102個/g土。

其中，步驟(3)所述特異性引物對為fon-1/fon-2。通過fon-1/fon-2引物對可從西瓜枯萎病菌中特異性擴增出174bp的產物。

進一步地，所述螢光定量pcr反應體系為：2×sybrpremixextaq10μl、上下遊引物各0.4μl(濃度均為10μmol/l)、roxreferencedyeii0.4μl、dna模板2μl、滅菌超純水補足至20μl。螢光定量pcr反應程序為95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個循環。

本發明所述的土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測方法，是採用螢光定量pcr技術，以西瓜枯萎病菌濃度已知的標準土樣繪製標曲，從而定量檢測待測土樣中的西瓜枯萎病菌濃度的檢測技術。可用於西瓜枯萎病菌的跟蹤檢測。

有益效果：與現有技術相比，本發明優點如下：

本發明的檢測方法可以直接檢測出土壤中西瓜枯萎病菌數量。本發明方法以西瓜枯萎病菌濃度已知的標準土樣總dna作為模板，根據系列梯度標準土樣中西瓜枯萎病菌濃度和相應的ct值製作定量pcr標準曲線，可直接計算出待測土樣中西瓜枯萎病菌濃度，所得結果單位為菌數每克土，而非現有技術中結果單位為拷貝數每克土或者ngdna每克土，可以直接檢測出土壤中西瓜枯萎病菌的數量。本發明方法既克服了傳統平板塗布計數法結果的不可靠性，又解決了常規定量pcr結果的不直觀性，可以替代一直沿用的平板塗布計數法和常規螢光定量pcr方法。

附圖說明

圖1為特異性引物對西瓜枯萎病菌以及黃瓜枯萎病菌和常見土壤細菌的pcr擴增電泳結果；泳道1-2為西瓜枯萎病菌，3-4為黃瓜枯萎病菌，5-6為芽孢桿菌；

圖2為標準土壤樣品和待測土壤樣品的西瓜枯萎病菌螢光定量pcr溶解曲線圖，溶解溫度為81.2℃；

圖3為標準土壤樣品和待測土壤樣品的西瓜枯萎病菌螢光定量pcr擴增曲線圖；

圖4為以西瓜枯萎病菌濃度已知的標準土樣繪製的螢光定量pcr標準曲線圖。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

實施例涉及的菌株和培養基：

實施例中涉及的菌株分別為西瓜枯萎病菌；黃瓜枯萎病菌；枯草芽孢桿菌。(菌株均來源於江蘇省農業科學院)

牛肉膏蛋白腖液體培養基：牛肉膏5g，蛋白腖10g，nacl5g，水1l，ph7.2-7.4。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：葡萄糖20g，馬鈴薯200g(將馬鈴薯洗淨去皮切碎煮30min，四層紗布過濾，取濾液)，瓊脂20g，水1l，ph＝7.0。

綠豆液體培養基：綠豆20g，將綠豆煮30min，四層紗布過濾，取濾液加純水補至1l。

實施例涉及的引物序列：

fon-1：cgattagcgaagacattcacaagact

fon-2：acggtcaagaagatgcagggtaaaggt

fon-1/fon-2引物對由金斯瑞生物科技有限公司合成。

實施例涉及的試劑及儀器：

土壤dna提取試劑盒為mp土壤dna提取試劑盒，購自南京壽德生物科技有限公司，貨號為116560200；

sybrpremixextaq試劑盒(包含2×sybrpremixextaq和roxreferencedyeii)購自大連寶生物工程有限公司，貨號為rr420a；

2×taqpcrmastermix購自南京基天生物技術有限責任公司；

實施例中的螢光定量pcr儀型號為abi7500，數據分析由abi7500螢光定量pcr儀自帶的分析軟體完成，螢光定量pcr反應完成後，軟體自動對每個反應收集到的螢光信號進行分析，選擇合適的螢光閾值，然後利用每個樣品在螢光閾值處所經歷的循環數(ct)和標準土壤樣品的西瓜枯萎病菌濃度建立標準曲線，待測土壤樣品可以根據其ct值和標準曲線計算出對應的西瓜枯萎病菌濃度。

實施例1

西瓜枯萎病菌引物特異性檢測。

(1)各菌株總dna製備：

用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養尖孢鐮刀菌西瓜專化型fw0和尖孢鐮刀菌黃瓜專化型foc，再用omega真菌dna提取試劑盒提取總dna；用牛肉膏蛋白腖液體培養基培養枯草芽孢桿菌bs211，再用omega細菌dna提取試劑盒提取總dna。

(2)特異引物合成：

fon-1：cgattagcgaagacattcacaagact

fon-2：acggtcaagaagatgcagggtaaaggt

由金斯瑞生物科技有限公司合成。

(3)西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、枯草芽孢桿菌的特異性片段的pcr擴增：

分別以各菌株dna為模板，fon-1和fon-2為上下遊引物，進行pcr擴增。

pcr反應體系如下：

2×taqpcrmastermix12.5μl，20μmol/l的引物各0.5μl，1μl濃度為40-60ng/μl的dna模板，滅菌超純水補足至25μl。

pcr反應程序如下：

95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環；72℃10min。

(4)pcr產物鑑定：

取6μlpcr產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據dna條帶的有無及大小對西瓜枯萎病菌專用引物的特異性進行驗證。

(5)試驗結果：

pcr擴增結果如圖1所示，圖中：泳道1-2為西瓜枯萎病菌，3-4為黃瓜枯萎病菌，5-6為枯草芽孢桿菌。由圖1可見，fon-1/fon-2引物對只能特異性從西瓜枯萎病菌總dna中擴增出174bp的條帶，而黃瓜枯萎病菌和枯草芽孢桿菌中均無擴增條帶。因此該對引物對西瓜枯萎病菌具有很好的特異性。

實施例2

製備西瓜枯萎病菌濃度已知的標準土樣。

(1)西瓜枯萎病菌孢子液的製備：

將西瓜枯萎病菌的菌絲塊接種到裝有500ml綠豆液體培養基的三角瓶中，30℃、170r/min搖床培養4天後即得西瓜枯萎病菌孢子液，血球計數板計數後備用。

(2)標準土樣的製備：

在江蘇省農業科學院六合基地水稻田內取耕層土壤風乾後121℃滅菌30min，即獲得土樣；用無菌水將西瓜枯萎病菌孢子液依次稀釋至濃度為2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103和2×102個/ml；分別取10ml稀釋後的孢子液加入到10g獲得的土樣中並快速風乾，即獲得西瓜枯萎病菌濃度依次為2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103和2×102個/g土的系列梯度標準土樣。

實施例3

待測土樣中西瓜枯萎病菌的定量檢測。

(1)標準土樣和待測土樣總dna的製備：

待測土樣取自江蘇省農業科學院六合基地西瓜設施大棚內分別種植1茬和2茬西瓜的耕層土壤，採用mp土壤dna提取試劑盒提取待測土樣總dna；採用mp土壤dna提取試劑盒提取西瓜枯萎病菌濃度分別為2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103和2×102個/g土的系列梯度標準土樣總dna。

(2)用於定量檢測西瓜枯萎病菌的pcr反應體系：

20μl定量pcr反應體系如下：2×sybrpremixextaq10μl，10μmol/l的fon-1/fon-2引物各0.4μl(濃度均為10μmol/l)，roxreferencedyeii0.4μl，濃度為40-60ng/μldna模板2μl，滅菌超純水補足至20μl。

(3)用於定量檢測西瓜枯萎病菌的pcr反應程序：

95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個循環。

(4)螢光定量pcr擴增：

分別將西瓜枯萎病菌濃度為2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103和2×102個/g土的標準土樣和待測土樣總dna同時進行螢光定量pcr擴增，並以標準土樣中西瓜枯萎病菌濃度和相應的ct值作圖，並進行線性擬合得到標準曲線。根據待測土樣ct值和標準曲線，計算出待測土樣中西瓜枯萎病菌濃度。

(5)試驗結果：

應用上述方法測定西瓜設施大棚土壤中西瓜枯萎病菌濃度。溶解曲線見圖2，溶解溫度為81.2℃，標準樣品及待測樣品溶解曲線均呈單峰。擴增曲線見圖3，擴增效率為106.912。

標準曲線見圖4，線性方程為y＝36.958-3.167x，r2＝0.99。

根據待測土樣ct值和線性方程，可計算出待測土樣中西瓜枯萎病菌濃度，測定結果如表1所示：

表1種植不同茬次西瓜的土壤中西瓜枯萎病菌濃度測定

從表1結果可以看出，採用本發明方法檢測西瓜種植土壤中西瓜枯萎病菌可以直接得出土壤中西瓜枯萎病菌數量，與常規定量pcr得到的拷貝數/g土或者ngdna/g土相比，結果更加直觀。