人血清白蛋白的純化的製作方法

2023-05-21 04:22:11

專利名稱：人血清白蛋白的純化的製作方法
相關申請本申請要求於2001年6月13日提交的專利USSN 60/297,884的優先權。此處該專利作為參考文獻引用。
背景技術：
在血液中，血清白蛋白是含量最多的蛋白質之一。血液中它們具有例如脂肪酸之類疏水分子的載體的作用，並且與有機分子結合將其隔離直至可將其清除，起到澄清劑的作用。由於它們在血液中含量豐富，血清白蛋白是決定血液性質，尤其是血清性質的主要決定因素。
第二次世界大戰中，人們認識到可以將hSA(人血清白蛋白)配製成生理性適用溶液來製成人類血液的代用品(人造血液)，用來補償創傷或外科手術造成的失血。參見Cohn et al.(1946)，J.Amer.Chem.Soc.68459-75。實際上，由於人體可以迅速地補充喪失的血細胞並且不會出現血型相容性的問題，大多數情況下這種人造血液都是理想的血液替代品。此外，hSA溶液比真正的血液具有遠遠更長的保質期。然而由於血液中hSA的含量高，即使生產極少量的人造血液也需要高度純化的大量hSA。
轉基因動物中hSA的重組生產非常吸引人，因為可以迅速從中獲得大量的蛋白質，因此就有可能大批量地生產人造血液。令人遺憾的是，重組生產的hSA不能直接使用首先除了將hSA從宿主樣品中存在的其他分子如脂類、小分子物質、蛋白質和病毒病原體中提純，還必須從宿主動物的血清白蛋白中將其純化。其次，目前從轉基因動物源獲得的樣品中著手生產人造血液級hSA的工序即費時又昂貴。至少部分原因是適合作轉基因宿主的動物中存在與之高度相似的血清白蛋白，將hSA從中分離存在相當難度。因而儘管在轉基因動物中重組生產hSA具有產生大量純淨hSA和人造血液的潛力，其可行性受到經濟因素的限制。
發明概述本發明部分基於一種可區分人血清白蛋白(hSA)和宿主細胞血清白蛋白的分離方法的發現，宿主細胞可以是例如來自於轉基因乳製品動物的轉基因宿主細胞。hSA的轉基因生產會形成同時含有hSA和動物內源血清白蛋白的產品。然而，通常必須獲得純化的hSA，其中不含雜質，尤其是非人類動物來源的血清白蛋白。從獲自於轉基因動物，比如轉基因乳製品動物的樣品中將hSA純化，這個過程可能由於此類動物血清白蛋白和hSA高度的同源性而複雜化。舉例來說hSA和牛血清白蛋白(BSA)非常相似。令人驚喜的是已發現使用一種方案可以適當和有效地從宿主細胞血清白蛋白中純化轉基因生產的hSA，該方案包括澄清含有hSA和內源血清白蛋白的樣品，用選擇性結合hSA的樹脂進行親和層析，待蛋白質從親和柱上洗脫後將hSA結晶。
因此，從一方面來看，本發明的特點是一種從含有hSA和宿主血清白蛋白的樣品中純化人血清白蛋白(hSA)的方法，該方法包括從宿主細胞獲得含有hSA和宿主血清白蛋白的樣品；上樣到結合hSA的親和柱，例如，與宿主血清白蛋白相比該柱與hSA有更強的結合親和力；將結合的hSA從親和柱上洗脫下來；並且將洗脫的hSA結晶。
一些實施方案中樣品獲自於轉基因非人類動物。該動物可為哺乳動物，比如有蹄類動物(如牛，山羊、或綿羊)、豬、小鼠或者兔。樣品可以從例如哺乳動物的乳汁、血液或者組織(例如組織勻漿)中獲得。其他實施方案中，樣品從鳥類如雞、火雞、鴨子、野雞或者鴕鳥中獲得。舉例來說，樣品可以獲自鳥類的卵、血液或者組織(例如組織勻漿)。優選實施方案中，所選動物為哺乳動物，且樣品為乳汁。
其他實施方案中，樣品為培養的細胞如哺乳動物細胞、鳥類細胞、魚類細胞或者昆蟲細胞的培養基。一些實施方案中，培養的細胞為轉基因細胞。舉例來說，培養的細胞可包含轉基因，該轉基因包含在合適調控元件控制下的編碼hSA的核酸序列。
一些實施方案中，本發明方法中使用的樣品為通過例如離心之類標準脫脂質程序進行脫脂的乳汁。
在相關實施方案中，本發明方法中使用的乳汁(例如脫脂質乳汁)樣品經過了除酪蛋白處理。舉例來說，通過降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉澱物可以將乳汁中酪蛋白的水平降至最低。在優選實施方案中，通過加酸將乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之類的稀酸。在優選實施方案中乳汁的pH值降至約4.2至4.8。在一些實施方案中，通過過濾除去乳汁中酪蛋白的重沉澱物，例如使用切向流微過濾法。其他實施方案中，從乳汁中通過離心除去酪蛋白的重沉澱物。在另一些其他實施方案中，不使用酸性沉澱酪蛋白，通過切向流過濾將酪蛋白從樣品中除去。
一些實施方案中，本發明方法中使用的樣品可以是已除淨酪蛋白的脫脂質乳汁。此處該樣品稱為「澄清的乳汁樣品」。
澄清的hSA樣品可以進行親和層析或者在此之前再進行一道或更多道純化程序。一些實施方案中純化的hSA樣品存在於適於親和柱上樣的鹽緩衝液中。例如，鹽緩衝液可以包含例如pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
一些實施方案中，本發明方法包括使用與hSA樣品(例如澄清的hSA樣品)中的hSA蛋白質結合的親和柱，其中親和柱包含合成樹脂。在Prometic Biosciences Blue SA柱中發現適於結合hSA的人造樹脂，該柱使用染料活性藍2(Reactive Blue 2)的修飾體作為親和配基。在優選實施方案中，親和柱，例如合成樹脂親和柱，基本不和hSA樣品中多數甚至大多數非hSA蛋白質結合(例如乳清蛋白質)。在特別優選的實施方案中，親和柱，例如合成樹脂親和柱，與非人血清白蛋白的親和力，例如牛血清白蛋白之類的哺乳動物血清白蛋白，比其與hSA的親和力低。
在相關實施方案中，本發明方法包括使用與hSA樣品(例如澄清hSA樣品)中hSA蛋白質結合的親和柱，其中親和柱配基和hSA間的作用可被脂肪酸分子破壞。優選的實施方案中，脂肪酸分子為辛酸鹽。
一些實施方案中，本發明方法包括將hSA樣品(例如澄清hSA樣品)加到柱上後對親和柱進行清洗。優選實施方案中，清洗緩衝液與上樣緩衝液相同。合適的清洗緩衝液包含例如pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
一些實施方案中，本發明方法包括使用洗脫緩衝液將與親和柱結合的hSA蛋白質洗脫，從而製得親和純化的hSA樣品，其中洗脫緩衝液基本不引起與親和柱結合的非血清白蛋白蛋白質的洗脫。使用Prometic Biosciences Blue SA柱時，合適的緩衝液可由磷酸鹽緩衝液和與親和柱上親和配基競爭結合hSA的脂肪酸分子組成。一些實施方案中，洗脫緩衝液包含約pH為6.0的20-50mM磷酸鹽溶液。一些實施方案中，洗脫緩衝液包含脂肪酸辛酸鹽，如濃度約為20mM。
一些實施方案中，本發明方法包括將親和純化所得hSA樣品再上樣到親和柱，清洗結合hSA的親和柱並且洗脫結合在親和柱上的hSA，從而獲得兩次親和純化的hSA樣品。在其他一些實施方案中，親和純化後的hSA樣品可以不止一次再上樣到親和柱，例如三次純化的hSA樣品。
之後親和純化的hSA樣品可以進行結晶或者在結晶之前再進行一道或多道額外的純化程序。
一些實施方案中，本發明方法包括向樣品中加入結晶劑將親和純化的hSA樣品(例如通過一次或兩次親和純化的hSA樣品)結晶。許多結晶劑都可以加入hSA溶液作為結晶引發劑，其包括聚乙二醇(PEG)、硫酸銨和/或磷酸鹽。優選的實施方案中，結晶劑為磷酸鹽溶液。在一項優選的實施方案中，作為結晶劑的磷酸鹽加入樣品中至最終濃度為2.7至2.8M磷酸鹽。一些實施方案中，結晶劑中還包含與hSA結合的脂肪酸分子，例如辛酸鹽。優選方案中，通過例如過濾的方法將結晶的hSA蛋白質從結晶溶液(即母液)中分離出來，用緩衝液清洗，並且用適當的溶劑(例如水)再次溶解。其他實施方案中，結晶的hSA蛋白質可以通過例如使用一種溶劑或風乾的方法進行乾燥。乾燥後的hSA蛋白質晶體便可進行儲存，比如在室溫儲存以長期使用，並可隨意運輸。一些實施方案中，乾燥後的結晶hSA可再溶於適當的溶劑(例如水)。
另一方面，本發明的特點是一種將hSA從其他不同物種的血清白蛋白相分離的方法。該方法包括獲得還含有其他物種血清白蛋白的hSA樣品；將hSA樣品上樣到親和柱，相對於與其他物種血清白蛋白的結合，該親和柱對hSA具有更高的結合親和力；將hSA從親和柱上洗脫；並且將洗脫的hSA進行結晶。
一些實施方案中，樣品從非人類動物上獲得。該動物可以是哺乳動物，例如有蹄類動物(例如牛、山羊或綿羊)、豬或者兔。樣品可以從例如哺乳動物的乳汁、血液或者組織(例如組織勻漿)中獲得。其他實施方案中，樣品從鳥類如雞、火雞、鴨子、野雞或者鴕鳥中獲得。舉例來說，樣品可獲自鳥類的卵、血液或者組織(例如組織勻漿)。優選實施方案中，該動物為轉基因動物。優選實施方案中，該動物為哺乳動物，且樣品為乳汁，例如從轉基因哺乳動物中獲得的乳汁。
其他實施方案中，樣品為培養的細胞如哺乳動物細胞、鳥類細胞、魚類細胞或者昆蟲細胞的培養基。在一些實施方案中，培養的細胞是轉基因細胞。舉例來說，培養的細胞可含有在合適調控元件控制下的編碼hSA的核酸序列的轉基因。
一些實施方案中，本發明方法中使用的樣品為通過例如離心之類標準脫脂質程序已除去脂質的乳汁。
在相關實施方案中，本發明方法中使用的樣品為經過除酪蛋白處理的乳汁(例如脫脂乳汁)。舉例來說，通過降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉澱物可以將乳汁中酪蛋白去除。在優選實施方案中，通過加酸將乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之類的稀酸。在優選實施方案中乳汁的pH值降至約4.2至4.8。在一些實施方案中，從乳汁中通過過濾除去酪蛋白的重沉澱物，例如使用切向流微過濾法。其他實施方案中，從乳汁中通過離心除去酪蛋白的重沉澱物。在另一些其他實施方案中，不使用酸性沉澱酪蛋白，通過切向流過濾將酪蛋白從樣品中除去。
一些實施方案中，本發明方法中使用的樣品可以是已去除酪蛋白的脫脂質乳汁。此處該樣品稱為「澄清的乳汁樣品」。
優選的實施方案中，將hSA樣品上樣至親和柱，從親和柱上洗脫和/或按此處描述將其結晶。
另一方面，該發明包括一種包含hSA和非人類哺乳動物血清白蛋白的組合物，其中非人類哺乳動物的血清白蛋白的濃度低於5、4、3、2或者1ppm。優選實施方案中，hSA和非人類哺乳動物的血清白蛋白的比例低於1∶1,000、1∶10,000、1∶100,000。
附圖簡述

圖1描繪的是一種具有染料配基的層析樹脂，包括染料活性藍2，該染料已知與血清白蛋白結合。R基團可以由數種不同化合物，例如-NH-C6H4-(間位)SO3H，-NH-C6H4-(鄰位)SO3H，或者其混合物取代。載體為瓊脂糖。
發明詳述脫脂乳汁通過離心之類標準脫脂質程序將獲自轉基因哺乳動物的乳汁樣品進行脫脂。此處「脫脂質乳汁」這個術語指的是撇去脂皮的乳汁。其他已知的方法包括將乳汁撇脂皮和/或沉澱方法來獲得脫脂質樣品，參見例如H.E.Swaisgood，Developments in Dairy Chemistry，IChemistry of Milk Protein，Applied Science Publishers，NY，1982.
從樣品中去除酪蛋白本發明方法包括減少乳汁樣品，例如脫脂質乳汁樣品中酪蛋白水平。優選，在與進行該步驟之前樣品中酪蛋白的水平相比，該步驟能使樣品中酪蛋白的水平至少降低70％、80％、90％、95％甚至更多。
使用本領域熟知的不同方法可以減少樣品中的酪蛋白水平。舉例來說，可以通過酸沉澱減少樣品的酪蛋白水平。優選該酸為稀酸。可用於沉澱樣品中酪蛋白的酸有例如乙酸、硫酸以及磷酸。優選該酸為乙酸。通過向樣品中加入酸，樣品的pH值降至約4.0至5.5、約4.1至5.2、約4.2至5.0或約4.2至4.8。酸化的樣品然後即可進行離心或者切向流過濾來除去已沉澱的酪蛋白。在如U.S.專利號4,644,056中對酸沉澱酪蛋白有進一步詳細的描述。
可使用標準臺式離心機在約2500至500×G的條件下進行離心。另外，可以使用例如Alfa Laval或者Westphalia連續流盤疊離心機進行離心。這些後面所說的離心機尤其適於進行大量離心。
酸化的樣品可進行切向流過濾，將樣品通過帶有足夠孔徑濾膜的橫向流動濾器，可至少擋住沉澱的酪蛋白的一部分(「滯留物」)，同時讓含有hSA的樣品(「滲透物」或者「濾出液」)通過該濾膜。在切向流過濾中，要過濾的樣品與膜狀濾器平行流動，且濾出液穿過濾器。優選，膜為一層空心纖維濾筒，孔徑大小平均約為0.08至1.2μm。市面上可購得的膜孔徑平均為約0.1至1.2μm。舉例來說，優選實施方案中可使用Ceramem 0.2μm陶瓷塊。其他實施方案中，空心纖維濾筒為A/G Technologies 750K截流空心纖維。切向流過濾法的實例可在如U.S.專利號4,644,056中找到。
其他實施方案中，可以不將樣品酸化而將樣品酪蛋白水平降低。舉例來說，可以將樣品通過U.S.專利號6,268,487中所闡述的切向流微過濾法處理。
不管樣品在進行切向流過濾之前酸化與否，至少一部分的酪蛋白會被膜所滯留，而大部分的hSA仍留在濾出液中。優選條件下，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％甚至樣品中更多的hSA在經過切向流過濾後會保留在濾出液中。該濾出液隨後可用於下一步對hSA進行純化。
親和層析可以用多種途徑進行親和層析，並可使用化學合成樹脂(例如染料配基樹脂)或者蛋白質偶聯樹脂(例如抗體偶聯樹脂)。參見例G.Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，NewYorkAcademic Press 1992。當決定選用何種樹脂純化如hSA之類的目的蛋白質時，需要考慮的關鍵參數包括製造親和柱的成本、柱的可測量性、柱的瞬時質量(temporal quality)(即在重複使用後用柱純化所得產物的質量)。蛋白偶聯樹脂(例如抗體偶聯或者肽結合區域偶聯樹脂)對目的分子具有高的結合特異性，通常其結合常數可達到約10-7至10-10M，但是受限於其成本、可測量性以及壽命。另外，有時目的蛋白質一旦結合到蛋白質偶聯樹脂上後，處理程序上如果不破壞樹脂則難以將目的蛋白質回收。化學合成樹脂往往比蛋白質偶聯樹脂價格低廉，更易擴大規模，壽命更長，但往往特異性較低，其結合常數約為10-5至10-9M。
在本發明方法中使用的親和柱可包括化學合成樹脂或蛋白質偶聯樹脂。優選，親和柱包括化學合成樹脂。化學合成樹脂的配基和hSA的親和力至少要達到10-5M，且更優選至少達到10-6M，甚至達到10-7M或更低值。適於在本發明方法中使用的柱為Cibacron Blue 3GA柱，該產品在市面上廣為出售，具有如圖1所示的結構，其中R基團為以下結構的混合物-NH-C6H4-(間位)SO3H，和-NH-C6H4-(鄰位)SO3H。另一適於本發明方法的柱為Prometic Biosciences Blue SA柱，該產品為染料配基柱家族中的一員，具有如圖1所示的樹脂結構。一方面來看，染料配基柱為Cibacron Blue 3GA柱的變體之一，其中的R基團不是混合物而是單一的-NH-C6H4-(間位)SO3H或者-NH-C6H4-(鄰位)SO3H成分。優選，化學合成樹脂與hSA的親和力比它與其他血清白蛋白親和力高至少2、5、10、20、50甚至100倍，其他血清白蛋白例如BSA一類的非人類哺乳動物血清白蛋白。
適合將含hSA的樣品上到親和柱的上樣緩衝液取決於特定的柱。另外，本領域的技術人員會認識到對於任何特定柱均有多種適於hSA樣品上樣的緩衝液。對Prometic Biosciences Blue SA柱優選的上樣緩衝液包括如pH為8-9的50至250mM鹽(例如NaCl或KCl)，以及低濃度的非離子去垢劑(例如0.01％至0.1％聚山梨醇酯20，即Tween 20)。澄清的hSA樣品在加到柱上之前優選進行滲濾(diafilter)，將澄清的hSA樣品的緩衝液替換成合適的柱上樣緩衝液。澄清的hSA樣品還可以進行過濾以增加樣品中hSA蛋白質的濃度。
合適的柱清洗緩衝液基本上與適用的上樣緩衝液相同(比如等同於)。清洗緩衝液中存在的去垢劑(例如聚山梨醇酯20)有助於從柱(例如Prometic Biosciences Blue SA柱)上除去非人血清白蛋白(例如BSA)，而hSA和柱的結合不受影響。
類似地，將hSA從與之結合的柱上洗脫的洗脫緩衝液依賴於柱的原本屬性。本領域的技術人員會認識到，同樣也存在多種不同的洗脫緩衝液適合從特定的與hSA結合的柱上將其洗脫。對於PrometicBiosciences Blue SA柱來說，合適的洗脫緩衝液包括如pH為5至7的30至50mM磷酸鹽(例如磷酸鉀和磷酸鈉的混合物)，優選pH值為5.5至6.5，以及10-30mM辛酸鹽。其他脂肪酸分子可以用來代替辛酸鹽，包括如，短鏈、中等鏈或者長鏈脂肪酸，例如硬脂酸鹽、月桂酸鹽、豆蔻酸鹽和油酸鹽。優選，和其他結合在柱上的非血清白蛋白蛋白質(例如，血蛋白，乳蛋白，或組培培養蛋白質)相比，特定洗脫緩衝液洗脫hSA更容易，洗脫力是前者的2、5、10、20、50、100甚至更高倍。
如上面所討論的，蛋白質偶聯親和柱也可以用於本發明方法。將hSA從含有其他非人類血清白蛋白(例如，非人類血清白蛋白如BSA)樣品中純化的典型蛋白質偶聯親和柱含有重組的白蛋白結合區(ABD)蛋白質，該蛋白質固定在交聯的瓊脂糖樹脂上。重組的白蛋白結合區蛋白質在Johansson等人，J.Mol.Biol.1997，266859-865中有描述。優選條件下，ABD柱對hSA的親和力至少比對其他血清白蛋白的親和力強10、20、50、100、500甚至1000倍，其他血清白蛋白如非人類哺乳動物血清白蛋白，例如BSA。
適用於ABD偶聯柱的平衡和清洗緩衝液可包括如pH4.5至6.5的10-50mM乙酸鹽，優選pH值為約5.0至6.0，以及50-250mM鹽，優選濃度為100-150mM。可包含的鹽有如NaCl或KCl。上樣之前，澄清的hSA樣品應調節到pH為4.5至6.5，優選pH值為5.0至6.0。可通過加酸(例如稀硫酸或磷酸)完成，或者根據hSA樣品的pH值，用鹼調節(例如稀NaOH)或通過緩衝液交換(例如滲濾)將緩衝液換成平衡和衝洗緩衝液。該澄清的hSA樣品在上樣到柱上之前還可進行過濾以增加hSA蛋白質的濃度。使用低pH緩衝液，比如pH值為2.3至2.8，優選2.5左右，可以將hSA從ABD偶聯柱上洗脫。洗脫緩衝液可包括25至100mM甘氨酸或者0.2至1.0M乙酸。優選，所用洗脫緩衝液洗脫hSA比洗脫結合在柱上非血清白蛋白容易2、5、10、20、50、100甚至更多倍。
優選，洗脫液中至少能回收加到親和柱上的樣品中的hSA的85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％甚至更多。類似地，優選洗脫液中非hSA蛋白質雜質的濃度降低為加到親和柱上的hSA樣品中的五分之一、十分之一、一百分之一、一千分之一甚至更低。此類雜質包括非hSA血液蛋白質(例如凝固蛋白質、脫輔基脂蛋白質、生長因子)、乳汁蛋白質(例如非人類哺乳動物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之類的抗體)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者為條件細胞培養基中的常見蛋白質(例如BSA或生長因子)。
作為本發明方法的一部分親和層析步驟可選重複。這種情況下過一次柱的洗脫液只要進行滲濾將洗脫緩衝液換成合適的柱上樣緩衝液。滲濾之前洗脫液可選進行過濾以減少樣品中脂肪酸的量並濃縮hSA。在本發明方法中重複親和層析步驟時可使用多個親和柱。舉例來說，可將化學合成樹脂柱(例如Cibacron Blue 3GA柱或PrometicBiosciences Blue SA柱)和蛋白質偶聯柱(例如ABD柱)結合使用。柱的使用順序並不重要，不過優選先使用化學合成樹脂柱以儘量延長蛋白質偶聯柱的使用壽命。
一些實施方案中，本發明方法包括連續進行親和層析，例如在模擬移動床系統上進行。
結晶此處所用「結晶的hSA」指的是hSA區別於其不定型固體狀態的晶體固體狀態。晶體的特徵在於具有晶格結構、特徵晶型，以及諸如折射率這樣的光學特性。可以通過以下方法測定hSA是否為晶體光學顯微技術、電子顯微技術、x-射線粉末衍射、固體核磁共振(NMR)或者偏振光顯微技術。顯微技術除了可以用來測定晶體以單晶或多晶形式存在以外，還可以測定晶體長度、直徑、寬度、大小和形狀。
可以通過向含有hSA的溶液(例如親和純化的hSA樣品)中加入鹽、PEG和/或者有機溶劑來形成hSA晶體。可用來結晶hSA的無機鹽包括硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉(例如磷酸氫二鈉和/或磷酸二氫鈉)、磷酸鉀(例如，磷酸二氫鉀和/或偏磷酸鉀)或者其混合物。用於結晶hSA的無機鹽優選磷酸鈉和/或磷酸鉀。可以同無機鹽一起向hSA樣品中加入脂肪酸分子(例如辛酸鹽或其他中等鏈或長鏈脂肪酸)促進結晶。舉例來說，在5-15℃時向hSA樣品中逐漸加入含有pH為6.2的4M磷酸鹽(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30體積比的混合物)和1至3mM辛酸鹽的溶液。磷酸鹽終濃度達到約2.7M至2.8M時hSA的結晶開始形成。
優選，在結晶樣品中的hSA至少有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％甚至更多得到回收，例如在重新溶解的樣品中。另外，優選，結晶的hSA樣品中非hSA蛋白質濃度在重新溶解後減少1、2、3、4、5、10、20甚至更多倍。此類雜質包括非hSA血液蛋白質(例如凝固蛋白質、脫輔基脂蛋白質、生長因子)、乳汁蛋白質(例如非人類哺乳動物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之類的抗體)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者為條件細胞培養基中的常見蛋白質(例如BSA或生長因子)。
hSA晶體可以從母液中分離，比如使用漏鬥(例如布氏漏鬥或同類裝置)，並用如pH為6.2的2.8M磷酸鹽緩衝液清洗。分離出的hSA晶體可以乾燥並儲藏。或者將分離出的hSA晶體再溶解在合適的溶劑中，比如水或者適用於腸胃外用藥的稀鹽溶液(例如NaCl)。
儲存在純化過程中不同時刻均可將純化的hSA進行過濾(例如無菌過濾)並且在無菌容器中儲存。儲存時間長(數日或數月)，而且便於運輸。舉例來說，經過澄清(即去除脂質以及其他步驟，就如乳汁脫脂和脫酪蛋白)、親和柱純化、結晶，或用活性炭處理hSA之後進行儲存。
腸胃外製劑按此處描述所製備的hSA樣品可以結合到藥物組合物中。此類組合物的特點是包含hSA和藥用載體。此處的術語「藥用載體」包括溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑以及諸如此類與藥物施用相兼容的物質。藥物組合物中也可以結合補充的活性成分。
藥物組合物的設計要與其施用的預期途徑相兼容。對hSA優選的施用途徑為腸胃外施用。用於腸胃外應用的溶液或懸浮液可包括以下組分滅菌稀釋劑諸如注射用水、鹽溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘氨酸、丙二醇或者其他合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩衝液可為乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽以及諸如氯化鈉或葡萄糖之類調節張力的試劑。可以通過如鹽酸或氫氧化鈉之類的酸或鹼調節pH值。腸胃外製劑可用安瓿瓶、一次性注射器或者玻璃質或塑料質的多劑量藥瓶封裝。
將腸胃外組合物配製成劑量單位形式更利於方便施用和劑量統一化。此處所用劑量單位形式指的是適合治療對象使用的單元劑量的物理獨立單位；每單位包含據計算可產生預期療效並與必需藥物載體相連的預定量的hSA。
實施例實施例1從轉基因牛乳汁中純化hSA從含有重組hSA產物的去脂質(脫脂)轉基因乳汁開始，用乙酸(10-15％)將產物流酸化至pH4.2至4.8以沉澱酪蛋白。用切向流微過濾除去沉澱的酪蛋白，使用標準TFF系統，其帶有包括Ceramem0.2μm陶瓷塊或A/G Technologies 750K截流空心纖維的濾筒。
產物使用Prometic Biosciences Blue SA柱進行親和層析純化。上樣/清洗緩衝條件含有pH8-9的50-250mM離子強度的NaCl以及低濃度聚山梨醇酯20(Tween 20)。產物用含有10-30mM辛酸鹽pH為5.5-6.5的20-50mM磷酸鹽緩衝液洗脫。
在批量反應箱中進行產物結晶，在5-15℃控制加入pH為6.2的4M磷酸鹽(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30體積比的混合物)和1至3mM辛酸鹽，至磷酸鹽終濃度為2.7-2.8M。使用布氏漏鬥過濾將晶體與母液分離，用2.8M磷酸鹽緩衝液清洗，按前面所述方法製備並重新溶解於水。結果如下表格1所示。
表格1
通過個別蛋白質ELISA分析進行純度測定。
ppm-百萬分之(每克hSA中雜質的微克量)BSA-牛血清白蛋白BLG-β-乳球蛋白ALA-α-乳清蛋白IgG-γ-球蛋白G實施例2使用兩種不同親和柱純化hSA從含有重組hSA產物的去脂質(脫脂)轉基因乳汁開始，樣品按實施例1中所述方法酸沉澱酪蛋白而澄清。隨後按前面所述進行染料配基親和層析。
最後，對染料配基親和純化的洗脫液進行ABD蛋白質配基層析。使用的ABD柱平衡和清洗緩衝液含有pH5.0-6.0的10-50mM乙酸以及100-150mM NaCl。上樣至ABD柱之前，加入烯酸將hSA樣品pH值調節至5.0-6.0。使用pH為2.5的25-100mM甘氨酸緩衝液將hSA洗脫。純化結果如表格2所示。
表格2工序 代表性步驟hSA產量 ppm bSAppm IgG澄清的樣品流 99％ 2×1041×104染料配基層析 95％ 30030ABD蛋白質配基層析 95％ 3 3此處引用的出版物和專利的內容歸入參考文獻。
權利要求
1.一種從含有人血清白蛋白(hSA)和宿主細胞血清白蛋白的樣品中純化hSA的方法，包括從宿主細胞獲得含有hSA和宿主細胞血清白蛋白的樣品；上樣至親和柱，該親和柱結合hSA的親和力高於與宿主細胞的血清白蛋白的結合親和力；從親和柱上洗脫結合的hSA；和將洗脫下的hSA結晶。
2.權利要求1中所述方法，其中樣品從轉基因非人類動物中獲得。
3.權利要求2中所述方法，其中動物選自牛、綿羊、山羊、豬、小鼠和兔。
4.權利要求2中所述方法，其中樣品從哺乳動物的乳汁、血液或組織中獲得。
5.權利要求1中所述方法，其中樣品為用於培養細胞的培養基。
6.權利要求2中所述方法，其中樣品獲自其乳腺上皮細胞產hSA的轉基因哺乳動物的乳汁。
7.權利要求6中所述方法，其中方法還包含將乳汁樣品脫脂質。
8.權利要求6中所述方法，其中方法還包含對乳汁樣品進行除酪蛋白處理。
9.權利要求8中所述方法，其中通過酸沉澱、離心或切向流過濾去除酪蛋白。
10.權利要求6中所述方法，其中樣品為澄清的乳汁樣品。
11.權利要求10中所述方法，其中澄清的乳汁樣品在鹽緩衝液中。
12.權利要求11中所述方法，其中鹽緩衝液包含pH為8.5的250mMNaCl和低濃度的非離子去垢劑。
13.權利要求11中所述方法，其中親和柱包含合成配基樹脂。
14.權利要求13中所述方法，其中合成配基樹脂使用染料活性藍2或者被修飾的染料活性藍2作為配基。
15.權利要求1中所述方法，其中與其結合hSA的親和力相比，該親和柱與宿主細胞血清白蛋白基本不結合。
16.權利要求1中所述方法，還包含上樣到柱上後對親和柱進行清洗。
17.權利要求16中所述方法，其中清洗緩衝液包含pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
18.權利要求1中所述方法，其中使用洗脫緩衝液將hSA從親和柱上洗脫下來，該緩衝液基本不引起結合親和柱的非血清白蛋白蛋白質的洗脫。
19.權利要求18中所述方法，其中洗脫緩衝液包含磷酸緩衝液和與柱上親和配基競爭結合hSA的脂肪酸分子。
20.權利要求19中所述方法，其中洗脫緩衝液包含pH約為6.0的20-50mM磷酸。
21.權利要求19中所述方法，其中脂肪酸分子為辛酸鹽。
22.權利要求1中所述方法，還包含將親和純化的hSA樣品上樣到親和柱或是第二根親和柱，清洗結合hSA的親和柱並且洗脫親和柱上結合的hSA，從而獲得兩次親和純化的hSA樣品。
23.權利要求1中所述方法，其中通過向樣品中加入結晶劑使結合的hSA結晶。
24.權利要求23中所述方法，其中結晶劑選自聚乙二醇(PEG)、硫酸銨、磷酸鹽或其混合物。
25.權利要求23中所述方法，其中結晶劑為磷酸鹽，且加至終濃度為2.7至2.8M。
26.權利要求23中所述方法，其中結晶劑還包含與hSA結合的脂肪酸分子。
27.權利要求27中所述方法，其中脂肪酸分子為辛酸鹽。
28.權利要求1中所述方法，其中從結晶溶液中將結晶的hSA分離出來。
29.包含按權利要求1中所述方法製成的hSA的組合物。
全文摘要
本發明涉及從生產人血清白蛋白(hSA)的宿主細胞的內源血清白蛋白中純化hSA的方法。該方法包括提供含hSA及宿主細胞的血清白蛋白的樣品，將樣品上樣到親和柱上，該柱結合hSA的親和力大於其結合宿主細胞血清白蛋白的親和力，從親和柱上洗脫結合的hSA，並將洗脫的hSA結晶，本發明還涉及包含由本發明的方法生產的hSA的組合物。
文檔編號C07K14/765GK1525977SQ02813703
公開日2004年9月1日 申請日期2002年6月13日 優先權日2001年6月13日
發明者S·富爾頓, S 富爾頓 申請人:陶洛斯Hsa有限責任公司