一種中性蛋白酶及其基因和應用的製作方法
2023-05-21 05:58:17
本發明涉及生物工程領域，具體地，本發明涉及生物工程技術領域，尤其是一種中性蛋白酶及其基因和應用。
背景技術：
蛋白酶是一類可水解蛋白質肽鏈的酶。中性蛋白酶屬於其中一種內切酶，可水解處理各種蛋白質肽鍵，釋放胺基酸或者多肽，其最適ph值為7.0左右。中性蛋白酶具有無工業汙染、催化反應速度快、反應條件適應性寬等優點，因此在眾多行業中都有應用，例如皮革、紡織、化工、食品、醫藥等，具有重要的工業價值。
中性蛋白酶在動、植物，微生物中都廣泛存在。而與其他來源相比，微生物來源的蛋白酶無論在培養條件、生產成本控制還是在製備規模上都有著極大的優勢。其中以細菌蛋白酶居多，特別是芽胞桿菌屬細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。
近幾十年來，隨著科學技術的發展，酶的製備、酶分子改造等酶學技術飛速發展，中性蛋白酶的生產與應用範圍也不斷擴大。自上世紀以來，世界各國研究者一直都致力於中性蛋白酶的生產菌株篩選、酶提取、純化以及酶學性質的研究和應用工作，並且取得了一定成績。
當前，我國中性蛋白酶的研究總體水平仍處於初級階段，從事中性蛋白酶生產與銷售的酶製劑企業並不是很多，而且採用的生產菌株大多為上世紀八十年代所開發的誘變菌株，產酶能力下降、不穩定、容易受到酵母及噬菌體的汙染，對生產造成一定損失。近些年來隨著基因工程技術的不斷發展，人們開始藉助基因工程改造來獲得中性蛋白酶生產菌株。這些菌株具有產量高、生產周期短、成本低等優點。
目前中性蛋白酶市場需求量比較大，但是現有中性蛋白酶生產菌株的生產水平有待提高，亟待研發出中性蛋白酶的高效表達菌株。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種中性蛋白酶及其基因、工程菌(重組菌株)和製備方法。
本發明的另一目的是提供一種製備上述中性蛋白酶的基因工程方法。
本發明的另一目的提供上述中性蛋白酶及基因工程菌的應用。
本發明從枯草芽孢桿菌crvab200(bacillussubtilis)中分離得到一種新的中性蛋白酶。
本發明提供了一種中性蛋白酶，其胺基酸序列如seqidno.1所示：
本發明的中性蛋白酶含532個胺基酸，具有良好的熱穩定性以及ph穩定性。其最適溫度為50℃，在30-70℃之間相對酶活達到80％以上，甚至在80℃保溫1h後仍有65％的剩餘酶活；其最適ph值為7.0，在ph值6.5-8.0時，相對酶活達到將近80％。
本發明還提供了編碼上述中性蛋白酶的基因，具體地，該基因的鹼基序列如seqidno.2所示：
本發明通過pcr的方法分離克隆了所述中性蛋白酶的編碼基因，dna全序列分析結果表明，中性蛋白酶的編碼基因全長1599bp。將中性蛋白酶的編碼基因經序列比對後發現與genbankaccessionnumber為cp020102.1的中性蛋白酶基因相似度達98％，為一新的中性蛋白酶。
本發明還提供了包含上述中性蛋白酶基因的重組載體，優選為包含上述中性蛋白酶基因的重組質粒pwb980。所述重組質粒pwb980還含有kan抗性基因、p43啟動子序列、spsacb信號肽序列、枯草芽孢桿菌終止子序列；本發明所述中性蛋白酶基因位於重組質粒pwb980的spsacb信號肽序列和枯草芽孢桿菌終止子序列之間。
本發明還提供了包含上述中性蛋白酶基因的重組菌株，優選所述重組菌株為解澱粉芽孢桿菌k1(bacillusamyloliquefaciens)。
本發明還提供了一種製備上述中性蛋白酶的方法，包括以下步驟：
1)用上述包含本申請中性蛋白酶的編碼基因的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株使其發酵，誘導重組中性蛋白酶表達；
3)回收並純化所表達的中性蛋白酶。
其中，優選所述宿主細胞為解澱粉芽孢桿菌，優選將重組表達質粒轉化解澱粉芽孢桿菌，得到重組菌株。
所述發酵培養基可以為本領域公知的可以使用的任意培養基，優選為液體培養基，進一步優選地，液體培養基主要成分包括：20-40g/l的玉米粉，20-40g/l的豆餅粉，30-50g/l的麩皮，0.2-0.5g/l的磷酸二氫鉀，3-5g/l的磷酸氫二鈉，其餘為水。
所述發酵溫度為29.5℃-35℃，優選30℃。
本發明還提供了上述中性蛋白酶的應用。優選地，提供上述中性蛋白酶在飼料、食品、醫藥等工業領域中的應用，特別是在上述領域中降解蛋白的應用。
本發明中的中性蛋白酶，具有良好的熱穩定性以及ph穩定性。其最適溫度為50℃，在30-70℃之間相對酶活達到80％以上，甚至在80℃保溫1h後仍有65％的剩餘酶活；其最適ph值為7.0，在ph值6.5-8.0時，相對酶活達到將近80％。本發明的中性蛋白酶可應用於飼料、食品、醫藥等工業領域。
本發明運用基因工程技術構建了含有中性蛋白酶基因的重組質粒，並在解澱粉芽孢桿菌中實現了中性蛋白酶的高效表達。構建的中性蛋白酶重組菌株具有較高的應用價值，具有很高的產中性蛋白酶的能力，在同等發酵條件下，較野生菌酶活提高了近90％。
附圖說明
圖1為本發明實施例1中性蛋白酶基因的pcr擴增電泳圖，其中：1、為中性蛋白酶基因片段，2、為dna分子量標準；
圖2為本發明重組質粒pwb980-npr結構示意圖；
圖3為本發明重組中性蛋白酶最適溫度；
圖4為本發明重組中性蛋白酶熱穩定性；
圖5為本發明重組中性蛋白酶最適ph值；
圖6為本發明重組中性蛋白酶ph穩定性。
具體實施方式
試驗材料和試劑
1、菌株及載體
表達載體pwb980購自於invitrogen公司；枯草芽孢桿菌株168購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(cicc)；解澱粉芽孢桿菌k1由土壤中分離。
2、酶類及其它生化試劑
酶類及其它生化試劑：內切酶購自takara公司，連接酶購自invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-l-arabionfuranoside(pnpaf)購自sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施例1、中性蛋白酶基因的獲得
枯草芽孢桿菌crvab200是在水庫附近採集的土壤樣品中分離得到。具體為將土壤樣品溶於無菌水中，經富集培養後取合適稀釋梯度塗布於含1％脫脂牛奶的平板上，根據平板上透明圈的大小篩選得到。
提取枯草芽孢桿菌crvab200(bacillussubtilis)基因組dna：
(1)取0.5-2ml培養菌液，10000rpm，離心30s，儘可能的吸取上清，收集菌體；
(2)ep管中加200μl緩衝液rb重懸，10000rpm離心30s，棄上清；
(3)對於革蘭氏陽性菌：加入120μl溶菌酶，顛倒混勻，37℃水浴30-60min；
(4)12000rpm離心2min，棄上清後將細胞振蕩或者吹打重懸於180μl緩衝液rb中；
(5)加rnasea(25mg/ml)溶液20μl，振蕩混勻，室溫放置5-10min；
(6)加結合液cb800μl，再加入100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能出現絮狀沉澱；
(7)將上一步混合物(包括可能有的沉澱)加入一個吸附柱ac中，吸附柱放入收集管中，13000rpm離心30-60s，棄掉廢液；
(8)加抑制物去除液ir500μl，12000rpm離心30s，棄廢液；
(9)加入700μl漂洗液wb，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；
(10)加入500μl漂洗液wb，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；
(11)將吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm離心2min，儘量除去漂洗液，一面漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應；
(12)取出吸附柱ac，放入一個乾淨的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩衝液eb，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min；
(13)得到的dna於-20℃保存。
以上述基因組dna為模板進行pcr擴增中性蛋白酶基因。擴增引物為：上遊引物：5』-gcgcaactcaagcttttgccttgcgcaacttgaccaagacatctc-3』；下遊引物：
5』-tcttggaattgtgctgaagctagcttatagaatgccgacagcctc-3』。pcr擴增得到約1600bp大小的dna片段，該片段回收後與peasy-t3載體進行連接後送測序。經過基因測序得到1599bp的基因片段(seqidno.2)，經序列比對後發現與genbankaccessionnumber為cp020102.1的中性蛋白酶基因相似度達98％。
實施例2、中性蛋白酶表達載體pwb980-npr的構建
以枯草表達質粒pwb980為模板進行pcr擴增載體片段。擴增引物為：上遊引物：5』-gctagcttcagcacaattccaagaaaaac-3』；下遊引物為：5』-ggcaaaagcttgagttgcgcctcctgccag-3』。pcr擴增得到約3738bp大小的載體dna片段，片段回收後與上述中性蛋白酶基因片段進行多聚物融合pcr(youc,zhangxz,zhangyh(2012)simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis.applenvironmicrobiol78:1593–1595)，融合產物轉化枯草芽孢桿菌b.subtilis168感受態細胞，塗布在含卡那黴素(25μg/ml)的lb平板上，挑選陽性轉化子，提取質粒測序驗證，確定成功獲得重組質粒pwb980-npr。
實施例3、表達載體pwb980-npr轉化解澱粉芽孢桿菌k1
解澱粉芽孢桿菌感受態細胞製備方法如下所述：
(1)接種解澱粉芽孢桿菌k1於5mllb培養基中，過夜培養。
(2)取2.5ml過夜培養物接入40ml(lb+0.5m山梨醇)中，37℃，200rpm振蕩培養至od600為0.6-0.8之間。
(3)將菌液冰水浴10min，然後5000g，4℃離心5min，收集菌體。
(4)用50ml預冷的電轉培養基(0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，10％葡萄糖)重懸菌體，5000g，4℃離心5min，去上清，如此漂洗4次。
(5)將洗滌後的菌體重懸於1ml電轉培養基中，分裝於ep管，每管分裝60μl。
轉化條件如下所述：
(1)將50ng質粒dna(1-8μl)加入到60μl感受態細胞中，冰上孵育2min，加入預冷的電轉杯(1mm)中，電擊。電轉化參數設置：2.0kv、1mm、電擊1次。
(2)電擊完畢立即加入1ml復甦培養基(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)
(3)37℃搖床振蕩培養3h，培養物塗布在lb平板上，37℃培養24-36h，挑取陽性轉化子，獲得重組解澱粉芽孢桿菌k1/pwb980-npr。
實施例4、重組解澱粉芽孢桿菌k1/pwb980-npr獲取中性蛋白酶的方法
將實施例3中獲得的重組解澱粉芽孢桿菌k1/pwb980-npr和枯草芽孢桿菌bacillussubtiliscrvab200(野生菌)劃線活化。活化培養基為lb平板。挑取單菌落至裝有25mllb的250ml搖瓶中，37℃，220rpm震蕩培養8-10小時，培養物作為種子液。
將上述種子液按照10％(v/v)接種量接種於裝有50ml發酵培養基的500ml搖瓶中，30℃，220rpm振蕩培養，發酵76h。
上述發酵培養基成分為：35g/l的玉米粉，35g/l的豆餅粉，30g/l的麩皮，0.3g/l的磷酸二氫鉀，4g/l的磷酸氫二鈉，其餘為水。
取上述搖瓶發酵液，12000rpm離心10min去除沉澱，測量上清液中的酶活。酶活力單位定義：在一定溫度和相應的ph條件下(ph7.2)，在1min內水解酪蛋白產生相當於1μg酚基胺基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量，即為1個酶活力單位，以u表示(中華人民共和國國家標準，gb/t28715-2012)。
結果表明，發酵72小時，重組解澱粉芽孢桿菌k1/pwb980-npr的酶活達到9000u/ml，而野生菌酶活為4736u/ml，重組解澱粉芽孢桿菌k1/pwb980-npr的酶活比野生菌提高近90％。
實施例5、重組中性蛋白酶的酶學性質分析
(1)溫度對本發明中性蛋白酶酶活力的影響
①最適溫度的測定：在ph7.2條件下，在不同溫度下測定酶活，最高酶活力定為100％。結果表明(圖3)，重組中性蛋白酶的最適溫度為50℃，在30-70℃之間相對酶活為80％以上。
②熱穩定性的測定：重組中性蛋白酶分別在不同溫度下保溫2h，每隔20min在ph7.2條件下測定其殘餘酶活力，未保溫的酶活力定為100％。結果表明(圖4)，重組中性蛋白酶在50-70℃條件下保溫1h剩餘酶活在80％以上，保溫2h剩餘酶活在60％以上；甚至在80℃保溫1h後仍有65％的剩餘酶活，說明該酶具有良好的熱穩定性。
(2)ph對本發明中性蛋白酶酶活力的影響
①最適ph的測定：在40℃條件下，在不同ph下測定酶活，最高酶活力定為100％。結果表明(圖5)，重組中性蛋白酶最適ph為7.0，在ph6.5-8.0之間相對酶活達到80％以上。
②ph穩定性的測定：將重組酶在不同ph條件下在40℃保溫1h，測定其剩餘酶活力，相應ph下未保溫的酶活力定為100％。結果表明(圖6)，重組中性蛋白酶在ph6.0-8.5範圍內剩餘酶活力達到80％以上，說明該酶具有良好的ph耐受性。
當然，本發明還可以有多種實施例，在不背離本發明精神及其實質的情況下，熟悉本領域的技術人員可根據本發明的公開做出各種相應的改變和變形，但這些相應的改變和變形都應屬於本發明的權利要求的保護範圍。
北京科為博生物科技有限公司
一種中性蛋白酶及其基因和應用
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