具有釋放生長激素特性的化合物的製作方法

2023-05-20 16:01:16

專利名稱：具有釋放生長激素特性的化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的化合物、其藥學上可接受的鹽、含有它們的組合物和它們用於治療由缺乏生長激素引起的醫學病症的用途。
背景技術：
生長激素是一種刺激所有能夠生長的組織生長的激素。此外，已知生長激素對代謝過程具有許多作用，例如刺激蛋白質合成和游離脂肪酸移動並且引起碳水化合物至脂肪酸代謝的能量代謝的轉換。生長激素缺乏可能導致許多嚴重的醫學病症，例如侏儒症。
生長激素從腦垂體中釋放。該釋放是在許多激素和神經遞質直接或者間接地緊緊控制之下。生長激素的釋放可以通過生長激素釋放激素(GHRH)刺激以及通過生長素抑制素來抑制。在這兩種情況下，激素均從丘腦下部釋放，但是它們的作用主要通過位於腦垂體中特定的受體調節。其他刺激生長激素從腦垂體中釋放的化合物也有描述。例如精氨酸、L3，4二羥基苯丙氨酸(L-多巴)、高血糖素、後葉加壓素、PACAP(腦垂體腺苷醯基環化酶激活的肽)、蕈毒礆受體激動劑以及合成的六肽、GHRP(釋放生長激素的肽)或者通過直接作用於腦垂體上或者通過影響GHRH和/或生長素抑制素從丘腦下部中釋放內生的生長激素。
在希望增加生長激素水平的病症或狀況中，生長激素的蛋白質性能使得除了腸胃外給藥之外任何方式均不可行。此外，其他直接作用的天然的促分泌劑例如GHRH和PACAP是較長的多肽，據此理由優選腸胃外給藥。
以前曾建議使用一些化合物用於增加哺乳動物中生長激素的水平，例如在EP 18 072、EP 83 864、WO 8302272、WO 8907110、WO 8901711、WO 8910933、WO 8809780、WO 9118016、WO 9201711、WO 9304081、WO 9413696、WO 9517423、WO 9514666、WO 9615148、WO 9622997、WO 9635713、WO 9700894、WO 9722620、WO 9723508、WO 9740023和WO 9810653中建議的。
釋放生長激素化合物的組合物對於它們的生長激素釋放能力以及它們的生物可利用率是重要的。因此本發明目的在於提供具有釋放生長激素特性的新的化合物。此外，本發明的目的在於提供新的釋放生長激素的化合物(生長激素促分泌劑)，其是特異性的和/或有選擇性的並且沒有或基本上沒有副作用，例如釋放LH、FSH、TSH、ACTH、後葉加壓素、催產素、皮質醇和/或催乳激素。本發明再一個目的在於提供具有好的口服生物可利用率的化合物。
發明概述根據本發明，提供一種在體外正常的實驗條件下直接作用在腦垂體細胞上以從其中釋放生長激素的新的化合物。
釋放生長激素的化合物可以在體外用作獨特的研究工具，用於理解特別是怎樣在腦垂體水平下調節生長激素的分泌。
此外，本發明釋放生長激素的化合物還可以在體內給藥以增加內生生長激素的釋放。
發明說明因此，本發明涉及通過如在實施例1中所述的方法可獲得的化合物，或其藥學上可接受的鹽。
此外，本發明涉及通過如在實施例1中所述的方法可獲得的化合物，該化合物是2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺 或其藥學上可接受的鹽。
此外，本發明涉及化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺 或其藥學上可接受的鹽。
通過如在實施例1中所述的方法可獲得的化合物的結構可以例如通過X射線衍射分析證明(例如在RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第十九版(1995)、特別是第160和561562頁中所描述的那樣)。
這裡所述的兩個或更多實施方案的任何一種可能的組合均包括在本發明範圍內。
一般方法該專利中使用的方法是基於本領域熟知的肽偶合，決不應該被解譯為以任何方式限制本發明。
在該方法中，在偶合胺基酸或肽殘基之前，可以使用本領域技術人員熟知的方法除去適當的保護基例如叔丁氧基羰基(Boc)。也可以避免使用保護基。適當的胺基酸可以通過本領域已知的方法保護和脫保護，例如由T.W.Green所描述的(有機合成中的保護基團(Protective Groups in OrganicSynthesis)，2版，John Wiley and Sons，New York 1991)。
實施例1將詳細地描述該方法。通過拆分3苄基哌啶1，3二羧酸1叔丁基酯的外消旋混合物得到一個對映體化合物，通過該方法得到的最終化合物是非對映體2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺，
而不是兩個非對映體的混合物。
本發明的化合物對於通過酶蛋白水解的降解顯示增加的抵抗力，因為它是非天然的、尤其因為天然的醯胺鍵被非天然的醯胺鍵模擬物取代。與已知的激素釋放肽相比本發明化合物對於蛋白水解降解增加的抵抗力與在先文獻中提出的肽相比預計提高了其生物利用率。
藥物組合物本發明的化合物可以任選是藥學上可接受的鹽的形式例如本發明化合物的藥學上可接受的酸加成鹽，其包括那些通過式I化合物與無機或有機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、乙酸、磷酸、乳酸、馬來酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、戊二酸、葡糖酸、甲磺酸、水楊酸、琥珀酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、氨基磺酸或富馬酸和/或水反應製備的鹽。
本發明的化合物可以以藥學上可接受的酸加成鹽形式，或如合適時以為鹼金屬或鹼土金屬或低級烷基銨鹽形式給藥。這種鹽的形式被認為顯示與游離鹼形式大約相同等級的活性。
在另-方面，本發明涉及包括作為活性成分的本發明化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
含有本發明化合物的藥物組合物可以通過常規技術來製備，例如按照在Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985或RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，第十九版(1995)中所描述的方法製備。該組合物可以以常用的形式存在，例如膠囊劑、片劑、氣霧劑、溶液、懸浮液或局部給藥製劑。
使用的藥物載體或稀釋劑可以是常用的固體或液體載體。固體載體的例子是乳糖、白土、蔗糖、環糊精、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸或纖維素低級烷基醚。液體載體的例子是糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸醯胺、聚氧乙烯或水。
同樣，載體或稀釋劑可以包括本領域已知的任何持續釋放材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，單獨或與蠟混合。
如果固體載體用於口服，製劑可以被壓片以粉狀或小藥丸形式放入硬明膠膠囊中，或者它可以是錠劑或糖錠形式。固體載體的量變化較廣，但是通常為大約25毫克-大約1克。如果使用液體載體，製劑可以是糖漿、乳狀液、軟明膠膠囊或者無菌的可注射的液體例如含水的或不含水的液體懸浮液或者溶液。
可以通過常用的壓片技術製備的典型的片劑可以含有核心活性化合物(以游離化合物或其鹽)10毫克膠體二氧化矽(Aerosil) 1.5毫克微晶纖維素(Avicel)70毫克改性的纖維素樹膠(AcDiSol) 7.5毫克硬脂酸鎂包衣HPMC 大約9毫克*Mywacett 9-40T 大約0.9毫克*用作薄膜包衣增塑劑的醯化的單酸甘油酯。
對於鼻內給藥，製劑可以含有溶解或懸浮在液體載體、對於氣霧劑尤其是含水的載體中的本發明化合物。該載體可以含有添加劑例如增溶劑例如丙二醇、表面活性劑、吸收增強劑例如卵磷脂(磷脂醯膽鹼)或環糊精，或防腐劑例如對羥基苯甲酸酯類。
通常，本發明的化合物以單位劑型配藥，每單位劑量包括50200毫克活性成分和藥學上可接受的載體。
當給病人例如人作為藥物給藥時，根據本發明化合物的劑量適合為0.01500毫克/天，例如大約5-大約50毫克、例如大約10毫克/劑量。
在另一方面，本發明涉及單位劑量形式的藥物組合物，包括作為活性成分的大約10-大約200毫克通式I化合物或其藥學上可接受的鹽。
已經證明本發明的化合物具有在體內釋放內生的生長激素的能力。因此該化合物可以用於治療例如在生長激素缺乏的人或過了中年的病人或家畜中需要增加血漿生長激素水平的病症。
因此，在一特別方面，本發明涉及用於刺激生長激素從腦垂體中釋放的藥物組合物，該組合物包括作為活性成分的本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
在另一方面，本發明涉及用於刺激生長激素從腦垂體中釋放的方法，該方法包括向需要的患者給藥有效量的本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽。
在另一方面，本發明涉及本發明化合物或其藥學上可接受的鹽用於製備刺激生長激素從腦垂體中釋放的藥物的用途。
對於本領域技術人員，熟知人的生長激素的當前和潛在的用途是不同的和各式各樣的。因此，本發明的化合物可以用於刺激生長激素從腦垂體中釋放的目的給藥，於是具有類似於生長激素本身的效果或用途。本發明的化合物用於刺激老年人生長激素的釋放，預防糖皮質激素分解代謝的副作用，預防和治療骨質疏鬆症，治療慢性疲勞綜合症(CFS)，治療急性的疲勞綜合症和選擇性手術之後肌肉損耗，刺激免疫系統，加速傷口癒合，加速骨折恢復，加速複雜性骨折例如內脫位的骨生成，治療骨折繼發性消瘦，治療生長遲緩，治療由腎衰竭或機能不全引起的生長遲緩，治療心肌病，治療與慢性肝病有關的消瘦，治療血小板減少症，治療與克羅恩氏病有關的生長遲緩，治療短腸症候群，治療與慢性阻塞性肺病有關的消瘦(COPD)，治療與移植有關的併發症，治療生理學上的短身材包括生長激素缺乏的孩子和與慢性病有關的短身材，治療肥胖和與肥胖有關的生長遲緩，治療厭食，治療與PraderWilli綜合症和特納氏症候群有關的生長遲緩；提高患有部分生長激素不敏感綜合症病人的生長速度，加速恢復和減少燒傷病人的住院治療；治療宮內生長遲緩、骨骼發育異常、皮質醇過多症和柯興症候群；誘導脈動的生長激素釋放；替換有壓力病人的生長激素，治療骨軟骨發育不良、Noonan綜合症、精神分裂症、抑鬱症、阿爾茨海默氏病、遲延的傷口癒合和社會心理的喪失，治療與肺機能不良和呼吸依賴性有關的異化作用；治療心臟衰竭或相關的血管機能不良，治療損害的心臟功能，治療或預防心肌梗死，降低血壓，預防心室機能不良或預防再灌注現象；治療處於長期透析之中的成人；減弱大手術之後蛋白質分解代謝的反應，減少惡病質和由於慢性病如癌症或愛滋病導致的蛋白質的損失；治療血胰島素增多包括胰島細胞增殖症，用於誘導排卵的輔助治療；刺激胸腺的發育和預防與年齡有關的胸腺功能的下降，治療免疫抑制病人；治療sarcopenia，治療與愛滋病有關的消瘦；改善肌力、可動性，保持虛弱老人的皮膚厚度、代謝的體內平衡和腎臟的體內平衡，刺激成骨細胞、骨頭改型和軟骨生長；調整食物攝入；刺激配對動物的免疫系統和治療配對動物的衰老病症，促進家畜生長和刺激綿羊的羊毛生長，提高家畜的產奶量，治療代謝綜合症(綜合症X)，治療抗胰島素性包括哺乳動物例如人中的NIDDM，治療心臟中的抗胰島素性，改善睡眠質量和矯正由於REM睡眠(REMsleep)的高度增加和REM潛伏的減少的相對的衰老hyposomatotropism，治療低體溫，治療與年齡有關的虛弱，治療充血性心力衰竭，治療髖部骨折，治療T4/T8細胞比例降低的個體的免疫缺乏，治療肌肉萎縮，治療過了中年的人的肌與骨的損傷，提高蛋白激酶B(PKB)的活性，改善總的肺機能，治療睡眠障礙，治療與氣喘有關的生長遲緩，治療與青少年風溼性關節炎有關的生長遲緩和治療與囊性纖維化有關的生長遲緩。
對於上述適應症，劑量將根據給藥方式和所希望的治療而改變。然而，通常向病人和動物給藥在0.0001和100毫克/千克體重/天之間的劑量水平以達到內生性生長激素有效的釋放。此外當以上述劑量水平給藥時，本發明的化合物沒有或基本上沒有副作用，這種副作用是例如釋放LH、FSH、TSH、ACTH、後葉加壓素、催產素、皮質醇和/或催乳激素。通常，適合於口服、鼻內、肺或經皮膚的給藥劑量包括大約0.0001毫克-大約100毫克，優選大約0.001毫克-大約50毫克本發明化合物與藥學上可接受的載體或稀釋劑。
可選擇的是，本發明的藥物組合物可以包括本發明化合物與一個或多個顯示不同活性的化合物例如抗生素或其他藥理學的活性物質相結合。
給藥途徑可以是能夠有效地將活性化合物傳輸至適當的或所希望的作用位置的任何途徑，例如口服、鼻內、肺的、經皮膚的或腸胃外的給藥途徑，優選口服途徑。
本發明化合物除了藥學用途外，也可以用於研究生長激素釋放規則的體外工具。
本發明的化合物還可以用於評價腦垂體釋放生長激素能力的體內工具。例如，可以在向人給藥化合物之前和之後提取血清樣品測定生長激素。比較每個血清樣品中的生長激素將直接測定病人腦垂體釋放生長激素的能力。
本發明的化合物向商業上重要的動物給藥以提高它們的生長速度和程度以及提高產奶量。
本發明化合物另外的用途是與其他促分泌劑例如GHRP(2或6)、GHRH及其類似物、生長激素及其類似物或生長調節素包括IGF1和IGF2結合使用。
藥理學方法本發明化合物可以在體外評價其對於大鼠腦垂體原始培養物中釋放生長激素的效力和能力，這種評價可以按照如下所述的方法進行。
大鼠腦垂體細胞的分離是對O.Sartor等人方法(Endocrinology 116，1985，第952957頁)的改變。雄性患白化病的SpragueDawley大鼠(250+/25克)從Mollegaard，Lille Skensved，Denmark購買。將大鼠放在幾組籠中(四個動物/籠)並且放入12小時光循環的房間中。室溫變化範圍為1924℃，溼度為3060％。
將鼠去頭然後解剖腦垂體。除去neurointermediate葉，立即將剩下的組織放入冰冷的分離緩衝劑(Gey′s介質(Gibco 04104030)，補充有0.25％D葡萄糖、2％非必需胺基酸(Gibco 04301140)和1％牛血清白蛋白(BSA)(SigmaA4503))中。將組織切成小塊，轉移到補充有3.8毫克/毫升胰蛋白酶(Worthington num；3707 TRL3)和330毫克/毫升DNase(Sigma D4527)的分離緩衝劑中。該混合物在70轉/分鐘、37℃下和95/5％O2/CO2氣氛中培養35分鐘。然後將該組織在上述緩衝劑中洗滌三次。然後使用標準巴斯德移液管將該組織抽吸至單個細胞中。分散之後，通過尼龍過濾器(160毫米)過濾細胞除去未消化的組織。該細胞懸浮液用補充有胰蛋白酶抑制劑(0.75毫克/毫升，Worthington # 2829)的分離緩衝劑洗滌3次，最後再懸浮在培養介質補充有25mM HEPES(Sigma H3375)、4mM穀氨醯胺(Gibco 04305030H)、0.075％碳酸氫納(Sigma S8875)、0.1％非必需胺基酸、2.5％胎牛血清胎牛血清(FCS，Gibco 01106290)、3％馬血清(Gibco 03406050)、10％新鮮的大鼠血清、1nM T3(Sigma T2752)和40毫克/升地塞米松(Sigma D4902)的pH7.3的DMEM中至密度為2x×105細胞/毫升。該細胞接種至微量滴定板(Nunc，Denmark)中，其中200毫升ml/穴，在37℃和8％CO2下培養3天。
化合物測試培養之後，該細胞用刺激緩衝劑(補充有1％BSA(Sigma A4503)、0.25％D-葡萄糖(Sigma G5250)和25mM HEPES(Sigma H3375)的pH7.3的Hanks平衡鹽水(Gibco 04104020))洗滌兩次，在37℃下預培養1小時。該緩衝劑與90ml刺激緩衝劑(37℃)交換。加入十毫升測試化合物的溶液，該板在37℃和5％CO2下培養15分鐘。潷析出介質，在rGH SPA測試系統中分析GH含量。
測試化合物的劑量範圍為10pM至100mM。使用Hill等式(Fig P，Biosoft)建立劑量-反應關係。效力(最大的GH釋放，Emax)用GHRP-6的％Emax表示。能力(EC50)被確定為誘導最大刺激GH釋放一半的濃度。
本發明化合物使用如下所述的方法評價其代謝穩定性將化合物溶解在濃度為1毫克/毫升的水中。將25毫升該溶液加入到175毫升相應的酶溶液中(結果形成酶基質比例(w/w)大約為1∶5)。該溶液在37℃下放置過夜。相對相應的零-樣品使用帶有選擇的分子離子離子監控器的流動注射電噴霧質譜法(ESMS)分析10毫升不同的降解溶液。如果與零-樣品相比信號降低20％以上，為了明確地確定降解程度和位置通過HPLC和質譜法分析剩餘溶液。
為了證明不同的溶液降解肽的能力，在穩定性測試中已經包括了幾種標準的肽(ACTH410，血管緊張素114和胰高血糖素)。
標準的肽(血管緊張素114，ACTH 410和胰高血糖素)從Sigma，MO，USA購買。
酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶氨基肽酶M和羧肽酶Y和B)全部從Boehririger Mannheim GmbH(Mannheim Germany)購買。
胰酶混合物100mM碳酸氫銨中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶pH8.0(所有濃度均為0.025毫克/毫升)。
羧肽酶混合物50mM乙酸銨中的羧肽酶Y和B pH4.5(所有濃度均為0.025毫克/毫升)。
氨基肽酶M溶液100mM碳酸氫銨中的氨基肽酶M(0.025毫克/毫升)pH8.0使用兩個不同的質譜儀進行質譜分析。裝有電子噴霧離子源的Sciex API III三倍四極LCMS儀器(Sciex儀器，Thornhill，Ontario)和Biolon 20飛行時間血漿解吸儀器(Biolon Nordic AB，Uppsala，Sweden)。
在API III儀器上使用上述帶有流動注射被分析物的分子離子的單個離子監控器進行化合物的定量分析(降解前後)。通過ABI 140B HPLC設備(PerkinElmer Applied Biosystems Divisions，Foster City，CA)控制液體流量(甲醇∶水1∶1)為100毫升/分鐘。儀器參數被設定為標準操作條件，使用最強的分子離子(在大多數情況下相當於雙倍電荷的分子離子)進行SIM監測。
此外降解產物的鑑定涉及使用在硝化纖維素塗覆的靶上點樣的血漿解吸質譜法(PDMS)和標準的儀器裝置。在此測定的質量準確度通常比0.1％好。
使用具有標準的乙腈TFA分離梯度的HYTACH C18反相4.6×105mm HPLC柱(Hewlett-Packard Company，Palo Alto，CA)進行降解產物的分離和離析。所用的HPLC體系是HP1090M(Hewlett-Packard Company，Palo Alto，CA)。
+穩定(在24小時之後降解溶液中的SIM信號減少小於20％)-不穩定(在24小時之後降解溶液中的SIM信號減少大於20％)藥動學方法本發明化合物可以評價其口服的生物利用率，這樣的評價可以按照如下所述的方法進行。
本發明化合物的藥動學可以在禁食的長耳短腿小獵犬(Beagle dogs)中進行研究。
通過一周衝洗，分離靜脈內給藥和口服測試化合物的5％葡萄糖溶液。
在給藥藥物之前(計時起點)和給藥之後0.08、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0小時立即收集血樣。
血漿樣品冷凍儲存(＜18℃)待分析。
帶有固相提取和UV檢測的HPLC方法用於血漿中化合物的定量。
本發明化合物的口服有效性為大約50％。
通過非區室化(noncompartmental)方法使用基於PC的藥動學軟體WinNonlin，1.1版本(Scientific Consulting Inc.，Apex，NC，USA)計算化合物的藥動學參數。
這裡所述的任何新的特徵或特徵的結合被認為對本發明是必需的。
實施例製備本發明化合物和含有該化合物製劑的方法在下面實施例中進一步說明，然而這些實施例不能被理解為限制本發明。
化合物的結構通過高效液相色譜法(HPLC)、核磁共振(NMR，Bruker400MHz)或者液相色譜-質譜法(LCMS)確定。NMR位移(d)以百萬分之幾(ppm)為單位給出，僅給出選擇的峰。mp是熔點並且以℃為單位給出。柱色譜法使用W.C.Still等人，J.Org.Chem.1978，43，29232925中所述的技術在Merck矽膠60(Art 9385)上進行。用作原料的化合物或者是已知的化合物或者是可以通過本身已知的方法很容易製備的化合物。所用的甲醇/氨溶液是甲醇中10％氨的溶液。
HPLC分析方法A1.
在42℃下以1毫升/分鐘的速度洗脫的218TP544.6毫米×250毫米5m C18二氧化矽柱(The Seperations Group，Hesperia)上使用在214、254、276和301nm處的UV檢測進行RP分析。該柱用在緩衝液中的5％乙腈平衡，所述緩衝液由0.1M硫酸銨組成的、用4M硫酸調節至pH2.5。注射之後，樣品通過在相同的緩衝液中的5％-60％乙腈的梯度溶液洗脫50分鐘。
方法B1.
在42℃下以1毫升/分鐘的流量洗脫的218TP54 4.6毫米×250毫米5m C18二氧化矽柱(The Seperations Group，Hesperia)上使用在214、254、276和301nm處的UV檢測進行RP分析。該柱用5％(乙腈+0.1％ TFA)的TFA水溶液(0.1％)平衡。注射之後，樣品通過在相同的含水緩衝劑中5％-60％(乙腈+0.1％TFA)的梯度溶液洗脫50分鐘。
方法h8在42℃下以1毫升/分鐘的流量洗脫的218TP544.6毫米×150毫米C18二氧化矽柱上使用在214和254nm處的UV檢測進行RP分析。該柱用5％乙腈、85％水和10％的0.5％三氟乙酸水溶液平衡，通過從5％乙腈、85％水和10％的0.5％三氟乙酸溶液至90％乙腈和10％的0.5％三氟乙酸的溶液的線性梯度溶液洗脫15分鐘。
Chirale HPLC在室溫下以0.7毫升/分鐘的流量洗脫的，裝有4.6毫米×80毫米Chiracel OJ前置柱的4.6毫米×250毫米Chiracel OJ柱(兩個柱均購買自Daicel Chemical Industries，LTD)上使用在225和254nm處的UV檢測進行Chiral HPLC。樣品用庚烷(92)異丙醇(8)TFA(0.1)的等度洗脫液洗脫。
LCMS-分析在PE Sciex API 100 LC/MS體系中使用Waters3毫米×150毫米3.5mC18對稱柱和20毫升/分鐘流量的正離子噴霧進行LCMS分析。該柱用線性梯度的590％乙腈、850％水和10％三氟乙酸(0.1％)/水以1毫升/分鐘的流量洗脫15分鐘。
縮寫TLC薄層色譜法DMSO 二甲亞碸min分鐘h 小時Boc叔丁氧基羰基DMF二甲基甲醯胺THF四氫呋喃EDAC N-乙基-N′二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽HOAt 1-羥基-7氮雜苯並三唑DIEA 二異丙基乙胺TFA三氟乙酸結構單元(Building blocks)用於下列實施例中的N甲基化胺基酸按照Can.J.Chem.1977，55，906中的方法製備。
甲酸-N′，N′-二甲基醯肼將50毫升甲酸甲酯和50毫升1，1-二甲基肼的混合物在室溫下攪拌3天。在真空中濃縮形成結晶，將其在EtOH(5)庚烷(95)中攪拌，在冰箱中冷卻過夜然後過濾50.7克(575毫摩爾)(收率88％)N，N，N′-三甲基肼，二鹽酸鹽向裝有磁力攪拌器和加料漏鬥的2升三頸圓底燒瓶中裝入20.4克LiAlH4，抽空然後用氮氣衝洗。然後將加料漏鬥裝上氮氣鼓泡器，緩慢地加入250毫升無水的四氫呋喃(放熱)。劇烈攪拌灰色的懸浮液，用1小時滴加含有40.0克甲酸N′，N′-二甲基醯肼的250毫升無水的四氫呋喃溶液。在室溫下攪拌過夜。反應通過TLC(CH2Cl2(100)MeOH(10)NH3(1))監測。
向另一個裝有乾冰冷凝器的2升三頸圓底燒瓶中裝入350毫升4.8MHCl/CH3OH，然後放入乾冰浴(70℃)中。然後通過vigreux冷凝器將其連接到反應燒瓶上，反應燒瓶放置在油浴中。向該反應燒瓶中小心地加入200毫升四氫呋喃和200毫升MeOH的混合物。蒸餾產物和溶劑同時緩慢地加熱至130℃，結果收集結晶的三甲基肼的二鹽酸鹽(在70℃)。移去乾冰浴，使得溫度上升到室溫。在真空中濃縮獲得稀薄的無色油，使用高真空泵將其乾燥過夜45.2克(309毫摩爾)(收率68％)。在氮氣下保存該非常吸溼的產物。
其他原料可以從Aldrich購買。
實施例1製備化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺 或
2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺的方法 步驟a哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯 向裝有磁力攪拌器和加料漏鬥的一頸圓底燒瓶(1升)中裝入NaOH顆粒(15.6克)、四氫呋喃(400毫升)和3-哌啶甲酸乙酯(50毫升，324毫摩爾)。向在室溫下攪拌的混合物中滴加溶於四氫呋喃(150毫升)中的Boc2O(84.9克，389毫摩爾)的溶液(1小時，白色固體沉澱，NaOH顆粒溶解，放熱)。混合物在室溫下攪拌過夜。將該混合物加入到乙酸乙酯(500毫升)和H2O(2000毫升)中，水層用乙酸乙酯(2×500毫升)反萃取，合併的有機層用鹽水(100毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得哌啶-1，3-二-羧酸1-叔丁酯3-乙酯(82.5克)，為淺黃色油。
1HNMR(300MHz CDCl3)δ1.25(t，3H，CH3)；1.45(s，9H，3XCH3)；2.05(m，1H)；2.45(m，1H)；2.85(m，1H)；3.95(d(寬的)，1H)；4.15(q，2H，CH2)步驟b3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(外消旋混合物) 將裝有磁力攪拌器、溫度計、氮氣鼓泡器和加料漏鬥的三頸圓底燒瓶(2升)抽空，用氮氣衝洗，裝入無水四氫呋喃(500毫升)然後冷卻至70℃。然後加入二異丙胺鋰(164毫升2.0M四氫呋喃溶液，327毫摩爾)。用45分鐘向在70℃下攪拌的溶液中滴加含有哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(80克，311毫摩爾)的無水四氫呋喃(50毫升)溶液(溫度在70℃-60℃之間，澄清的紅色溶液)。該混合物攪拌20分鐘，隨後用40分鐘滴加含有苄基溴(37毫升，311毫摩爾)的無水四氫呋喃(250毫升)溶液(溫度在70℃-60℃之間)。該混合物在70℃下攪拌1小時，然後在室溫下放置過夜(淺橙色)。該反應混合物在真空中濃縮至大約300毫升，轉移到分液漏鬥中，用CH2Cl2(900毫升)稀釋然後用H2O(900毫升)洗滌。由於不良分離，水層用CH2Cl2(200毫升)反萃取，合併的有機層用含水的NaHSO4(200毫升，10％)、含水的NaHCO3(200毫升，飽和的)、H2O(200毫升)、鹽水(100毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得油狀物，將其溶於乙酸乙酯(1)庚烷(10)中然後放置(aged)過夜。通過過濾移去形成的固體，用庚烷洗滌，在真空中乾燥得到3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯的外消旋混合物(81.4克)。
HPLC(h8)Rt＝15.79分鐘。
LCMSRt＝7.67分鐘。(m+1)＝348.0步驟c3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(外消旋混合物) 在裝有冷凝器和磁力攪拌器的一頸圓底燒瓶(1升)中將3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(81克，233毫摩爾)溶於EtOH(400毫升)和NaOH(400ml，16％水溶液)中。該混合物在氮氣下回流10小時，冷卻至室溫，在真空中濃縮至大約600毫升(固體沉澱)，用H2O(400毫升)稀釋，在冰浴中冷卻然後在劇烈攪拌下用4M H2SO4酸化直到pH＝3(最終溫度28℃)。混合物用乙酸乙酯(2×700毫升)萃取，合併的有機層用鹽水(200毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得油狀物，將其溶於乙酸乙酯(1)庚烷(10)中然後放置過夜。通過過濾移去形成的結晶，用庚烷洗滌，在真空中乾燥得到3苄基哌啶-1，3-二羧酸1叔丁酯的外消旋混合物(66.0克)。
HPLC(h8)Rt＝12.85分鐘。
LCMSRt＝5.97分鐘。(m+1)＝320.0Chirale HPLC(Chiracel OJ，庚烷(92)異丙醇(8)TFA(0.1))Rt＝8.29分鐘46.5％Rt＝13.69分鐘53.5％步驟d(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸-1-叔丁酯或(3S)3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(拆分3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯) 或 在裝有磁力攪拌器的一頸燒瓶(5L)中將3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(76克，238毫摩爾)溶於乙酸乙酯(3.0L)中。然後加入H2O(30毫升)、R(+)1苯乙胺(18.2毫升，143毫摩爾)和Et3N(13.2毫升，95毫摩爾)，混合物在室溫下攪拌過夜形成白色結晶的沉澱(41.9克)，通過過濾移去，用乙酸乙酯洗滌然後在真空中乾燥。將該沉澱溶於含水的NaHSO4(300毫升，10％)和乙酸乙酯(600毫升)的混合物中，分層然後用乙酸乙酯(100毫升)反萃取水層。合併的有機層液用鹽水(100毫升)洗滌，MgSO4乾燥然後過濾。在真空中除去溶劑獲得無色油，將其溶於乙酸乙酯(1)庚烷(10)中，然後陳化過夜。通過過濾移去已經形成的結晶，用庚烷洗滌，在真空中乾燥得到一個化合物，其或者是(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯或者是(3S)3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(27.8克)。
Chirale HPLC (Chiracel OJ，庚烷(92)異丙醇(8)TFA(0.1))Rt＝7.96分鐘。95.8％ ee步驟e(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯或(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 或 在裝有大磁力攪拌器和加料漏鬥/氮氣鼓泡器的一頸圓底燒瓶(1L)中將三甲基肼二鹽酸鹽(15.3克，104毫摩爾)懸浮在四氫呋喃(250毫升)中。然後將燒瓶放入水浴(溫度10-20℃)中，加入六氟磷酸溴-三-吡咯烷 (40.4克，86.7毫摩爾)，在劇烈攪拌下滴加二異丙基乙胺(59毫升，347毫摩爾)。混合物(含有重質沉澱)攪拌5分鐘，用1.5小時緩慢地加入來自步驟d產物的四氫呋喃(250毫升)溶液，該產物或者是(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯或者是(3S)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(27.7克，86.7毫摩爾)。混合物在室溫下攪拌過夜。反應混合物用乙酸乙酯(1000毫升)稀釋，用H2O(500毫升)、含水的NaHSO4(200毫升，10％)、含水的NaHCO3(200毫升，飽和的)、鹽水(200毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得淺橙色油。將該混合物溶於乙酸乙酯(300毫升)中，加入到SiO2(150克)中然後在真空中濃縮至乾燥粉末，將其施加到充滿SiO2(150克)的過濾器上，用庚烷(1升)洗滌，用乙酸乙酯(2.5升)析出所希望的化合物。在真空中濃縮之後，獲得橙色油狀產物，其或者是(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯或者是(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(49克)。
HPLC(h8)Rt＝14.33分鐘。
步驟f(3R)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基醯肼或(3S)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基醯肼 或 在裝有磁力攪拌器的一頸圓底燒瓶(2L)中將來自步驟e的產物(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1羧酸叔丁酯或(3S)3苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(56.7克，100.9毫摩爾)溶於乙酸乙酯(500毫升)(澄清的無色溶液)中。然後將該燒瓶放入水浴(溫度1020℃)中，將HCl氣體通過該溶液5分鐘(粉狀的沉澱)。攪拌1小時之後(沉澱大量的白色結晶)，該溶液用N2衝洗以除去過量的HCl。通過緩慢的過濾移去沉澱，用乙酸乙酯(2×100毫升)洗滌，在真空、40℃乾燥過夜得到該產物，其或者是(3R)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基醯肼或者是(3S)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基醯肼(37.0克)。
HPLC(h8)Rt＝7.84分鐘。
步驟g[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′--三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯 或 在裝有磁力攪拌器和氮氣鼓泡器的一頸圓底燒瓶(500毫升)中將BocDTrpOH(32.3克，106毫摩爾)溶於二甲基乙醯胺(250毫升)中。該溶液冷卻至05℃，加入1羥基-7氮雜苯並三唑(14.4克，106毫摩爾)、1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(20.3克，106毫摩爾)、N-甲基嗎啉(11.6毫升，106毫摩爾)。在05℃下攪拌20分鐘之後，加入來自步驟f的產物(3R)-3-苄基-哌啶3羧酸三甲基醯肼或者是(3S)3苄基-哌啶3羧酸三甲基醯肼(37.0克，106毫摩爾)和N甲基嗎啉(24.4毫升，223毫摩爾)。反應在室溫下攪拌過夜。然後將混合物加入到乙酸乙酯(750毫升)中，用含水的NaHSO4(300毫升，10％)洗滌。使得層分離，水層用乙酸乙酯(500毫升)反萃取。合併的有機層用H2O(100毫升)、含水的NaHCO3(300毫升，飽和的)、H2O(100毫升)、鹽水(300毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得橙色油狀產物，其或者是[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或者是[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯(56.7克)。
HPLC(h8)Rt＝14.61分鐘。
LCMSRt＝7.35分鐘。(m+1)＝562.6步驟h1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基](3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼或1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼 或
在裝有磁力攪拌器的一頸圓底燒瓶(2L)中將來自步驟g的產物[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯(56.7克，100.9毫摩爾)溶於乙酸乙酯(500毫升)中(澄清的無色溶液)。然後將該燒瓶放入水浴(溫度1020℃)中，將HCl氣體通過該溶液10分鐘(重質沉澱的油)。該混合物用N2衝洗以除去過量的HCl，然後分離成油和乙酸乙酯層。丟棄乙酸乙酯層。將該油溶於H2O(500毫升)中，加入CH2Cl2(1000毫升)和固體Na2CO3直到pH＞7。分層，有機層用H2O(100毫升)、鹽水(100毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮獲得橙色泡沫狀的產物，其或者是1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基(3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼或1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼(27克)。
HPLC(h8)Rt＝10.03分鐘。
步驟i{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基氨基甲醯基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基氨基甲醯基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯 或
在裝有磁力攪拌器和氮氣鼓泡器的一頸頸圓底燒瓶(500毫升)中將BocAibOH(11.9克，58.4毫摩爾)溶於二甲基乙醯胺(125毫升)中。向在室溫下攪拌的溶液中加入1羥基-7氮雜苯並三唑(7.95克，58.4毫摩爾)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(11.2克，58.4毫摩爾)和二異丙基乙胺(13.0毫升，75.8毫摩爾)。20分鐘之後(黃色沉澱)，加入含有來自步驟h產物1-[(2R)-2-氨基-3-[1H-吲哚-3-基)丙醯基(3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼或1-[(2R)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基-(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基醯肼(27.0克，58.4毫摩爾)的二甲基乙醯胺(125毫升)溶液。反應混合物在室溫下攪拌3小時。將混合物加入到乙酸乙酯(750毫升)中，用含水的NaHSO4(300毫升，10％)洗滌。使得層分離，水層用乙酸乙酯(500毫升)反萃取。合併的有機層用H2O(100毫升)、含水的NaHCO3(300毫升，飽和的)、H2O(100毫升)、鹽水(300毫升)洗滌，MgSO4乾燥，過濾然後在真空中濃縮至大約500毫升。然後加入SiO2(150克)，在真空中除去剩餘的乙酸乙酯得到乾燥粉末，將其施加到充滿SiO2(150克)的過濾器上，用庚烷(1升)洗滌，用乙酸乙酯(2.5升)析出所希望的化合物。在真空中濃縮之後，獲得橙色泡沫狀的產物，其或者是{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基氨基甲醯基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或者是{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代-乙基氨基甲醯基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯33.9克。
HPLC(h8)Rt＝14.05分鐘。
步驟j2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺，富馬酸鹽或2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺，富馬酸鹽 或 在裝有磁力攪拌器的一頸圓底燒瓶(1L)中將來自步驟i的產物{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代-乙基氨基甲醯基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代-乙基氨基甲醯基]1甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯(23.8克，36.8毫摩爾)溶於乙酸乙酯(800毫升)中(澄清的黃色溶液)。然後將該燒瓶放入水浴(溫度1020℃)中，將HCl氣體通過該溶液5分鐘(粉狀的沉澱)。攪拌1小時之後(沉澱出大量的黃色粉末)，該溶液用N2衝洗以除去過量的HCl。通過緩慢過濾移去沉澱，在真空40℃下乾燥過夜。
將非結晶的沉澱溶於H2O(500毫升)中，用乙酸乙酯(100毫升)洗滌。然後加入CH2Cl2(1000毫升)和固體Na2CO3直到pH＞7。分離2層，水層用CH2Cl2(200毫升)反萃取。合併的有機層用鹽水(100毫升)洗滌，MgSO4乾燥然後過濾。在減壓下蒸發溶劑，再溶解在裝有磁力攪拌器的一頸圓底燒瓶(1L)中的乙酸乙酯(500毫升)中。緩慢地加入(5分鐘)含有富馬酸(3.67克)的異丙醇(20毫升)和乙酸乙酯(50ml)的懸浮液，結果沉澱出白色結晶的鹽。1小時之後，通過過濾分離沉澱，在真空40℃下乾燥過夜得到得到白色粉末狀的化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺或2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺的富馬酸鹽(13.9克)。
HPLC(A1)Rt＝33.61分鐘。
HPLC(B1)Rt＝34.62分鐘。
LCMSRt＝5.09分鐘。(m+1)＝547.權利要求
1.通過如在實施例1中所述的方法可獲得的化合物，或其藥學上可接受的鹽。
2.通過如在實施例1中所述的方法可獲得的化合物，該化合物是2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N＇，N＇-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙醯胺 或其藥學上可接受的鹽。
3.一種藥物組合物，包括作為活性成分的根據權利要求12中任何一項的化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
4.根據權利要求3的用於刺激生長激素從腦垂體中釋放的藥物組合物。
5.根據權利要求3或權利要求4的用於向動物給藥以增加它們的生長速度和程度、增加它們的奶和毛產量或用於治療疾病的藥物組合物。
6.刺激生長激素從哺乳動物的腦垂體中釋放的方法，該方法包括向所述的哺乳動物給藥有效量的根據權利要求1或2中任何一項的化合物或其藥學上可接受的鹽，或根據權利要求35中任何一項的組合物。
7.增加生長速度和程度，奶和毛產量或用於治療疾病的方法，該方法包括向需要的受治療者給藥有效量的根據權利要求1-2中任何一項的化合物或其藥學上可接受的鹽，或根據權利要求35中任何一項的組合物。
8.根據權利要求12中任何一項的化合物或其藥學上可接受的鹽用於製備藥物的用途。
9.根據權利要求8的用途，其中該藥物用於刺激生長激素從哺乳動物的腦垂體中釋放。
全文摘要
本發明涉及新的非對映的化合物、其藥學上可接受的鹽、含有它們的組合物和它們用於治療由缺乏生長激素引起的醫學病症的用途。
文檔編號C07D401/06GK1420878SQ00815145
公開日2003年5月28日 申請日期2000年11月10日 優先權日1999年11月10日
發明者麥可·安克森 申請人:諾沃挪第克公司