γ-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法
2023-05-21 09:06:56 1
專利名稱：γ-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及提高維生素E(生育酚)含量的方法，特別是一種雙 關鍵酶基因Y -tmt和vte3共轉化提高植物中維生素E含量的方法。
背景技術：
現有技術公開了維生素E是一種脂類維生素，其天然產物依結構的不同分為 八種類型，分別是a 、 P 、 Y 、 S -生育酚(tocopherol)禾P a 、 |3 、 y 、 S -生育三烯酚 (tocotrienol)，其中a -生育酚的生物活性最高，被認為是維生素E的主要活性成分。
醫學研究表明，維生素E不僅僅與生殖系統有關，而且與中樞神經系統、消化系 統、心血管系統和肌肉系統的正常代謝都有密切關係(Traber and Sies， 1996)。其功能體 現在如下方面維生素E參與細胞膜的構建和維持，是動物和人體內重要的抗氧化物質。維 生素E是治療冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要輔助性藥物，有助於降低血脂 和血膽固醇含量，抗凝血、抗氧化並且消除自由基，從而起到預防及治療血管栓塞的作用。 維生素E對於提高機體免疫能力有著重要的影響，具有抗衰老的功能，可以消除細胞色素 沉澱，改善皮膚彈性，減弱性腺萎縮，因而在大量保健品和美容用品中廣泛使用。維生素E 可以預防和治療多種婦科疾病，治療早產兒溶血性貧血和蠶豆病，治療營養不良兒童的巨 幼紅細胞性貧血。維生素E可以促進膽汁分泌、膽管形成和膽紅素分泌，對急慢性肝炎和肝 硬化有著治療作用。維生素E可以預防癌症發生，對於癌症患者的治療也有重要的輔助作 用。 維生素E對於人類和動物健康有重要作用，但維生素E的合成途徑只存在於綠色 光合植物中，包括低等單細胞植物藍藻和高等植物；人體和動物體內不存在維生素E合成 途徑，故而日常營養所需的維生素E攝取自綠色植物，特別是各種油類作物的種子，以及由 種子所榨取的植物油。 直接由植物油脫臭餾出物中獲得的生育酚混縮液的生物活性很低，a -生育酚的 含量較低。工業生產維生素E主要是以上述生育酚混縮液為原料，經過半合成法，將其中的 非a-生育酚成分轉變為a-生育酚。但是成本較高，而且產生的a-生育酚消旋性與天然 a-生育酚不同，活性也低於天然a-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其a-生 育酚比例有著十分重要和現實的應用價值。 隨著近年來植物基因組學的發展，DellaPe皿a於1999年提出了營養基因組學 (nutritional genomics)的概念，即充分的利用基因組學的研究成果，分離植物營養代謝 途徑的關鍵酶基因，解析植物微量營養素代謝途徑，深入了解代謝途徑的調控方式，從而利 用代謝工程的方法和手段改良作物品質，提高作物營養價值(DellaPenna，《科學》，1999年 285巻375-379頁)。基於營養基因組學的觀點和現實情況的調研，對維生素E的生物合成 途徑研究的主要目標有二，其一是提高維生素E的整體含量，其二是改變維生素E的類型組 成比例，提高其中a-生育酚的組成比例。為達到這種目標，必須對維生素E的生物合成途徑及其調控進行研究。 基於基因組學的基礎，維生素E合成途徑的基因分離、克隆和功能性研究已經取 得了突破性的進展。人們已經初步完成了對參與維生素E合成途徑關鍵基因的分離和功能 驗證工作，初步分析了維生素E(生育酚)合成途徑概貌。 維生素E(生育酚)合成途徑主要由以下五個步驟組成。(1)4-羥苯丙酮酸(HPP) 在4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA) (Norriset al. ， 1998); (2)尿黑酸在尿黑酸植基轉移酶(HPT)催化下，與植基二磷酸(PDP)發生縮合，生成2-甲 基-6-植基-苯醌(Collakova and DellaPenna， 2001) ; (3) 2_甲基-6-植基-苯醌在甲基植 基苯醌甲基轉移酶(MPBQ MT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌(van Eenennaam et al. ，2003) ; (4) 2， 3_ 二甲基_6_植基-苯醌在生育酚環化酶(TC)的催化下，生成Y-生 育酚(Porfirova et al. ，2002) ;(5) Y -生育酚在Y-生育酚甲基轉移酶(Y-TMT)的催化 下，生成a-生育酚。 現有技術中Y-生育酚甲基轉移酶(Y -tocopherol methyltransferase， Y-TMT)和甲基植基苯醌甲基轉移酶(2-methyl-6-phytylplastoquinol methyltransferases， MPBQ MT，編碼這一蛋白的基因為vte3)是生育酚合成途徑中的關鍵 酶。採用基因工程手段，用關鍵酶y -TMT與MPBQ MT的基因y -tmt和vte3共轉化植物， 將增加維生素E的合成，從而獲得維生素E高產的轉基因植株，為提高植物營養價值提供了 一條新途徑。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種Y -tmt和vte3共轉化提高 植物中維生素E含量的方法。本發明涉及到關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢 測、生育酚提取及含量測定等生物技術操作，建立了穩定提高植物中生育酚含量的方法，為 利用基因工程技術提高重要農作物和經濟作物中維生素E的含量奠定了堅實的基礎。
本發明的目的通過以下技術方案實現 從植物中克隆Y -tmt和vte3基因，構建含所述DNA分子的共轉化植物表達載體， 用根癌農桿菌介導，將Y-tmt和vte3基因同時導入植物並篩選得到純系植株；PCR檢測外 源目的基因Y -tmt和vte3的整合情況，高效液相色譜_紫外光檢測器(HPLC-UVD)測定植 物中維生素E(生育酚)含量，篩選獲得維生素E含量顯著提高的轉基因植株。
本發明方法包括下述步驟 (1)採用基因克隆方法獲得植物生育酚合成途徑關鍵酶基因Y -tmt和vte3 ;
(2)把Y-tmt和vte3基因可操作性的連接於表達調控序列，形成含Y-tmt和 vte3基因的植物表達載體； (3)將含有Y -tmt和vte3基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌(為市場有公開 出售的生物材料，可以從多家公司如澳大利亞CAMBIA公司獲得)，獲得用於轉化植物的含 有Y -tmt和vte3基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株； (4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化植物，獲得經PCR檢測的轉基因植株；
(5)對獲得的轉基因植物中的維生素E含量進行HPLC-UVD測定，篩選獲得維生素 E含量顯著提高的轉基因植株。
4
所述的經PCR檢測的轉基因植株是指，分別設計合成Y -tmt和vte3基因的檢測 引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即為轉基因植株。
所述的HPLC-UVD測定植物中維生素E含量，方法如下色譜柱C_18反相矽膠柱， 流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為98 : 2，柱溫為3(TC，流速l. OmL/min，進樣量 30 ii L，紫外光檢測器檢測波長292nm。 本發明的Y -tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法，採用基因 工程方法，將關鍵酶基因Y -tmt和vte3導入植物中，獲得了維生素E含量顯著提高的轉基 因植株，轉基因植株中生育酚的總量(15.8pmol/mg FW)是非轉基因植株(12pmol/mg FW) 的1.3倍。此外，轉基因植株中生育酚各個不同構型之間的比例產生了明顯的變化，其中具 有維生素E活性的組分a -生育酚的比例達到了生育酚總量的99. 5%以上，比非轉基因植 株(86% )提高了 13.5%以上。該發明對提高植物營養價值具有重要意義。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例(以植物擬南芥為例)作詳細說明本實施例在以本發明 技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護 範圍不限於下述的實施例。 下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等 分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress， 1989)中所述的
條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 擬南芥Y -tmt和vte3基因的克隆
1.擬南芥基因組總RNA的提取 取少量擬南芥(生態型為哥倫比亞型)幼嫩葉片，用液氮速凍後，迅速用研缽研 碎，加入盛有lmL TRIzol(TRIzol Reagents, GIBC0 BRL， USA)的1. 5mLEppendorf管中， 充分振蕩後，於室溫下放置5min，加200 y L氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2_3min後，於 4t:、12，000g離心15min ;將上清液(約600 y L)吸入乾淨的1.5mL E卯endorf管中，加 入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min後，於4。C、12，000g離心10min ;棄上清， 加lmL 75X乙醇清洗，振蕩後，於4t:、7，500g離心5min ;室溫乾燥15_20min後溶於適量 (30-50 ii L) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測 定RNA含量。 2.擬南芥Y -tmt和vte3基因的克隆 將所獲的擬南芥基因組總RNA通過反轉錄酶XL (AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA，根 據所述擬南芥Y-tmt基因的編碼序列(序列1)和vte3基因的編碼序列(序列2)分別 設計擴增出完整編碼框的上下遊引物，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點 (這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增 後進行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術服務有限公司採用3730自動測序儀完成。 測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報導的編碼序列一致。 本實例採用基因克隆方法從擬南芥中獲得序列正確的維生素E生物合成關鍵酶 基因Y -tmt和vte3，為雙關鍵酶基因共轉化策略提供了重要的關鍵酶基因。
實施例2 含y -tmt和vte3基因的植物雙元表達載體的構建
1.中間載體。0八1 ^1304+的構建選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構建雙元植物表達載體pCAMBIA1304+。 具體的，HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304 ;回收pBI121表達盒，回收 pCAMBIA1304大片段；連接這兩個回收產物，轉化DH5 a ，在卡那黴素LB平板上篩選得到單 克隆，再抽提質粒，酶切驗證(HindIII和EcoRI雙酶切)；即構建好pCAMBIA1304+。
2中間載體pMD18T- Y -tmt和pMD18T-vte3的構建 首先根據酶切位點合成引物，在Y-tmt上遊和下遊分別引入酶切位點Xbal與 Sacl，在vte3上遊和下遊分別引入酶切位點BglII與BstEII，以便構建表達載體。繼而 以合成的引物分別擴增含有引入酶切位點的基因片段，經電泳驗證條帶大小正確後，膠回 收目標基因片段，與亞克隆載體pMD18T-simple進行平末端連接，轉化大腸桿菌，挑取單克 隆，對PCR檢測為陽性的載體進行測序，獲得與目標片段比對無誤的陽性克隆。
3.植物雙元表達載體pCAMBIA1304+: : y -tmt的構建 以上述的中間載體pCAMBIA1304+與pMD18T- y -tmt為基礎，將含有y -tmt基因 的表達盒插入PCAMBIA1304+中，構建成植物雙元表達載體pCAMBIA1304+: : y -tmt。具體操 作如下用Xbal與Sacl雙酶切pCAMBIA1304+載體，回收大片段，用Xbal與Sacl雙酶切 pMD18T-y-tmt載體，回收y-tmt基因的表達盒。將y-tmt基因的表達盒與pCAMBIA1304+ 大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
4.植物雙元表達載體pCAMBIA1304+: : Y -tmt_vte3的構建 以所述的植物雙元表達載體pCAMBIA1304+: : y -tmt為基礎，將含有vte3基 因的表達盒插入植物雙元表達載體pCAMBIA1304+:: y-tmt中，構建成植物雙元表 達載體pCAMBIA1304+: : y -tmt_vte3。 具體操作如下用BglII與BstEII雙酶切 pCAMBIA1304+: : y -tmt，回收大片段，用BglII與BstEIII雙酶切pMD18T-vte3，回收vte3 基因的表達盒。將vte3基因的表達盒與pCAMBIA1304+:: Y-tmt大片段連接，轉化大腸杆 菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。 本實施例將維生素E生物合成途徑關鍵酶基因Y -tmt和vte3可操作性地連接於 表達調控序列，形成含Y -tmt和vte3基因的植物表達載體，該表達載體可用於通過代謝工 程策略來提高植物中維生素E含量的研究中。
實施例3 根癌農桿菌介導Y -tmt和vte3基因遺傳轉化擬南芥獲得轉基因擬南芥植株 1.含Y -tmt和vte3基因雙元植物表達載體根癌農桿菌工程菌的獲得 將實施例2中含Y -tmt和vte3基因的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌(如
GV3101，本實施例中所用為英國諾丁漢大學所贈)，並進行PCR驗證。結果表明，含Y-tmt
和vte3基因植物雙元表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株。 2.根癌農桿菌介導Y -tmt和vte3基因轉化擬南芥 2. 1擬南芥菜的種植 2. 1. 1擬南芥無菌培養 ①.擬南芥無菌培養超淨臺上將種子在15%次氯酸鈉洗滌10min，無菌水衝洗5
6次； ②.MS培養基先倒平板下層，吹乾後，把消毒後的種子分裝後用40 50°C的MS培 養基混勻，倒入平板中，均勻地鋪滿一層(小培養皿大約需要4-5ml培養基)；
③.平皿封口，4t:冰箱內春化3-5天，放入到人工氣候室中開始萌發生長。
植物生長環境為相對溼度60 % ，恆溫20-22 °C ，光照周期24h，光照強度為 80-220 iimol m—2 sec—、
2. 1. 2擬南芥土壤種植 ①.浸土把土裝入到種植盆中至距盆口約2cm處，用花無缺複合肥(N、 P、 K = 20%、20%、20% )，完全浸透; ②.移栽選取MS固體培養基上萌發生長7 10天，健壯、生長一致的苗移栽到 事先用花無缺複合肥浸過的培養土中，其上覆蓋保鮮膜，轉入22°C，24h連續光照的人工氣 候室中培養，到苗生長正常後揭去保鮮膜。
2. 2採用浸花(floral-dip)法轉化擬南芥 ①.取生長一個月左右、生長狀況良好的植株(轉化前可以提前一個星期將植物 去頂，使植物產生較多的花苞，提高轉化效率)，轉化前一天澆水； ②.將含有轉基因載體的農桿菌於28。C培養過夜，至0D6。。 " 2. 0，4， 500rpm離心 10min j ③.菌體沉澱懸浮於新鮮配製的轉化液中，至終濃度0D6。。 " 0. 8 ; .轉化時小盆倒置，確保擬南芥地上部分全部花苞都被浸沒入事先用轉化
Buffer懸浮好的菌液中約5sec ; ⑤.用吸水紙吸去多餘的液體，將植物平放於一個密封的小盒內以保持溼度，避 光過夜； .第二天將植物取出，豎直，轉移到正常條件下生長。待植物長至一定程度後， 將其依附竹籤綁好，以便更好地結實； ⑦.T。代種子成熟後將其整株剪下，過篩。種子鋪於含50 ii g/mL Hyg的篩選培養 基上，4t:春化48h，移到人工氣候室24h連續光照條件下生長一周； ⑧.待長出綠色的轉基因抗性幼苗(轉化子為綠色的幼苗且根較長；非轉化子基 本為黃化苗，或綠色無根幼苗)後移栽入土繼續生長； ⑨.單株收穫轉基因植株(因轉基因的插入位點不同，每個都是不同的)標成不 同的株系； .單株收穫的L代種子已經出現性狀分離。將種子均勻地鋪到9cm平板上，因 要確定是否是單位點插入，所以不加抗生素。待長至6-7片真葉後，噴除草劑，篩選3 : 1 單位點插入的株系，單株收穫。繼續篩選直至獲得純合的轉基因植株。
3.轉基因擬南芥植株的PCR檢測 根據CaMV 35S的序列設計正向引物，根據Y-tmt和vte3基因的序列分別設計 反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，用CaMV 35S正向引物和Y-tmt反向引物以及 CaMV 35S正向引物和vte3反向引物能分別擴增出1307bp和1039bp的特異DNA片段。而 以非轉化擬南芥基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。 本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化擬南芥的含Y -tmt和vte3基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化 擬南芥，獲得經PCR檢測的轉基因擬南芥植株。
實施例4 利用HPLC-UVD測定轉基因擬南芥中維生素E含量
1. HPLC-UVD條件及系統適用性以及標準溶液的配製 HPLC :採用Waters 2695s印arations module系統，色譜柱為C-18反相矽膠柱 (Calesil 0DS_100C18，4. 6mm I.D. X250mm length)，流動相為甲醇水，甲醇水的體積 比為98 : 2，柱溫為30。C，流速1. OmL/min，進樣量30ii L。 UVD:採用Waters 2996 photodiode array dectector系統，紫外光檢測器檢測波 長292nm。 精密稱取生育酚標準品(Sigma公司)2. Omg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL生 育酚標準品溶液，保存於_201:備用。 本發明中流動相為甲醇(methanol):水，比例為98% : 2%時，生育酚的出峰時 間為26. 3min，峰型良好。
2.標準曲線的製作 將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣5iii，i0ia，i5ia，20ia，30ia
記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X， iig)進行回歸分析。通過研 究，本發明中生育酚在10-60iig範圍內呈現良好的log-log線性關係。生育酚對照品的 log-log線性回歸方程為:Y = 7. 26e+002X+l. 09e+004 ;R = 0. 999740。
3.樣品的製備和生育酚含量的測定 生育酚的提取過程如下取少量新鮮的擬南芥葉片(l-2g鮮重)，液氮研磨，用4mL 正己烷提取，超聲30分鐘。離心，收集上清液，用氮吹儀吹乾，用適量甲醇溶解提取物，用於 HPLC檢測。 採用HPLC-UVD測定生育酚含量，樣品進樣體積為30 y 1，根據峰面積代入線形回 歸方程計算出樣品中的生育酚含量(mg)，折合成物質的量(pmol)，再除以樣品的擬南芥葉 片鮮重(mg)，從而計算出擬南芥植株中生育酚的含量。 在本發明中共轉Y-tmt和vte3基因顯著提高了擬南芥葉片中維生素E含量。共 轉y -tmt和vte3基因使得轉基因植株中維生素E的含量達到對照的1. 3倍。
本實例採用HPLC-UVD法測定了轉基因擬南芥中生育酚的含量，採用共轉化 Y-tmt和vte3基因的代謝工程策略獲得了維生素E含量提高的擬南芥植株，為提高植物營 養價值提供了 一種理想方法。
序列表
〈110>復旦大學 〈120〉 Y -tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 4
〈210>1
〈211>1350
〈212>DNA
1350
〈213>擬南芥(Arabidopsis thaliana) 〈400>1
ccacgcgtccgc^ateatccctgacttcgtcacgtttctttgtatctccaacgtccaat60
aactctegcagcaccctcttctctcacaagcctcccttatcgaaccaact120
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540
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權利要求
一種γ-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法，其特徵在於，從植物中克隆γ-tmt和vte3基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將γ-tmt和vte3基因同時導入植物並篩選得到純系植株，PCR檢測外源目的基因γ-tmt和vte3的整合情況，高效液相色譜-紫外光檢測器測定植物中維生素E含量，篩選獲得維生素E含量提高的轉基因植株。
2. 根據權利要求l所述的Y-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方 法，其特徵是，包括如下步驟(1) 採用基因克隆方法獲得植物維生素E關鍵酶基因Y -tmt和vte3 ;(2) 把y-tmt和vte3基因可操作性地連接於表達調控序列，形成含y-tmt和vte3基 因的植物表達載體；(3) 將含Y-tmt和vte3基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化植物的含 Y -tmt和vte3基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4) 利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化植物，獲得經PCR檢測的轉基因植株；(5) 對獲得的轉基因植株中維生素E含量進行高效液相色譜法及紫外光檢測器測定， 獲得維生素E含量提高的轉基因植株。
3. 根據權利要求2所述的Y-tmt和vte3共轉化提高植物中維生素E含量的方法，其 特徵是，所述的經PCR檢測的轉基因植株是指，分別設計合成Y-tmt和vte3基因的檢測引 物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即為轉基因植株。
4. 根據權利要求2所述的Y-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法， 其特徵是，所述的高效液相色譜法及紫外光檢測器測定植株中維生素E含量，通過如下方法色譜柱c-i8反相矽膠柱，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為98 : 2，柱溫30°c，流速1. 0mL/min，進樣量30 y L，紫外光檢測器檢測波長292nm。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種γ-tmt和vte3基因共轉化提高植物中維生素E含量的方法。本發明從植物中克隆γ-tmt和vte3基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將γ-tmt和vte3基因同時導入植物並再生出植株，PCR檢測外源目的基因γ-tmt和vte3的整合情況，高效液相色譜-紫外光檢測器測定植物中維生素E含量，篩選獲得維生素E含量提高的轉基因植株。獲得的轉基因植物葉片中維生素E的含量顯著提高，最高達到非轉化對照植株的1.3倍，並且，α-生育酚在生育酚總量中所佔的比例得到了顯著的提高，由原來的86％提高到99.5％以上。本發明對提高植物營養價值具有重要意義。
文檔編號G01N30/02GK101736021SQ20081020321
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月21日 優先權日2008年11月21日
發明者唐克軒, 孫小芬, 李殷 申請人:復旦大學