綠膿桿菌的ⅲ型分泌系統構成蛋白質pa1698的製作方法

2023-05-20 19:12:46 2

專利名稱：綠膿桿菌的ⅲ型分泌系統構成蛋白質pa1698的製作方法
技術領域：
本發明涉及針對綠膿桿菌的III型分泌系統構成蛋白質PA1698的抗體和含有該抗體的藥物組合物，綠膿桿菌感染症診斷劑，綠膿桿菌感染症治療劑，和綠膿桿菌的檢測試 劑盒。此外，本發明還涉及含有PA1698蛋白質或其肽作為抗原的疫苗組合物。
背景技術：
綠膿桿菌(銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是廣泛分布於土壤、水等 自然環境中的革蘭氏陰性桿菌，其引起抵抗治療的嚴重致命感染。綠膿桿菌的主要目標是 包括燙傷、器官移植或癌症患者在內的，一般被稱為易感染宿主(compromised host)的生 物體防禦功能衰弱的易感染性患者，綠膿桿菌是院內感染的主要病原菌。此外，由這種細菌 引起的肺部感染症對囊性纖維化患者是致命的。對這些患者主要施用具有抗綠膿桿菌活性 的抗菌劑，而眾多病例則因綠膿桿菌耐藥性而未能獲得充分的治療效果。另外，人們也早已 對綠膿桿菌的疫苗或抗體進行了研究。然而，直接使用該細菌滅活形式的方法具有缺點，即 必須根據綠膿桿菌的不同血清型製備不同類型的疫苗或抗體。在這種情況下，期待利用具有綠膿桿菌菌株間共同胺基酸序列的綠膿桿菌來源 的蛋白主動免疫或被動免疫來預防或治療綠膿桿菌感染。作為將綠膿桿菌來源的蛋白質 應用於疫苗的實例，已知有外膜蛋白質OprF和OprI的部分融合的重組蛋白(日本特開第 245699/1996 號公報)和 IV 型菌毛蛋白(W02004/099250)。就以綠膿桿菌來源的蛋白質作為靶向的抗體藥物，目前已經報導了，抗IV型 菌毛蛋白抗體(W02004/099250號公報)、抗PA1706 (或PcrV)抗體(US6309651號公 報和US6827935號公報)、抗PA5158抗體(W02007/049770號公報)、抗PA0427抗體 (W02007/114340 號公報)等。然而，在顯示多樣血清型的綠膿桿菌臨床分離株間共同擁有的菌體來源的蛋白由 於可以作為「綠膿桿菌共同抗原」應用於預防、診斷或治療綠膿桿菌感染症，因此一直是需 要的。由 PA1698(或 PopN)基因(Genebank 登錄號 AF010150)編碼的 PA1698 蛋白 質是構成綠膿桿菌的III型分泌系統的蛋白質(Journal ofBacteriology，2007，189， 2599-2609)。所謂III型分泌系統，是病原細菌使病原因子直接移行到宿主細胞質內時使 用的系統，由約30種蛋白質構成。這其中，已經報導了抗PA1706(或PcrV)抗體有防禦感 染作用(US6309651號公報、US6827935號公報)。然而，並不知道PA1698蛋白質在株間發生何種程度變異，沒有使用該蛋白質或部 分肽作為疫苗的成分的例子，也沒有使用由該蛋白質或部分肽產生的抗體作為感染治療藥 或診斷劑的例子。

發明內容
本發明的課題在於提供具有實質上預防或治療綠膿桿菌感染能力的抗體和疫苗組合物，它們能夠應對來自綠膿桿菌感染患者的臨床分離株的多樣性本發明人為了解決上述課題，試圖從綠膿桿菌的外膜蛋白質中探尋新的有用的 「綠膿桿菌共同抗原」，進行了各種研究，結果通過基因晶片(GeneChip)分析發現，編碼綠膿 桿菌的III型分泌系統構成蛋白質PA1698(又名PopN)蛋白質的基因無論是否存在人血 清，都穩定地表達(實施例1)。此外，還對93株綠膿桿菌臨床分離株實施了基因分析，令人 驚奇的是，PA1698蛋白質在約70%的臨床分離株中胺基酸序列完全保守，餘下的約30%的 臨床分離株中也只發現1、2處胺基酸變異(實施例2)。此外，還確認了，通過免疫PA1698 重組蛋白質獲得的抗體與PA1698蛋白質結合(實施例7 9)、該抗體呈現細胞損傷性抑制 作用(實施例10)、該抗體在綠膿桿菌感染模型小鼠中呈現高防禦感染效果(實施例11和 12)。也就是說，本發明發現，綠膿桿菌的III型分泌系統構成蛋白質PA1698蛋白質作 為綠膿桿菌共同抗原是有用的，針對該抗原的抗體與綠膿桿菌結合，能夠對綠膿桿菌感染 發揮優異的防禦效果，從而完成了本發明。本發明更詳細的是，涉及以下的發明。與綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質結合的抗體或其功能片段。根據所述的抗體或其功能片段，其中綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質為以 下(i)或(ii)中所述的蛋白質(i)含有序列號2所示的胺基酸序列的蛋白質；(ii)含有序列號2所示的胺基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1個或多個氨 基酸的胺基酸序列，且與由序列號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等功能的蛋白 質。根據所述的抗體或其功能片段，結合至綠膿桿菌表面。根據所述的抗體或其功能片段，具有抑制綠膿桿菌對人呼吸道上皮細胞 的細胞損傷活性的活性。根據所述的抗體或其功能片段，在綠膿桿菌感染的患者中具有抗菌活性。根據所述的抗體或其功能片段，在處於中性白細胞減少的狀態的患者的 綠膿桿菌感染中具有抗菌活性。根據所述的抗體或其功能片段，與由以保藏號FERM BP-11055或FERM BP-11056保藏的雜交瘤產生的抗體的表位結合。 以保藏號 FERM BP-11055 或 FERM BP-11056 保藏的雜交瘤。能夠用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，其包含含有能夠 產生針對綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質的抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物，和 根據情況1種以上的藥學上可允許的載體、稀釋劑和/或佐劑。根據所述的疫苗組合物，其中所述綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質為以下 (i)或(ii)所述的蛋白質(i)含有序列號2所示的胺基酸序列的蛋白質；(ii)含有序列號2所示的胺基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1個或多個氨 基酸的胺基酸序列，且與由序列號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等功能的蛋白 質。
根據所述的疫苗組合物，其中所述與綠膿桿菌相關的疾病是由綠膿桿菌 感染引起的全身感染疾病。能夠用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的藥物組合物，其包含_ 任一項所述的抗體或其功能片段和根據情況1種以上的藥學上可允許的載體和/或稀釋 劑。根據權利要求所述的藥物組合物，其中所述與綠膿桿菌相關的疾病是 由綠膿桿菌感染引起的全身感染疾病。綠膿桿菌感染症診斷劑，包含 任一項所述的抗體或其功能片段。綠膿桿菌的檢測試劑盒，包含 任一項所述的抗體或其功能片段。
用於實施發明的最佳方式
[抗體]本發明提供了識別綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質或其部分的抗體或其功能片 段。發現本發明的抗體結合的綠膿桿菌的PA1698蛋白質在無論血清型等如何的菌株間， 其胺基酸序列的保守性都極高(實施例2)。因此，作為本發明的抗體靶向的綠膿桿菌的 PA1698蛋白質優選是序列號2所示的胺基酸序列PAOl株來源的蛋白質、或含有序列號2所 示的胺基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列，且與由序 列號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等功能的蛋白質。胺基酸序列的取代、缺失、 插入或添加一般是1 2個胺基酸。典型的是1 2個胺基酸的取代。本發明的抗體優選通過以能夠誘發抗體的量對實驗動物施用(免疫)含有純化的 PA1698蛋白質作為抗原的抗原組合物來獲得。對從心臟或動脈採血並分離後獲得的抗血清 進行純化後，可以作為純抗體使用。本發明的抗體包括以PA1698蛋白質作為抗原，對小鼠等哺乳動物免疫該抗原而 獲得的多克隆抗體或單克隆抗體(包括產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤所產生的單克 隆抗體)，採用基因重組技術製造的嵌合抗體和人源化抗體，以及使用產生人抗體的轉基因 動物等製造的人抗體。本發明的抗體作為藥物施用給人時，從減少副作用的觀點考慮，理想 的是人抗體。所謂「人抗體」，是所有區域為人來源的抗體。本發明的人抗體可以採用本領域 技術人員公知的方法製造(例如，可以參照Intern. Rev. Immunol，1995，13，65-93 ;J. Mol. Biol，1991，222，581-597 ；特開平10-146194號公報、特開平10-155492號公報、特許 2938569號公報、特開平11-206387號公報、特表平8-509612號公報、特表平11-505107號 公報等)。「人源化抗體」，是只將小鼠抗體的抗原結合部位(CDR ；互補決定區)的基因序列 移植到人抗體基因中(CDR移植)的抗體。本發明的人源化抗體可以採用本領域技術人員 公知的方法製造(例如，可以參照EP239400、W090/07861號公報等)。「嵌合抗體」是將某種抗體的可變區和與其異種的抗體的恆定區連接的抗體。具體 可以通過，對小鼠免疫抗原，從該小鼠單克隆抗體的基因中切出與抗原結合的抗體可變部 位(V區域)，與人骨髓來源的抗體恆定部位(C區域)基因結合來製備。本發明的嵌合抗體 可以採用本領域技術人員公知的方法製造(例如，可以參照特開平8-280387號公報、美國 專利第4816397號公報、美國專利第4816567號公報、美國專利第5807715號公報等)。
本發明的單克隆抗體可以採用本領域技術人員公知的方法製造(可以參照 例如 Antibodies A LABORATORY MANUAL Ed Harlow, DavidLane Cold Spring Harbor Laboratory 1988、單克隆抗體實驗手冊(1987)講談社、富山朔二等人編、單克隆抗體雜交 瘤和ELISA(1987)講談社、巖崎辰夫等人編等)。本發明的多克隆抗體還可以採用本領域技 術人員公知的方法製造。本發明的「功能片段」，是指抗體的一部分(部分片段)，特異性識別本發明的蛋白 質的部分。具體可以列舉，Fab、Fab，、F(ab，)2、可變區片段(Fv)、二硫鍵結合的Fv、單鏈抗 體(scFv)、和它們的聚合物等。本發明的抗體，可以在綠膿桿菌感染的治療或診斷中使用，或者作為研究用試劑 使用。這種抗體包括識別PA1698蛋白質且結合至綠膿桿菌表面的抗體。作為結合至綠膿 桿菌表面的優選抗體，進行實施例8中記載的完整細胞ELISA試驗時，其吸光度顯著高於對 照。在純化IgG級分的情形時，其優選吸光度在0.3以上，更優選在0.5以上，進一步優選 在0. 8以上 ，進一步更優選在1. 0以上(例如1. 2以上、1. 4以上)。在本發明的抗體應用於綠膿桿菌感染的方案中，提供了在綠膿桿菌感染的患者中 具有抗菌活性的抗體或其功能片段。這種方案中，作為特別優選的抗體，可以列舉針對含有 序列號2所示的胺基酸序列或具有1個或多個保守取代的序列號2所示胺基酸序列的蛋白 質的抗體或其功能片段。一旦，在特別指定了對綠膿桿菌具有抗菌活性的抗體的情況下，本領域技術人員 通過指定該抗體識別的肽區域，可以製備出與該區域結合，並顯示出相同活性的各種抗體。 作為這樣的抗體的優選例子，可以列舉與以FERM BP-11055或FERM BP-11056的保藏號進 行了保藏的雜交瘤所產生的抗體的表位結合的抗體。綠膿桿菌感染的患者，可以是例如經各種藥劑給藥或放射線治療等，處於中性白 細胞減小狀態的患者。通過本發明的抗體，對容易發展成重症感染的這種患者也能發揮效 果，這點是有利的。另外，感染患者的綠膿桿菌，可以是多藥耐性綠膿桿菌。本發明的抗體， 對通常使用的抗生物質無法治療的多藥耐性綠膿桿菌所感染的患者，也能夠顯示出有效 性。此外，在瀰漫性泛細支氣管炎(DPB)或囊性纖維化病(CF)等慢性呼吸道感染病 中，呼吸道上皮細胞的粘液(粘蛋白)過度分泌引起呼吸道堵塞，這成為預後不良的重要原 因。綠膿桿菌是慢性呼吸道感染的主要病原菌。本發明的抗體，由於能夠抑制綠膿桿菌對 人呼吸道上皮細胞的細胞損傷活性，因此在慢性呼吸道感染的治療中也能夠發揮效果。作 為優選抗體，在進行實施例10中所述的實驗時，人呼吸道上皮細胞的細胞死亡的抑制率在 10%以上，更優選15%以上，進一步優選20%以上。作為這種抗體，可以列舉例如以FERM BP-11055、FERM BP-11056保藏的雜交瘤所產生的抗體。此外，本發明還提供了產生上述本發明的抗體的雜交瘤。作為優選的雜交瘤，可 以列舉於2008年10月31日提交到獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心 (〒305-8566，日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)進行保藏的保藏號為FERM BP-11055 的雜交瘤(1698-1)、FERM BP-11056 的雜交瘤(1698-2)。[疫苗組合物]綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質可以作為蛋白質抗原使用，含有這種抗原的抗原組合物可以用作用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗。因此，本發明提供了含有能夠產生針對綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質的抗體的抗原組合物的疫苗組合物。這裡的 「抗原組合物」，可以是以蛋白質抗原作為唯一構成要素的組合物，也可以是還含有其它成 分的組合物。根據本發明，能夠製造用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，該 組合物含有上述抗原組合物和根據情況1種以上藥學上可允許的載體、稀釋劑和/或佐劑。本發明的疫苗組合物中可以使用的載體基於施用模式和途徑和實際的標準藥物 製劑進行選擇，有載體蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白 (HSA)、鑰孔蟲(，〃 7力、)來源的血藍蛋白(KLH 鑰孔蟲戚血藍蛋白)等)、溶解劑(例 如乙醇、聚山梨酸酯、CremophorEL(註冊商標)等)、等滲劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例 如乳糖、澱粉、結晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質無水矽酸、碳酸鈣等)、結合劑 (例如澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、阿拉伯膠等)、潤 滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、氫化油等)、穩定劑(例如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、 Macrogol、聚氧乙烯氫化蓖麻油等)等。如有需要，還可以添加甘油、二甲基乙醯胺、70%乳 酸鈉、表面活性劑或鹼性物質(例如氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、葡甲胺、 三氨基甲烷等)等。作為載體蛋白質的具體例子，可以使本發明的肽與公知的KLH溶液(Calbiotec公 司制，每毫升50%甘油溶液溶解125mg)偶聯，以增強本發明疫苗組合物的抗原性。在本發明疫苗組合物中使用的稀釋劑基於施用模式和途徑和實際的標準藥物制 劑而選擇，可以列舉，例如，水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、碳酸氫鹽溶液等。在本發明疫苗組合物中使用的佐劑基於施用模式和途徑和實際的標準藥物製劑 而選擇，可以列舉，例如，霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、脂質體或免疫刺激性複合 體(ISC0M :immunostimulating complex)等。施用可以根據具有綠膿桿菌感染風險的施用對象的年齡、體重、性別和總體健康 狀態而不同，但是施用可以通過經口施用和非經口施用(例如靜脈施用、動脈施用、局部施 用)的任一途徑來實施，但優選非經口施用。用於經口施用和非經口施用的劑型及其製備 方法是本領域技術人員眾所周知的，其可以通過將本發明的抗原組合物與藥學上允許的上 述載體等混合等方式，按照常規方法來製造。用於經口施用的劑型，可以列舉固體或液體劑 型，具體為溶液劑、片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等。用於非經口施用的劑型可以列舉溶液劑、 混懸劑、軟膏劑、乳膏劑、栓劑、眼藥劑、滴鼻劑和滴耳劑等。經口施用時，還可以添加香味劑 和著色劑。若需要本發明製劑的持續釋放，則可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙 交酯共乙交酯、聚乙交酯等)作為增容基質(見例如美國專利5，417，986號公報、美國專利 4，675，381號公報、美國專利4，450，150號公報))。合適的藥物載體和稀釋劑等以及為了使用它們所需的醫藥上所需物質記載在 Remington' s Pharmaceutical Sciences 中。本發明疫苗組合物的施用量，由本發明人基於例如疫苗抗原的類型、本發明的抗 原是否與佐劑組合施用、與本發明抗原共同施用的佐劑的類型、施用模式和頻率以及希望 的效果(例如預防或治療效果)而確定，並且通常以每個成人每次Iyg-IOOmg的劑量施用本發明的疫苗組合物。當本發明疫苗與佐劑一起施用時，劑量可以通常是每個成人每次施 用Ing-Img劑量。這種劑量可以根據本發明人的決定按照需要重複施用數次。例如，可以 在實施初始接種後，接著進行間隔1周時間的後續3次加強接種。或者，可以使用相同的調 和劑，在首次免疫接種後第8 12周時進行加強注射，以及在第16-20周時進行第二次加 強注射[抗體的用途和藥物組合物]與綠膿桿菌相關的疾病綠膿桿菌是因宿主抵抗力降低而造成致命後果的機會感染病原菌，而且，由於其 對抗生物質有抵抗性，因此也是醫院內感染的主要病原菌。如稍後在實施例中顯示，在巨 噬細胞功能因施用粘蛋白而降低的小鼠綠膿桿菌易感染性模型中，本發明的抗體確實具有 防禦感染效果(實施例11)，另外在中性白細胞因施用一水合環磷醯胺而減少的小鼠綠膿 桿菌易感染性模型中，確認了本發明的抗體確實具有防禦感染效果(實施例12)。此外，作 為本發明的抗體具有防禦感染效果的理由之一，可以列舉抑制綠膿桿菌導致的細胞損傷性 (實施例10)。因此，本發明的抗體對於與綠膿桿菌相關的疾病的預防或治療有用。與綠膿桿菌相關的疾病，可以列舉包括多藥耐性綠膿桿菌在內的綠膿桿菌感染引 起的全身感染疾病，例如敗血症、髓膜炎和心內膜炎等。還可以列舉耳鼻科領域的中耳 炎和鼻竇炎；呼吸器官科領域的肺炎、慢性呼吸道感症、導管感染症；外科領域的術後腹膜 炎、術後膽道等發炎的術後感染症；眼科領域的眼瞼膿腫、淚囊炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜 膿腫、全眼球炎、眼眶感染；泌尿器官科領域的包括複雜的泌尿道感染症的泌尿道感染症、 導管感染症和肛周膿腫等。此外，還可以列舉包括重度燒傷和呼吸道燒傷在內的燒傷、褥瘡 感染症、囊性纖維化等。本發明提供了與綠膿桿菌相關的疾病的預防方法或治療方法，其包括對包括人在 內的哺乳類施用預防上或治療上有效量的本發明的抗體的工序。綠膿桿菌感染症診斷劑如稍後在實施例中所示，已經證實本發明的抗體與綠膿桿菌結合(實施例8)。這 些結果提示，本發明的抗體能夠檢測綠膿桿菌的存在。因此，本發明的抗體可以用作綠膿杆 菌感染症診斷劑。此外，本發明還提供了採用本發明的抗體的綠膿桿菌感染的診斷方法。本發明的診斷方法可以通過如下方式實施，即從包括具有綠膿桿菌感染風險的人 在內的哺乳動物中採集痰、肺洗出液、膿、淚、血液或尿等生物樣本，然後將收集的樣品與本 發明的抗體接觸，判斷是否發生抗原抗體反應。綠膿桿菌感染症診斷劑試劑盒根據本發明，提供了用於檢測綠膿桿菌存在的試劑盒，其至少包含本發明的抗體。 本發明的檢測試劑盒所含的抗體可以被標記。該檢測試劑盒能夠利用抗原抗體反應，檢測 綠膿桿菌的存在。本發明的檢測試劑盒，根據需要，還可以含有用於實施抗原抗體反應的各種試劑， 例如ELISA法等中使用的第二抗體、發色試劑、緩衝液、說明書和/或器具等。藥物組合物 本發明的藥物組合物或藥劑可以以本發明的抗體作為有效成分來使用，優選可以以含有純化的抗體組合物和任意成分如生理鹽水、葡萄糖水溶液或磷酸鹽緩衝液等的組合 物的形式使用。本發明的藥物組合物可以根據需要配製成液體或冷凍乾燥的形式，此種藥物組合 物可以任選地含有藥學上允許的載體，例如穩定劑、防腐劑和等滲劑(isotonic agent)等。作為藥學上允許的載體，在冷凍乾燥製劑的情形時，可以列舉甘露醇、乳糖、蔗糖、 人白蛋白等，在液狀製劑的情形時，可以列舉生理鹽水、注射用水、磷酸鹽緩衝液、氫氧化鋁 等。但並不限於這些實例。施用可以根據施用對象的年齡、體重、性別和總體健康狀態而不同，但是施用可以 通過經口施用和非經口施用(例如靜脈施用、動脈施用、局部施用)中的任一種施用途徑來 施用，優選是非經口施 用。藥物組合物的施用量根據患者的年齡、體重、性別和總體健康狀態、綠膿桿菌感染 症的程度和施用的抗體組合物的成分而不同。本發明的抗體組合物，靜脈內施用時，通常是 對成人Ikg體重1日施用0. 1-lOOOmg，優選施用l-100mg。本發明的藥物組合物優選事先施用至具有綠膿桿菌感染風險的患者。當製備為診斷劑時，可以通過採用適合此目的的任意手段以任意劑型獲得。例如 測定腹水、含有目的抗體的培養液或經純化抗體的抗體滴度並且以PBS(含有生理鹽水的 磷酸緩衝液)等適度地稀釋，並且隨後對其添加作為防腐劑的0.1%疊氮鈉等。或者，測定 吸附至乳膠等的本發明抗體的抗體滴度並且適度地稀釋，並對其添加防腐劑再使用。前述 這樣的與乳膠粒子結合的本發明抗體是作為診斷劑的優選劑型之一。在這種情況下，適宜 的樹脂材料例如聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯、聚丁二烯等是作為乳膠而適用的。
實施例本文中此後，本發明將按照用於促進理解本發明的實施例進行說明，然而，本發明 將不限於這些實施例。使用GeneChipK表達分析系統(Affymetrix公司制GeneChipK銅綠假單孢菌基因 組陣列)作為用於探索人血清添加培養基中表達的基因的方法。使用綠膿桿菌PAOl菌株， 在2種培養條件即0%、50%人血清添加Luria-Bertani (LB)培養基(Nacalai Tesque公司 制)(最終的LB培養基組成是均一的)中在37°C實施振蕩培養直至吸光度在595nm處達到 1.0，使用RNeasy Protect Bacteria Mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司制)，按所附文件的 方法，提取總RNA，並使用2100生物分析儀(Agilent Technologies公司制)定量。然後， 按照GeneChipK所附文件的方法進行實驗。使用Microarray Suite 5. 0 (Affymetrix公司 制)分析基因表達數據，並且計算信號及檢測。在此時，實施校正，使來自全部探針組的信 號的平均值是1000。實施了兩次獨立的實驗。結果是，在任一培養條件下，無論添加的血清存在或不存在，將顯示檢測到轉錄產 物確定為作為持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是「存在」的，表明該基因表達 了。此外，確定作為與PA5158 (OpmG)和PA2019 (MexX)蛋白結合以構成藥物排出泵的內膜 跨越蛋白並受到核糖體抑制劑例如四環素或氨基糖苷類抗生素誘導的PA2018蛋白(MexY) (J. Bacteriology, 2005,187, 5341-5346)在沒有前述那些藥物的這些條件下是「不存在」的，並且因此表明基因不表達。另一方面，在任一培養條件下，無論添加的血清存在或不存在，確定PA1698基因是「存在」的。由以上表明PA1698基因的確表達了，且提示其基因產物PA1698蛋白質可能穩定 地存在。所用菌株是分離自日本各地臨床機構的多種類型臨床材料的93株綠膿桿菌(明 治制果株式會社，貯藏於橫濱研究所)，將這些菌株提供給試驗。這些菌株源自血液、尿、痰、 膿、咽粘液等，基於綠膿桿菌研究會主辦的分型研究委員會的決定(1975年)作出的血清學 分類，它們的血清型包括A群、B群、E群、G群、I群、M群等。(1)基因組DNA的製備93株臨床分離的綠膿桿菌，於Mueller-Hinton培養基(BectonDickinson公司 制)中37°C培養過夜，再通過低速離心來收集。使用DNeasy組織試劑盒(QIAGEN GmbH公 司制)，根據隨該試劑盒所附的文件中描述的方法，從獲得的菌體中製備基因組DNA。(2)通過PCR方法擴增DNA片段以製備的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增了含有PA1698基因的區域。具體是， 基於綠膿桿菌PAOl菌株的基因組序列(NCBI資料庫中登錄號NC_002516)為基礎，設計特 異性擴增PA1698基因的引物組(序列號3、序列號4)，按照Takara ExTaq(Takara bio株 式會社制)中所附說明書，使用GeneAmp PCR System 9700 (Applied BioSystems公司制)， 實施PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳確認了通過PCR擴增的DNA片段具有目的大小(1128個鹼 基對)。(3)使用DNA測序儀分析多核苷酸序列PCR 產物使用 MultiScreen PCR 板(Millipore Corporation 公司制)純化後， 提供給測序反應。以PAOl株的基因組序列(NC_002516)為基礎，設計能夠測序各PCR產 物的引物(序列號5 序列號7)，測序反應中使用BigDye Terminator vl. 1循環測 序試劑盒(Applied BioSystems公司制)。測序反應按所附的說明書，用GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBioSystems公司制)實施。使用事先以水溶脹的S印hadex G_50Fine DNAGrade (Amersham Biosciences AB 公司制)所填充的 MultiScreen-HV 板(Millipore Corporation公司制)純化測序反應產物後，使用AppliedBiosystems 3730 DNA分析儀 (Applied Biosystems公司制)分析多核苷酸序列。將經上述分析判明的臨床分離株的多核苷酸序列轉換成多肽序列，並與PAOl株 的多肽進行比較研究，結果發現了 PA1698蛋白質的全長序列中有15處變異(表1)。但是，我們確認約70%的臨床分離株中胺基酸序列完全保守，剩下的約30%中只 有1、2處胺基酸變異，存在對所有綠膿桿菌都保守的區域。由此提示，綠膿桿菌的PA1698 蛋白質作為「綠膿桿菌共通抗原」是有用的。表1臨床分離株中PA1698蛋白質的突變模式
權利要求
與綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質結合的抗體或其功能片段。
2.根據權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質為以 下(i)或(ii)中所述的蛋白質(i)含有序列號2所示的胺基酸序列的蛋白質；( )含有序列號2所示的胺基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1個或多個胺基酸 的胺基酸序列，且與由序列號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等功能的蛋白質。
3.根據權利要求1所述的抗體或其功能片段，結合至綠膿桿菌表面。
4.根據權利要求1所述的抗體或其功能片段，具有抑制綠膿桿菌對人呼吸道上皮細胞 的細胞損傷活性的活性。
5.根據權利要求1所述的抗體或其功能片段，在綠膿桿菌感染的患者中具有抗菌活性。
6.根據權利要求5所述的抗體或其功能片段，在處於中性白細胞減少的狀態的患者的 綠膿桿菌感染中具有抗菌活性。
7.根據權利要求1所述的抗體或其功能片段，與由以保藏號FERMBP-11055或FERM BP-11056保藏的雜交瘤產生的抗體的表位結合。
8.以保藏號FERMBP-11055或FERM BP-11056保藏的雜交瘤。
9.能夠用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的疫苗組合物，其包含含有能夠產生針 對綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質的抗體的蛋白質抗原或肽抗原的抗原組合物，和根據情 況1種以上的藥學上可允許的載體、稀釋劑和/或佐劑。
10.根據權利要求9所述的疫苗組合物，其中所述綠膿桿菌來源的PA1698蛋白質為以 下(i)或(ii)所述的蛋白質(i)含有序列號2所示的胺基酸序列的蛋白質；(ii)含有序列號2所示的胺基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了1個或多個胺基酸 的胺基酸序列，且與由序列號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等功能的蛋白質。
11.根據權利要求9所述的疫苗組合物，其中所述與綠膿桿菌相關的疾病是由綠膿杆 菌感染引起的全身感染疾病。
12.能夠用於預防或治療與綠膿桿菌相關的疾病的藥物組合物，其包含權利要求1-7 任一項所述的抗體或其功能片段和根據情況1種以上的藥學上可允許的載體和/或稀釋 劑。
13.根據權利要求12所述的藥物組合物，其中所述與綠膿桿菌相關的疾病是由綠膿杆 菌感染引起的全身感染疾病。
14.綠膿桿菌感染症診斷劑，包含權利要求1-3任一項所述的抗體或其功能片段。
15.綠膿桿菌的檢測試劑盒，包含權利要求1-3任一項所述的抗體或其功能片段。
全文摘要
目的在於提供具有實質上預防或治療綠膿桿菌感染能力的、能夠應對綠膿桿菌感染患者來源的臨床分離株的多樣性的抗體和疫苗組合物。根據本發明，提供了針對綠膿桿菌的III型分泌系統構成蛋白質PA1698蛋白質或其肽的抗體以及含有這些蛋白質或肽的疫苗組合物。
文檔編號G01N33/53GK101970468SQ20088012286
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月24日 優先權日2007年12月25日
發明者二宮智尚, 大塚圭子, 熊谷正志, 田中二朗, 赤羽宏友, 鈴木貴久, 長曾宏 申請人:明治制果株式會社