一種柯薩奇病毒a16型病毒株及其應用的製作方法

2023-05-21 02:48:56 1

專利名稱：一種柯薩奇病毒a16型病毒株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及病毒學、分子生物技術領域，具體地說，涉及一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應用。
背景技術：
手足口病(Hand foot mouth disease,HFMD)是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報導，常見於嬰幼兒，由腸道病毒引起。臨床上以發熱和手、足、口腔等部位出現皮疹、潰瘍等表現為主，與心肌炎、心包炎、難治性休克等綜合性疾病相關。柯薩奇病毒(Coxasckievirus) A16型(Cox A16, CA 16)是手足口病主要病原體之
一，是小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，呈20面立體對稱球形，直徑約23_30nm。主要經
糞-口、呼吸道和密切接觸傳播，可通過胎盤傳給胎兒引起宮內感染。早期發現的手足口
病的病原體主要為Cox A16型，20世紀70年代後，與EV71感染交替出現，成為手足口病的
主要病原體。我國北京、福建、天津、吉林、山東、廣東、深圳、浙江、四川、安徽等多個省份均
有報導。手足口病的爆發和流行嚴重影響了人們的日常生活，造成巨大的經濟損失和社會
負擔，利用病毒疫苗從根本上切斷病毒的傳播是目前較為有效的預防途徑之一，目前尚無
CA16病毒疫苗的報導，因此分離出適於疫苗生產的CA16病毒株具有巨大的經濟和社會效.、
Mo

發明內容
本發明的目的是提供一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應用。為了實現本發明目的，本發明的一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCCN0.5371，現已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年10月17日。在電鏡下觀察該毒株，病毒顆粒呈20面立體對稱球形,直徑約30nm。本發明還提供上述病毒株產生的多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結構蛋白。本發明還提供編碼上述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結構蛋白的基因。本發明還提供含有上述基因的載體以及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供所述病毒株，所述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結構蛋白，編碼所述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結構蛋白的基因，含有所述基因的載體或含有所述載體的宿主細胞在製備預防或治療由柯薩奇病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應用。前述的應用，其是將所述柯薩奇病毒A16型病毒株經過感染細胞(如vero細胞、人二倍體細胞或其它敏感細胞)、培養、收穫病毒液、滅活和純化後，得到疫苗原液，用於進一步製備CA16疫苗。本發明還提供以柯薩奇病毒A16型病毒株，保藏號CGMCCN0.5371為免疫原製得的抗體或雜交瘤細胞或抗血清。
本發明還提供用於檢測所述柯薩奇病毒A16型病毒株的引物，包括CA16上遊引物:5』 -TTGCAGACATGATTGACCAG-3』 和 CA 16 下遊引物:5』 -GAGTGATGGTTCAACACACA-3 』。本發明還提供含有上述引物的用於檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒。本發明進一步提供所述柯薩奇病毒A16型病毒株產生的VPl蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼該VPl蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。對VPl全長序列分析和質譜分析結果表明該毒株為CA16病毒，且無外源物汙染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。本發明還提供一種製備抗體或雜交瘤細胞或抗血清的方法，其是以本發明的柯薩奇病毒A16型病毒株(CGMCC N0.5371)為免疫原。藉由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果:(一 )通過蝕斑法分離得到的本發明的單克隆CA16病毒株，其子代病毒表現為遺傳穩定，可用於人用CA16疫苗生產。( 二)利用本發明的CA16病毒株或由其生產的疫苗可用於預防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。(三)本發明的CA16病毒株可在VeiO細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.41gCCID50/ml。


圖1為本發明CA16病毒株電鏡觀察結果(放大比例:100，000倍)。圖2為本發明CA16病毒株蛋白質譜分析結果。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1CA16病毒株的分離、培養和鑑定(一)病毒分離、培養自2010年浙江省手足口疫區(手足口累計發病人數達111783)收集CA16病毒PCR結果陽性的病人糞便標本，經處理後接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養三代進行病毒分離，得到CA16病毒後，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。( 二)病毒鑑定1、VP1全長序列分析結果對該毒株產生的VPl蛋白進行VPl全長序列分析，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼該VPl蛋白的基因序列如SEQ ID N0.1所示.
2、電鏡檢查結果在電鏡下觀察該株CA16病毒，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約30nm。(圖1)3、質譜分析結果對該株CA16病毒蛋白進行質譜分析，結果表明此毒株蛋白確為CA16病毒蛋白(圖 2)。4、無菌、支原體檢查結果對該株CA16病毒進行無菌、支原體檢查，結果表明無支原體和其它微生物汙染。(按照《中國藥典》方法進行檢測)5、病毒滴度檢測結果採用微量滴定法測定該株病毒收穫液的病毒滴度，病毒滴度可達7.41g CCID50/ml ο方法如下:採用Vero細胞進行病毒滴度的測定。用96孔細胞培養板培養Vero細胞，細胞成片後將病毒用細胞維持液從KT1倍比稀釋至10_8，棄去VeiO細胞上清，分別加入每個稀釋度的病毒液，接種50 μ I/孔，每個稀釋度接種8孔，同時設細胞對照。置37°C，5%CO2培養箱培養，7d觀察細胞感染病毒情況，計算病毒滴度。6、抗原含量檢測米用酶聯免疫法對該株CA16病毒抗原含量進行檢測，抗原含量不低於200U/ml。採用雙抗體夾心法定量測定樣品中CA16抗原含量。首先將特異性CA16多克隆抗體包被於酶標板形成固相抗體；然後加入CA16樣品，與固相抗體形成固相抗原抗體複合物；最後加入酶標記抗體，樣品中的CA16抗原可與酶標抗體發生特異性結合，當加入底物時出現成色反應，用酶標儀在適當波長測定OD值，通過EXCEL統計分析結果。實施例2檢測CA16病毒株的引物及試劑盒1、用於檢測CA16病毒株的引物，包括:CA16 上遊引物:5』 -TTGCAGACATGATTGACCAG-3』 和CA 16 下遊引物:5 』 -GAGTGATGGTTCAACACACA-3，。2、含有上述引物的用於檢測CA16病毒株的檢測試劑盒。實施例3CA16疫苗的製備CA16病毒株經過感染vero細胞、培養、收穫病毒液、滅活和純化後，得到疫苗原液，用於進一步製備CA16疫苗。(I)建立細胞主種子和工作種子庫(Vero細胞)將源自美國ATCC120代非洲綠猴腎細胞(Veix)細胞)種子復甦，具體操作是:自液氮中取出細胞凍存管，置於39-40 V無菌水中，一分鐘之內解凍細胞，無菌吸出懸液，IOOOrpm離心3min，棄上清，加入含10 %小牛血清的MEM細胞生長液，輕輕吹打使其混勻，將混勻的細胞懸液接種於25cm2的細胞培養瓶中，置37°C，5% CO2培養箱培養，待其貼壁後進行換液，再置37°C，5% CO2培養箱培養，5-7天細胞匯合度達到100%時按1: 4進行傳代，每傳代一次細胞代次增加一代。按上述方法製備129代Veix)細胞工作種子庫。依據上述方法，本領域的研究人員能同樣製備出滿足本發明要求的工作種子庫。細胞主種子庫和工作種子庫均保存在液氮(_196°C )中。(2)建立主代病毒種子庫和工作種子庫CA16病毒PCR結果陽性的手足口病患者 的臨床標本，經處理後接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養三代進行病毒分離，得到CA16病毒後，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。按照《中國藥典》關於種子庫建立方法的要求建立病毒主種子庫和工作種子庫，種子庫均冷凍保存(_60°C以下)。建庫方法如下:將CA16病毒株按1: 1000(體積比)接種至匯合度在100%的VeiO細胞(來自細胞工作種子庫)瓶中(培養基是含2%小牛血清的MEM細胞生長液)，置37°C ,5% CO2培養箱培養，每天觀察細胞病變(CPE)。當CPE達+++至++++時收穫病毒，置-20°C冷凍，室溫融化後，將凍融物按上述方法繼續傳代建立病毒主代種子庫和工作種子庫。並送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏。其保藏號為CGMCCN0.5371。每一批收穫液記為一代。(3)病毒收穫液製備復甦VeiO工作種子庫細胞，經擴增後，將本發明的CA16病毒株按比例接種於長至薄單層的細胞瓶內，37°C培養，每天觀察細胞病變，當細胞病變達50%以上時，收穫病毒液，混勻後置-20°C保存,備用。(4)病毒滅活和純化將上述製備的CA16病毒收穫液用1: 100-1: 10000 (v/v)的β -丙內酯或I: 1000-1: 10000 (ν/ν)的甲醒溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以後進行。病毒滅活後將上述滅活液進行離心澄清後，進行超濾透析，體積濃縮至原體積的1/10-50。得到的病毒超濾液加入磁力攪拌子，置於磁力攪拌器上攪拌，同時緩慢加入PEG，使PEG終濃度為5-15%，調PH值至5.0-7.0之間，繼續攪拌10_60min。於2_8°C沉澱8_24h後離心20-60min，沉澱用PBS緩衝液重溶，離心後獲得病毒沉澱液。病毒沉澱液再經蔗糖密度梯度離心，收集病毒所在區帶後，經超濾脫糖得到病毒脫糖液。病毒脫糖液經分子篩層析後得到病毒層析液，層析液經除菌後得到疫苗原液。(5)疫苗製備將上述疫苗原液與氫氧化鋁佐劑按適宜比例吸附後即獲得CA16疫苗半成品。CA16半成品經分裝，檢定 後即為成品疫苗。實施例4CA16病毒株免疫原性試驗將實施例3中製備的疫苗原液CA16毒株在Vero細胞上進行擴大培養，純化，滅活後免疫小鼠、紐西蘭兔、羊均獲得較好的保護效果。原液製備方法同實施例3所述。其中，對羊進行的免疫原性試驗如下:將疫苗原液與氫氧化鋁佐劑等比例吸附後，於第O天、7天、14天、21天對羊進行免疫，2ml/只/次，在整個試驗期內，對動物的健康情況、行為變化等做詳細記錄。在免疫當天動物應當觀察半小時。每天兩次觀察動物有無死亡情況。分別於第O天、7天、14天、21天、28天進行採血。靜脈採少量血，3000rpm離心lOmin，分離血清。進行抗CA16中和抗體滴度測定，方法如下:在96孔細胞培養板內加入分離獲得的羊血清，用維持液進行倍比稀釋至一定濃度後，加入事先稀釋至100CCID50的CA16檢定毒株溶液，中和1.5h_2h後加入檢用細胞懸液，細胞濃度為1.5-2.0X IO5個/ml，置於37°C，CO2培養箱進行培養。5_7天後觀察細胞病變情況，其中以出現細胞病變的血清最高稀釋度為血清中和效價，陽性判定指標:中和效價大於1: 8，陰性對照血清效價小於1: 8。結果見表I。表I對羊進行免疫原性試驗的中和抗體檢測結果
權利要求
1.一種柯薩奇病毒A16型病毒株,其保藏號為CGMCC N0.5371。
2.權利要求1所述病毒株產生的VPl蛋白，其胺基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.碼權利要求2所述VPl蛋白的基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
5.有權利要求3或4所述基因的載體及含有該載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述病毒株，權利要求2所述VPl蛋白，權利要求3或4所述的基因，權利要求5所述的載體及含有該載體的宿主細胞在製備預防或治療由柯薩奇病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，權利要求1所述病毒株經過感染細胞、培養、收穫病毒液、滅活和純化後，得到疫苗原液，用於進一步製備柯薩奇病毒A16型疫苗。
8.按權利要求1所述的病毒株為免疫原製得的抗體或雜交瘤細胞或抗血清。
9.測權利要求1所述病毒株的特異性引物，包括: CA 16 上遊引物:5』 -TTGCAGACATGATTGACCAG-3』 和 CA 16 下遊引物:5』 -GAGTGATGGTTCAACACACA-3』。
10.有權利要求9所述引物的用於檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒。
全文摘要
本發明提供了一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC No.5371。對該毒株產生的VP1蛋白進行全長序列分析和質譜分析結果表明是CA16病毒，且無外源物汙染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。該株CA16病毒可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.41g CCID50/ml。利用本發明的CA16病毒株或由其生產的疫苗可用於預防由CA16病毒引起的疾病，且具有滴度穩定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。
文檔編號C12N5/10GK103087994SQ20111034437
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者高強, 李雅靜, 王巍巍, 尹衛東 申請人:北京科興生物製品有限公司