一種基於自體細胞的人工關節軟骨及其製備方法

2023-05-20 20:23:11

專利名稱：一種基於自體細胞的人工關節軟骨及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種基於自體細胞的人工關節軟骨及其製備方法，屬於生物醫 生技術領域。
背景技術：
關節軟骨是關節功能執行的必要成分，由軟骨組織及其周圍的軟骨膜構 成，軟骨組織則由軟骨細胞、基質及纖維構成。軟骨細胞是關節軟骨中的唯一 細胞，其不斷分泌產生新的軟骨基質，最終形成軟骨層。軟骨細胞位於軟骨基 質內的軟骨陷窩中，各個細胞均分別圍以軟骨囊，生活時充滿軟骨陷窩內，不 能遷移。透明軟骨基質非常複雜，有多種生物高分子物質，而且還含有多種適 當的細胞因子等。這些基質通常是可影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增 殖和分化生物活性物質，且有嚴格的環境條件。透明軟骨基質的主要化學組成 主要為羽狀分支大分子的軟骨粘蛋白，其主要成分是酸性糖胺多糖
(glycosaminoglycan)。這種羽狀分支的大分子結合著大量的水，大分子之間又 相互結合構成分子篩，並和膠原原纖維結合在一起形成固態的結構。軟骨內無 血管，但由於軟骨基質內富含水分(約佔軟骨基質的75%)，營養物質易於滲透， 故軟骨深層的軟骨細胞仍能獲得必需的營養。透明軟骨中無膠原纖維，但有許 多細小的無明顯橫紋的膠原原纖維，纖維排列不整齊。除關節面的關節軟骨外， 軟骨的表面均覆有軟骨膜。軟骨膜是較緻密的結締組織，即分內、外二層，外 層纖維多，細胞少，主要起保護作用，內層纖維少，細胞較多，其中有些梭形 小細胞，稱骨原細胞，可增殖分化為軟骨細胞。
關節軟骨沒有神經支配，也沒有血管及淋巴組織，其營養成分必須從關節 液中取得，而其代謝廢物也必須排至關節液中，關節軟骨的這種營養代謝必須 通過關節運動，使關節軟骨不斷的受到壓力刺激才行，所以關節運動對於維持 關節軟骨的正常結構起重要的作用。
由於關節軟骨自身修復能力低下，病損關節往往表現為不可扼制的逐步惡 化。關節軟骨修復能力低下主要源於操作部位缺乏足夠的軟骨細胞修復，由於軟骨細胞幾乎沒有遷移能力，不能迅速聚集到創傷部位。關節軟骨沒有血液供 應，且軟骨細胞又包埋於稠厚的細胞外基質中，無法移動到操作部位參與修復， 滑液細胞數量太少，無法進行有效修復。而其它可形成軟骨細胞的體內細胞， 包括軟骨膜骨原細胞，骨髓間充質幹細胞，肌肉來源的幹細胞等，由於空間時 間及組織阻隔，無法自由移動到關節軟骨缺損部位；而且即使在某些情況下這 些幹細胞能自由移動到軟骨層(比如關節軟骨伴隨軟骨下骨缺損時，形成骨髓 與軟骨層之間的通道，因此骨髓間充質幹細胞可以自由移動到軟骨層)，但由 於幹細胞分化為軟骨細胞並行使正常的生理功能修復關節軟骨有嚴格的環境 條件，否則易發生退行性變化，極易形成力學強度遜色很多的纖維軟骨，以至 於達不到修復的目的。解剖結構上與關節軟骨鄰近的是軟骨膜骨原細胞，但軟 骨膜結構是緻密結締組織，細胞不可能自由遷移到關節軟骨的損傷部位上，修 復關節軟骨層。
對於不嚴重的關節受損可以用關節鏡灌洗術和關節清理術等最基本的傳 統治療手段，但在軟骨受損嚴重時必須用軟骨修復。關節軟骨修復至今沒有比 較理想的技術，目前軟骨修複方法主要有剌激關節軟骨自身修復的方法、自體 軟骨移植、自體軟骨膜/骨膜移植、自體軟骨細胞移植、異體軟骨移植、人工 軟骨置換等，但這些技術都有一定缺陷。
剌激關節軟骨自身修復包括軟骨整形、磨削關節成形術、軟骨下骨鑽孔、 微骨折術等方法，缺點是這種方法修復的組織易形成纖維軟骨，脆性大，不耐 用，最終會發生退變。
自體軟骨移植是目前關節軟骨修復效果最佳者，但其手術總優良率僅在
70%左右，適應症範圍也非常狹窄；由於軟骨材料來源有限，自體軟骨移植不 適宜於大面積軟骨缺損患者，而且供體部位常發生繼發性病變；此外需要二次 手術，手術的過程相對複雜；易產生恢復緩慢、疼痛、骨折、流血等併發症和 術後疤痕；在移植軟骨和原始組織之間存在裂縫等種種缺陷。
軟骨膜的來源僅限於肋骨，取材有限，應用受到限制，且遠期效果不佳。 自體骨膜移植技術取材方便，可早期修復損傷的關節軟骨缺損，改善症狀，但 存在早期退變，再生軟骨易鈣化，遠期效果不穩定等缺點，而且這些組織移植 後生成的軟骨樣組織的生物學性能、耐磨性、韌性均欠佳。
自體軟骨細胞移植是最近才開始採用的一種方法，這種方法需要進行手術
5來獲取骨細胞並在外面培養以後移植到損傷的關節軟骨區域，因而病人需要進 行二次手術，並且手術過程很複雜和困難，而且軟骨細胞易纖維化，脆性大， 狀態不佳、擴增能力喪失、壽命不長，即退行性變化。因此據臨床統計，自體 軟骨細胞移植的總有效率也僅到百分之七十多。
同種異體骨軟骨和異種骨軟骨移植材料獲得相對較易且可預製成任意形 狀和大小，因此比自體移植更常用。但是，因新鮮軟骨的供應和如何防止細菌 及病毒性疾病的傳播等問題限制了異體骨軟骨移植的使用；冷凍移植則無法保 證軟骨細胞的活性。研究證實，冷凍異體軟骨的彈性係數及黏度係數有顯著性 改變，軟骨進行性退變，軟骨表面裂隙明顯，因凍存致使移植物出現不可逆的 生物力學改變。異體軟骨曾廣泛應用，由於可引起免疫排斥反應，導致細胞死 亡及功能喪失，因而未能廣泛應用。
人工軟骨其實分為兩種 一種不含軟骨細胞，這是目前研究較多的；另一 種則不僅含軟骨細胞，且包含軟骨細胞培養支架體系，可稱為組織工程化人工 軟骨。組織化工程人工軟骨至今沒有商業化產品。
前者是目前研究較多的人工軟骨類型，這類人工軟骨植入材料主要分為兩 類，即人工合成的材料和天然生物材料，具體而言，主要有金屬-超高分子 量聚乙烯對磨關節假體、矽橡膠、聚氨酯關節軟墊材料、聚乙烯醇水凝膠等。 天然生物材料生物相容性好，通常都有利於細胞粘附、增殖、分化，但同時也 具有一些無法彌補的缺點，如孔隙率低，孔隙小；降解速度慢，缺乏一定的機
械強度，難於塑形，因而無法在關節軟骨中單獨使用。人工材料的軟骨假體雖 然在一定程度上能起到替代軟骨的作用，但還存在易磨損鬆動、界面潤滑性差、 缺乏生物活性等等不足，其性能有待進一步提高。此外，在對人體軟骨進行植 入修復時，以上材料還存在與軟骨下骨固定的問題。現在臨床上一般採用嵌入 固定、螺絲固定、不鏽鋼網固定、骨水泥粘結等方法植入缺損部位，但各自均 存在不同問題，.如連接鬆動、固定效果差、人工軟骨與底骨結合不牢固、手術 難度和風險大等，影響了人工軟骨的置換和替代效果。
但以上材料最大的缺陷，是它們都沒有利用軟骨細胞，以至於達到的修復 效果有限。正如上所述，軟骨細胞則是軟骨層修復的唯一細胞來源。軟骨細胞 不斷產生新的軟骨基質形成軟骨層。沒有軟骨細胞參與的修復，人工軟骨的修 復只能起到臨時替代及緩解疼痛的作用，無法達到真正意義上的生理修復。為了達到真正意義上的修復，必須利用軟骨細胞。然而體外關節軟骨細胞 培養有很多難題沒有解決。因為關節軟骨細胞增殖困難，在體外通常需要長時 間的增殖才能達到所需的數量，難以滿足臨床要求；而且含活細胞成分的關節 軟骨，生產成本昂貴，製備方法工藝複雜，生產周期長，加工過程中難以避免 產品受到汙染，貯存運輸成本高；由於活細胞多來源於異體細胞，可引起免疫 排斥反應，非目前通用的免疫抑制劑可以控制，無法徹底消除免疫原性，即使 用高效免疫抑制劑，也很難保證不被排斥；異體細胞的引入導致無法完全避免 攜帶病毒、傳播疾病的風險。並且軟骨細胞行使正常生理功能，修復軟骨層， 需要嚴格的環境條件。這些嚴格的環境條件，包括各種適當的細胞因子及剌 激原的剌激作用，關節活動的刺激等，否則易於形成力學性能遜色很多的纖維 軟骨，而非在關節透明軟骨——纖維軟骨和關節軟骨兩者力學性能上有很大的 不同，纖維軟骨難以執行關節軟骨的功能。這不僅是體外培養軟骨細胞目前尚 未解決的難題，而且在體內進行軟骨細胞移植修復時，同樣也會遇到的棘手問 題。
因此，誘導關節軟骨原位再生是一個理想的做法，目卩使植入人工軟骨 的材料有良好的生物相容性，並植入缺損關節軟骨，誘導體內幹細胞遷移並分 化為軟骨細胞，並發揮正常生理功能，原位修復關節軟骨；植入的人工軟骨在 關節軟骨修復後，自動安全降解。這是一個理想的研究方向。
而採用這種方法，需要解決若干問題首先就是體內遷移細胞的來源。細 胞可以來源於關節滑液細胞，也可以來源於軟骨下骨細胞。而且，關節滑液中 的軟骨細胞儘管數量少，但完全可以自由遷移進入關節軟骨缺損部位。
鑑於軟骨細胞幾乎沒有遷移能力，滑液細胞數量太少，而其它可分化為正 常軟骨細胞，如骨骼間充質幹細胞、軟骨膜細胞等，由於組織屏障，正常情 況下都不可能自由的移動到關節軟骨的損傷部位上並進行軟骨修復。因此，一 般關節軟骨缺損是無法自然修復的。
然而，在針對關節軟骨缺損的研究中發現，僅軟骨層部分缺損時,關節軟骨 基本無再生能力,而當伴有軟骨下骨缺損時,骨組織中間充質幹細胞可以向缺損
區遷移並發生增殖和分化,充填缺損區,但此時缺損區主要由纖維軟骨而非透明 軟骨充填。也就是說，骨組織和關節軟骨在體內空間位置上相互接近，組織阻 隔在軟骨下層，因此完全可以通過對軟骨下骨打孔形成通道，而介導骨髓間充質幹細胞的遷移至軟骨受損區。在最近的研究中，有對關節表面進行打孔、將 含有骨形成蛋白(BMP )的膠原蛋白放呈在所希望的部位，可再生關節軟骨 的論文發表。而且體外骨髓間充質幹細胞培養也證實了，骨髓間充質幹細胞確 實可以軟化為關節軟骨細胞。目前研究己經證實，骨髓間充質幹細胞具有較強 的自我更新能力和多向分化潛能，在特定的誘導條件下可分化為軟骨細胞，有
多篇文獻作了相關報導。例如，用轉化生長因子(31、地塞米松誘導的骨髓間
充質幹細胞與聚羥基乙酸/聚乳酸共培養1周後移植入豬的非負重區域膝關節
骨軟骨缺損處，6個月後膝關節缺損處已完全被工程化透明軟骨和松質骨所修 復，蛋白多糖含量與正常關節軟骨無差異。Ponticidlo、 Hegewald等都做過先 導性的相關理論研究。
總之，針對細胞的來源問題，完全可以通過人為對軟骨下骨打孔形成通道, 而介導骨髓間充質幹細胞的遷移至軟骨受損區。
因此，採用這處方法，目前真正需要解決的問題是，介導骨髓間充質幹細 胞遷移至軟骨受損區後，如何有效誘導骨髓間充質幹細胞分化為關節軟骨細胞 行使正常的生理功能，最終修復軟骨層。這就需要嚴格的擬合關節軟骨細胞的 正常環境條件。
這些嚴格的擬合的環境條件，對植入的人工關節軟骨而言，包括關節活 動的刺激，關節軟骨支架材料性能，附著在支架上各種適當的細胞因子及刺激 原及其可控釋放。由於是關節原位再生，關節活動對之施加了同等的力學刺激。 影響因素主要是後兩者。這兩者的嚴格擬合有著相當的難度。
首先是支架及其性能。支架性能有兩方面的要求，第一，則是有良好的力 學性能，彈性極佳，滑潤性好，在關節軟骨沒有再生之前，起到臨時替代關節 軟骨功能的作用；第二，是支架本身基質材料及其結構。因為人工軟骨支架影 響表現型軟骨細胞的表達。人工合成聚合物的組織工程支架機械性能比一般天 然生物材料更好，但天然材料常有利於軟骨修復。例如II型膠原雖有利於軟骨 細胞粘附、增殖、分化，可作為良好的材料包埋添加劑，但是缺乏一定的機械 強度，難於塑形，支架材料在體內降解過快，因而無法在關節軟骨中單獨使用。 因此，目前研究一定都在尋找合適的材料和方法。目前認為單一材料較難適應 要求，而通過共混調整不同材料之間的比例，可以使共混材料具有更適合力學 性能、降解性和生物學性質等。而在關節軟骨細胞完成修復後，支架可以自動
8降解，避免二次手術問題。
其實則是細胞因子和刺激原作用。不僅骨髓間充質幹細胞的遷移需要多種 細胞遷移及歸巢因子的作用。更重要的是，軟骨細胞正常生理功能的發揮還需 要多種適當的細胞因子的刺激，其它一些刺激原也有相應作用。因此人工軟骨 支架通常會添加的各種促進軟骨生長的成分，這些成分通常是可影響細胞的形 狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化生物活性物質，如某些促軟骨生長的細胞 因子。細胞因子輔助治療軟骨損傷法中細胞因子本身對軟骨生長的促進作用很 好，但要將因子固定於組織工程支架材料並能緩釋釋放，目前還沒有相關專利 和產品。而這對骨髓間充質幹細胞定向遷移至關節軟骨受損部位，並定向分化 為關節軟骨細胞後，行使正常的生理功能原位修復受損關節軟骨一系列關節軟 骨原位修復過程至關重要。
以上整個人工關節軟骨支架體系不僅在關節軟骨修復之前起臨時替代關 節軟骨的作用，而且為細胞的生存及活動提供適宜的場所和支撐，並提供了合 適的生理微環境。
因此，真正理想的人工軟骨應該是可以誘導軟骨細胞原位再生，形成真 正的透明軟骨並與周圍正常軟骨組織結構一致，再生性修復關節軟骨，再生修 復完成後可人工軟骨可自動降解。
但目前並無具體的製備方法將納米仿生人工軟骨產品製備出來並應用於 臨床，這是目前此技術領域的技術難題，本發明正是針對此未攻克的技術難題 進行改進和確立具體實現方案。
近年來， 一些納米生物仿生技術，如靜電紡絲、細胞列印技術等的興起為
構建新型人工軟骨產品提供了新思路。相比以往的支架製備技術，由靜電紡絲 納米仿生技術製備的軟骨生物支架具有以下一些優點①由靜電紡絲技術製備 的納米纖維直徑由幾十納米至幾微米，能在形態上很好模擬細胞外基質 (ECM)，縱橫交錯的纖維形成很多孔隙，使材料具有高比表面積，有利於細胞 粘附、增殖和分化；②數量巨大的納米纖維的排列，使材料具有很好的力學強 度及柔韌性；③靜電紡生物支架能夠軟骨細胞及生長因子有效融合； 靜電紡 絲技術適用於超過100種天然或合成生物材料，還可以通過調整工藝參數，獲 得不同材料、不同結構的組合，使生物支架具有靈活的可設計性，可滿足人體 軟骨中對多細胞和多材料組成的要求。生物列印技術是近年來出現的新技術。生物列印能按預定計劃精確定位， 這和列印技術的特點是一致的。生物列印與一般列印的不同僅在於其墨水和接 受列印的紙張不一樣。生物列印的紙片是在體內可降解的生物紙片；生物列印 的"生物墨水"是特製的細胞溶液或有生物活性的細胞因子溶液。生物列印技術 是將這種特製溶液噴射到可生物降解的生物紙片上。列印後再將紙片按一定順 序的堆疊。由於使用了列印技術，可以將細胞或/和細胞因子("生物墨水")精 確的結合到預定部位；而按特定的堆疊方式的生物紙片則會形成三維結構。理 論上如果所用的生物墨水是細胞溶液，則形成三維的組織結構和器官，最後生 物紙片降解，細胞保留下來，形成立體結構，例如，活的三維組織、血管和器 官。但是生物列印技術仍處於基礎研究的階段，還沒有出現直接利用細胞通過 生物列印技術製備的人工器官，也沒有見到相關報導。但目前並無具體的製備方法將納米仿生人工軟骨產品製備出來並應用於 臨床，這是目前此技術領域的技術難題，本發明正是針對此未攻克的技術難題 進行改進和確立具體實現方案。 發明內容本發明的目的是克服己有技術的缺點，提供一種基於自體細胞的人工關節 軟骨，所述人工關節軟骨是一種能對關節軟骨損傷進行原位再生性修復的生物 型關節軟骨植入材料，它不僅涉及人工軟骨材料，並涉及多種細胞因子、可原 位誘導骨髓間充質幹細胞定向遷移到人工關節軟骨的納米仿生支架內，並誘導 骨髓間充質幹細胞分化為軟骨細胞，促使誘導的軟骨細胞發揮正常生理功能、 最後再重生關節軟骨，在關節軟骨原位再生後，材料可自動安全降解。這種新 型人工軟骨克服了目前關節軟骨損傷的修復中無合適材料可用的被動局面。本發明的另一個目的是提供上述人工關節軟骨的製備方法，所述方法簡單 易行、可適應大規模生產、成本低，同時拓寬了生物列印技術應用範圍的。本發明提供了一種人工關節軟骨，在對關節面進行打孔至軟骨下硬骨骨 髓、將含有細胞因子的人工關節軟骨放呈在所希望的部位，並誘導關節軟骨再 生。它涉及多種細胞因子、可原位誘導骨髓間充質幹細胞及滑液細胞定向遷移 到人工關節軟骨的納米仿生支架內，並誘導骨髓間充質幹細胞及滑液細胞分化 為軟骨細胞，促使誘導的軟骨細胞發揮正常生理功能、最後再重生關節軟骨； 並在關節軟骨再生後自動安全降解。本發明通過以下技術方案實現上述目的本發明提供了一種基於自體細胞的人工關節軟骨，包括納米仿生支架和附 著於其上的水溶膠，所述水溶膠內包覆有一種或幾種細胞因子。所述納米仿生支架是採用支架材料通過靜電紡絲技術製備得到，所述支架 材料包括聚乳酸、聚已內酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸 乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸 酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯醯胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、 聚對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、澱粉、 纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態的肽聚合物、 海藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸。將上述材料溶於一定的 溶劑，形成電紡液，就可以通過靜電紡絲技術得到納米仿生支架。這些溶劑可 以為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、四氫呋喃、二 甲基亞碸、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲垸、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、 二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們任意比例的混合物。上述的高分子材 料和溶劑用於靜電紡絲的相關技術，例如材料與溶劑的重量比例等參照現有技 術。用上面提到的一種或兩種以上混合材料通過靜電紡絲技術，可以按照具體 需要做出合適孔徑和直徑的納米材料。此項工藝在本發明製備方法一節有詳細 敘述，操作簡單，所得到的纖維是納米級的，比傳統的方法得到的無紡布直徑 小几個數量級，其直徑分布是幾個納米到幾個微米，並可通過工藝參數調整得 到不同直徑，做到和人體真皮網狀結締組織高度相似，形成的網狀結構的孔徑 大小和其分布也可調整，孔徑可以調整到數十納米到數個微米之間，以達到在 允許營養物質進入的同時防止細胞進入；也可以調整為到數十到數百微米，以利於不同類型的細胞遷入，如50+20微米的孔徑有利於血管內皮細胞長入，而 神經纖維則需要30 100微米的孔徑。靜電紡纖維得到的孔隙大小分布很大程 度上依賴於纖維直徑，已知纖維直徑減小時，孔徑也在同時減小。據已發表的 文獻，纖維直徑在4-10pM時，孔徑從20-45pM。採用不同材料不同參數的靜 電紡絲可生成的不同直徑的纖維。本發明採用上述材料的電紡絲根據軟骨修復 過程自動安全降解，避免了結締組織的異常增生，軟骨纖維化現象。由於人工 軟骨的特殊要求，靜電紡支架同時有很好的耐磨性和韌性，以達到對天然軟骨ii的最佳模擬。所述的納米仿生支架在生物列印中同時起到生物"紙片"的作用。所述水溶膠可以是以下聚合物製成的水溶膠多糖類聚合物，如澱粉、纖 維素、海藻酸、透明質酸或殼聚糖；多肽類聚合物，如膠原、聚L-賴氨酸或聚 L-谷胺酸；合成的親水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯醯 胺或聚N-聚代丙烯醯胺。上述聚合物製備的水溶膠通過改變溫度、酸鹼度、 經紫外線照射或者加入交聯劑(固化液)等方法，可由液態轉變為固態。多種細胞因子於軟骨細胞的分化都有很重要的影響。軟骨細胞的分化和增 殖受到多種因子的調節。本發明所涉及的細胞因子有以下幾種調節軟骨形成 的生長因子，促使骨髓間充質幹細胞及滑液細胞轉化為軟骨細胞的細胞因子， 骨髓間充質幹細胞及其遷移和轉化為軟骨細胞或其他刺激原。促使骨髓間充質幹細胞及滑液細胞轉化為軟骨細胞的細胞因子包括以下因子轉化生長因子f31 (TGF-pi)、骨形態發生蛋白2 (BMP-2)、胰島素樣生 長因子l (IGF-1)等細胞因子。轉化生長因子(31是促骨髓間充質幹細胞向軟 骨分化首選的細胞因子，其具有多重生物學效應①促進軟骨前體細胞趨化到 骨軟骨損傷部位，並能誘導未分化的骨髓間充質幹細胞分化為軟骨細胞。②促 進軟骨基質合成。③抑制軟骨分解代謝。④關節軟骨缺損修復遠期療效不佳的 一個重要原因是在關節軟骨損傷的病理過程中多種炎症遞質(如白細胞介素、 腫瘤壞死因子、幹擾素、基質金屬蛋白酶等)參與軟骨基質的降解，轉化生長 因子pl能抑制這些炎症遞質的活性，並能促進基質金屬蛋白酶抑制劑的表達。 骨形態發生蛋白2是轉化生長因子(3超家族的成員，也能誘導骨髓間充質幹細 胞增殖並分化為軟骨細胞。骨形態發生蛋白2和轉化生長因子pi還具有協同 作用，骨髓間充質幹細胞在兩者共同作用下II型膠原合成顯著提高，同時使I 型膠原表達降至最低。胰島素樣生長因子1是一種強有力的合成代謝刺激因子， 可以促進軟骨細胞增殖和成熟，合成軟骨基質蛋白多糖。研究表明胰島素樣生 長因子1可促進骨髓間充質幹細胞向軟骨細胞分化，還可抑制轉化生長因子卩l 引起的細胞外焦磷酸鹽的積聚，防止焦磷酸鈣結晶的形成和進一步成骨，是轉 化生長因子(31重要的輔助因子。對幹細胞的歸巢或趨化或細胞分化起作用的因子，如細胞定向遷移因子(SDF-1)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素結合因子(ECM)、轉化生長因子-a (TGF-a)、血小板衍生的生長 因子(PDGF)或細胞定向遷移因子、胰島素生長因子、骨形態發生蛋白、骨形 態發生蛋白-2、血管內皮生長因子、結締組織生長因子、鹼性成纖維細胞生長 因子、骨橋蛋白、生長激素類(如促生長素)等細胞吸引及粘附因子調節軟骨形成的生長因子軟骨形成受到的生長因子調節作用，許多細胞因子通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調節軟骨細胞。目前認為促進幹細胞分化為軟骨細胞，並促進軟骨細胞增殖和基質合成代謝的細胞因子有IGFs， TGF-Ps (如BMPs)， PDGF， FGF， EGF, IGF-I ，而對軟骨細胞有抑制作用 的有IL-1、 IL-2、 IL-7、 TNF-a、 IFN-y等。TGF-|3可以誘導間充質細胞車、化為 軟骨細胞。現己實驗證明TGF-(3s具有促進軟骨細胞增殖、調節其分化和胞外 基質合成的能力。骨形態發生蛋白(BMP)家族屬於TGF-(3s超家庭，可加速功 能性關節軟骨的再生，被證實為具有骨發生、軟骨發生和其它生長和分化類型 的活性。這些BMP包括BMP畫2 、 BMP-3 、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP - 7 ( OP陽1 )、 BMP - 8、 BMP - 9、 BMP - 12、 BMP-13、 BMP-15、 BMP-16、 BMP-17、 BMP-18、 GDF-1、 GDF-3、 GDF-5、 GDF-6、 GDF畫7、 GDF-8、 GDF-9、 GDF-IO、 GDF-ll、 GDF-12、 GDF-14、 Vgr-2和任何生長分化因子(GDF )。 例如，BMP-7(OP-l)是BMP家族中的一員，可增加其鹼性磷酸酶活性和提高 mRNA和II型膠原的合成能力，rhBMP(OP-l)能有效促進胚胎和成人關節軟骨 細胞合成蛋白多糖和II型膠原。IGF- I能強烈剌激軟骨細胞合成II型膠原和蛋 白多糖，還能刺激軟骨細胞集落形成和細胞增殖，而IGF-II能刺激軟骨細胞 DNA和RNA的合成且比IGF-I更有效的剌激胚胎細胞的生長。而IGF結合 蛋白(IGFlBPs)它通過特異性結合IGFs而起作用。成纖維細胞生長因子(FGFs) 體外實驗發現它能促進軟骨細胞的增殖、成熟和胞外基質的合成，而bFGF是 一種強大的軟骨細胞有絲分裂原，它能刺激生長板中軟骨細胞蛋白多糖的合 成。促進軟骨細胞增殖和基質合成代謝的其它刺激原地塞米松常被認為是一 種非特異性的分化刺激原，能提高軟骨細胞外基質基因的表達，使II型膠原和蛋白多糖合成增多。此外，n型膠原是透明軟骨的主要成分之一，對於軟骨細 胞功能的維持起著重要作用。單獨使用n型膠原也能誘導並維持間充質幹細胞 向軟骨細胞分化，還能與轉化生長因子pi相互作用增強骨髓間充質幹細胞的分化能力。從以上論述中可以得知，多種因子儘管都對關節軟骨的再生有不可或缺的 作用，但其作用方式，其局部濃度及其梯度濃度分配、不同因子的組合和在損 傷部位深淺層次上濃度分配及其不同的比例，都對關節軟骨的修復效果有重要 關係。比如說，促進軟骨細胞遷移的因子在人工軟骨支架材料上的分布應該是 內層濃度高於外層濃度，以利其遷移。反之，分化因子則應該有計劃的成簇分 布為佳。因此，為滿足此點要求，必須將多種細胞因子精確的與納米仿生支架 結合。但目前的混紡技術等都不能做到此點，但生物列印技術卻可以將不同的 細胞因子準確的結合到計劃部位。本發明還提供了上述納米仿生人工關節軟骨的製備方法，包括以下步驟 (1)製備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯劑溶液； (2 )用所述交聯劑溶液接收靜電紡絲製得納米仿生支架； (3)用噴墨印表機將含有細胞因子或軟骨細胞的水溶膠溶液列印到所述 納米仿生支架上，水溶膠固化後即得。含有細胞因子的水溶膠溶液的製備也可以在步驟(3)實施之前再進行。在本發明中，步驟(2)和(3)可重複一次或者更多次，以得到不同厚度的關節軟骨。所述電紡溶液是將所述支架材料溶於一定的溶劑，形成電紡液；支架材料 包括聚乳酸、聚己內酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸乙二 酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯醯胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙垸、聚 對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、澱粉、纖 維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態的肽聚合物、海 藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸的一種或兩種以上混合溶液；可用的溶劑為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、 四氫呋喃、二甲基亞碸、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、 乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一種或者它們任意比例 的混合物。上述的高分子材料和溶劑用於靜電紡絲的相關技術，例如材料與溶 劑的重量比例等參照現有技術。所述電紡溶液優選數均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內酯的二氯甲14垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內酯所佔的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質量百分比濃度為4 11 % 。步驟(1)所述含有細胞因子的水溶膠溶液是含有細胞因子的水溶膠緩衝 液；所述細胞因子所佔質量百分比總數不高於10%。步驟(1)所述水溶膠緩衝溶液為藻酸鹽或藻酸鹽與其它物質的混合溶液， 交聯劑溶液為氯化鈣溶液；或所述水溶膠緩衝溶液為纖維蛋白原溶液，交聯劑 溶液為凝血酶溶液；或所述水溶膠緩衝溶液為透明質酸碳酸氫鈉溶液，交聯劑 溶液為醯肼或碳化二亞胺；或所述水溶膠緩衝溶液為膠原-聚陰離子溶液，交 聯劑為碳化二亞胺。步驟(2)所述靜電紡絲的優選參數為注射泵推進速度為0.1 3.0ml/h， 紡絲針頭為IO、 12、 14、 16、 18或20號針頭，施加電壓為10 30KV， 接收 噴絲的細胞培養皿中裝有交聯劑溶液，生物列印的紙片為電紡製得的納米仿生 支架。所述噴墨印表機優選改裝的惠普550C噴墨印表機，改裝方法參考美國專 利US 7051654。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果本發明是對現有技術的進一步發展，比已有技術中人工合成聚合物的組織 工程支架機械性能更好，細胞因子輔助治療軟骨損傷法中細胞因子本身對軟骨 生長的促進作用很好，但要將因子固定於組織工程支架材料並能緩釋釋放，這 一構想目前還沒有得到實際實施，本發明實現了該構想。本發明採用了原位自體細胞工程技術，採用幹細胞趨化因子吸引自體幹細 胞定向遷移進入創面並按設計要求進行分化,採用細胞趨化因子和細胞分化因 子，前者吸引關節滑液和/或關節軟骨下骨中合適的自體細胞定向遷移進入關 節軟骨損傷部位，後者促使吸引遷移到損傷部位的自體細胞按設計要求分化為 軟骨細胞並進一步行使正常軟骨細胞功能、修復關節軟骨，既避免了使用活細 胞帶來的不便，又能達到使用與其同等或者更佳的修復效果，有廣闊和應用前學本發明利用生物列印技術，將生長因子等生物物質按設計要求與納米支架 精確結合，形成誘導軟骨下骨幹細胞和關節滑液細胞遷移、聚集、分化的微環 境，吸引幹細胞進入損傷部位。本發明採用的三維支架具有理想的降解速度，在關節軟骨層再生後降解， 能夠滿足臨床實際應用的需要。可完全降解，而且三維支架有一定的耐磨性， 潤滑性，在關節軟骨層再生之前可以代替軟骨的功能，可植入固定，與關節面 糸5口 口 o本發明的人工關節軟骨生物安全性、相容性好，沒有免疫排斥作用或排斥作用極低；原料無毒性及致瘤性，產品有良好的耐磨性，潤滑性和機械強度， 有一定的可塑性，有臨時性代替軟骨功能的作用，能與關節面緊密結合。本發明結合了靜電紡絲和生物列印技術，分布了適當的細胞因子和刺激 原，並可控釋放，提供了合適的微環境，以利於間充質幹細胞的歸巢、粘附、 分化為軟骨細胞並生長增殖和行使正常生理功能，誘導軟骨組織再生，形成新 的正常透明關節軟骨層。本發明原料來源豐富，易於獲得；材料是目前巳經證實對人體無毒無害的 安全生物材料；本發明製備的人工軟骨本身不含活細胞成分，不使用外源細胞 和蛋白，免除了因此而帶來免疫排斥、病毒傳播、疾病傳染的諸多風險；本發明製備的人工軟骨貯存運輸簡單；製備方法工藝步驟簡化，生產時間 短，能有效避免加工過程中產品受到汙染，產品質量易於控制，產品標準容易 實現，產品可實現低成本、高效率的產業化生產。


圖1為本發明人工關節軟骨的結構示意圖，圖中1為靜電紡絲形成的生物 紙片，2為細胞分化因子、3為細胞遷移因子。
具體實施方式
以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。 實施例l(1)製備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯劑溶液； -電紡溶液優選數均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內酯的二氯甲垸溶 液；所述聚-DL-乳酸和聚己內酯所佔的重量百分比分別為50 %和50%，溶液 總的質量百分比濃度為7%。交聯劑溶液選用O.IM氯化鈣溶液。含有細胞因子的水溶膠溶液採用藻酸鹽溶液，所述細胞因子藻酸鹽溶液中 細胞因子TGF-(31、 IGF-1、 BMP-2的質量百分比濃度各為100ppm。將配置好的O.IM氯化鈣溶液放入直徑150mm的細胞培養皿中，置於靜電 紡絲裝置及印表機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨印表機按照現有專 利報導進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡 絲裝置箱內電紡針頭正下方，用作細胞因子定位列印。將配好的細胞因子藻酸 鹽溶液裝入噴墨列印墨盒中。本實施例採用的墨盒型號為HP51626A。(2) 用所述交聯劑溶液接收靜電紡絲製得納米仿生支架； 將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.5ml/h， 選用10號針頭，施加電壓為20KV，用裝有氯化鈣溶液的細胞培養皿接收噴絲。 噴絲30分鐘後，停止靜電紡絲；(3) 用噴墨印表機將含有細胞因子的藻酸鹽溶液列印到納米仿生支架上， 水溶膠固化後即得。開啟噴墨印表機，按照設定的位置，將細胞因子藻酸鹽溶液列印在培養皿 的電紡層上，藻酸鹽溶液接觸電紡層上的氯化鈣溶液後迅速固化，形成藻酸鹽 水溶膠，將細胞因子包裹並固定。重複列印15遍後，關閉印表機。重新靜電紡絲30分鐘，然後再關閉靜電 紡絲，列印；靜電紡絲和列印循環重複。最後形成厚度約1.5mm的人工關節 軟骨，製得的人工關節軟骨結構如圖l所示，圖中l為靜電紡絲形成的生物紙 片，2為細胞分化因子、3為細胞遷移因子。將製得的納米纖維水溶膠薄膜從培養皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經凍 幹後真空包裝，經25kGy鈷-60滅菌後負20攝氏度低溫保存。 實施例2實施步驟同實施例1。所述電紡溶液優選數均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內酯的二氯甲 烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內酯所佔的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質量百分比濃度為5 %。交聯劑溶液選用100IU/ml凝血酶溶液； 含有細胞因子水溶膠溶液採用細胞因子纖維蛋白原溶液，BMP-2濃度為 10mg/ml。具體操作是將配置好的凝血酶溶液放入直徑90mm的細胞培養皿中，置於 靜電紡絲裝置及印表機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨印表機按照現有專利報導進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在 電紡絲裝置箱內電紡針頭正下方，用作細胞因子定位列印。將配好的細胞因子 纖維蛋白原溶液裝入噴墨列印墨盒中，本實施例採用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為1.5ml/h，選用 16號針頭，施加電壓為25KV，用裝有凝血酶溶液的細胞培養皿接收噴絲。噴 絲25分鐘後，停止靜電紡絲，開啟噴墨印表機，按照設定的位置，將列印在 培養皿的電紡層上，纖維蛋白原溶液接觸電紡層上的凝血酶溶液後迅速固化， 形成水溶膠，將細胞因子包裹並固定。重複列印15遍後，關閉印表機，重新 靜電紡絲30分鐘，然後再關閉靜電紡絲，列印15遍.反覆若干次，形成厚度 約3.0mm的納米仿生人工關節。保存方法同實施例1。 實施例3所述電紡溶液優選數均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內酯所佔的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質量百分比濃度為10%。交聯劑溶液選用100mg/ml水溶性碳化二亞胺溶液；含有細胞因子的水溶膠溶液採用細胞因子的膠原與聚陰離子溶液，其中膠 原濃度為1%，聚陰離子採用聚穀氨酸，濃度50mg/ml，所述細胞因子包括細 胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子、轉化生長因子(3、 BMP-2、地塞米松， 總的質量百分比濃度為0.5%。具體操作是將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細胞培養皿中， 至於靜電紡絲裝置及印表機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨印表機按 照現有專利報導進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固 定在電紡絲裝置箱內電紡針頭正下方，用作細胞因子定位列印。將配好的細胞 因子溶液裝入噴墨列印墨盒中，本實施例採用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.2ml/h，選用 12號針頭，施加電壓為20KV，用裝有碳化二亞胺溶液的細胞培養皿接收噴 絲。噴絲30分鐘後，停止靜電紡絲，開啟噴墨印表機，按照設定的位置，將 細胞因子的透明質酸碳酸氫鈉溶液(細胞因子質量百分比濃度0.1%)列印在 培養皿的電紡層上，透明質酸溶液接觸電紡層上的碳化二亞胺後迅速固化，形18成透明質酸水溶膠，將細胞因子包裹並固定。重複列印15遍後，關閉印表機，重新靜電紡絲35分鐘，然後再關閉靜電紡絲，列印15遍，重新靜電紡絲35分鐘，然後再關閉靜電紡絲。反覆若干次， 形成厚度約4.0mm的納米人工關節軟骨。保存方法同實施例1。 實施例4所述電紡溶液優選數均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內酯所佔的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質量百分比濃度為6%。交聯劑溶液選用100mg/ml水溶性碳化二亞胺溶液；含有細胞因子的水溶膠溶液採用細胞因子的膠原與聚陰離子溶液，其中膠 原濃度為1%，聚陰離子採用聚穀氨酸，濃度50mg/ml，所述細胞因子包括細 胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子、轉化生長因子-a、 BMP，總的質量百 分比濃度為0.5%。具體操作是將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細胞培養皿中， 至於靜電紡絲裝置及印表機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨印表機按 照現有專利報導進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固 定在電紡絲裝置箱內電紡針頭正下方，用作細胞因子定位列印。將配好的細胞 因子溶液裝入噴墨列印墨盒中，本實施例採用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.4ml/h，選用 12號針頭，施加電壓為25KV，用裝有碳化二亞胺溶液的細胞培養皿接收噴 絲。噴絲35分鐘後，停止靜電紡絲，開啟噴墨印表機，按照設定的位置，將 細胞因子的透明質酸碳酸氫鈉溶液(細胞因子質量百分比濃度0.1%)列印在 培養皿的電紡層上，透明質酸溶液接觸電紡層上的碳化二亞胺後迅速固化，形 成透明質酸水溶膠，將細胞因子包裹並固定。重複列印15遍後，關閉印表機，重新靜電紡絲35分鐘，然後再關閉靜電 紡絲，列印15遍，重新靜電紡絲35分鐘，然後再關閉靜電紡絲。反覆若干次， 形成厚度約5.0mm的納米人工關節軟骨。保存方法同實施例1。 實施例5用實施例1製得的人工關節軟骨進行動物實驗選擇紐西蘭兔並進行肌肉注射麻醉。確定兔子完全麻醉以後，剃光兩條腿 的膝關節，用橡皮膏固定，並保持仰臥姿勢。確認膝關節沒有病變現象以後， 用銳利的手鑽在大股骨關節面的位置處打一個中心螺旋狀的凹孔，然後用鑽子在其中心位置打一個直徑4mm的洞，深度達到3mm，人為建立了一個全厚的 軟骨缺陷。按照上述方法建立軟骨損傷以後，繼續觀察損傷區域4個月。確 定關節軟骨損傷區域沒有自己癒合。再次進行肌肉注射麻醉，打開上次手術部位。用鑽子在上次人為建立的關 節軟骨損傷區之下的硬骨上打洞，移植本發明製備的人工關節軟骨。將本發明 製備的人工關節軟骨的一端植入到硬骨骨洞上。進行軟骨修復12周後進行核磁共振檢測。從核磁共振圖上可見，修復處 表面平滑，表明修復處未有塌陷。未見明顯免疫炎症反應。進行軟骨修復8個月後，.處死實驗動物，取手術部位組織觀察。肉眼觀察 可見，在移植物處形成新生的透明軟骨，新生軟骨與關節表面融合良好。組織 切片檢測，可見人工關節軟骨己被新生的透明軟骨所替代，修復處未出現塌陷， 與正常軟骨的交界處緊密接合，界線模糊。未見巨噬細胞等炎症細胞浸潤，未 見明顯免疫炎症反應。上述結果表明，在關節軟骨缺損中，本發明製備的人工關節軟骨可促進軟 骨的癒合。
權利要求
1.一種基於自體細胞的人工關節軟骨，包括納米仿生支架和附著於其上的水溶膠，所述水溶膠內包覆有一種或幾種細胞因子。
2. 如權利要求1所述的人工關節軟骨，其特徵在於所述細胞因子包括細胞的歸巢或趨化起作用的細胞因子、促使間充質幹細胞轉化為軟骨細胞的細胞 因子或調節軟骨形成的生長因子中的任意一種或幾種。
3. 如權利要求1所述的人工關節軟骨，其特徵在於所述納米仿生支架是 採用支架材料溶於溶劑形成電紡液通過靜電紡絲技術製備得到；所述支架材料 包括聚乳酸、聚己內酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸乙 二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯醯胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚 對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、澱粉、纖 維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態的肽聚合物、海 藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸。
4. 如權利要求3所述人工關節軟骨，其特徵在於所述溶劑為甲酸、乙酸、 乙醇、丙酮、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、四氫呋喃、二甲基亞碸、六氟異 丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙 垸、三氟乙酸、水或它們任意比例的混合物。
5. 如權利要求1所述的人工關節軟骨，其特徵在於所述水溶膠是以多糖 類聚合物、多肽類聚合物或多肽類聚合物製成的水溶膠；所述多糖類聚合物為 澱粉、纖維素、海藻酸、透明質酸或殼聚糖；所述多肽類聚合物為膠原、聚 L-賴氨酸或聚L-谷胺酸；所述合成的親水高分子聚合物為聚丙烯酸、聚甲基丙 烯酸、聚丙烯醯胺或聚N-聚代丙烯醯胺。
6. —種權利要求1所述的人工關節軟骨的製備方法，其特徵在於包括以 下步驟(1) 製備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯劑溶液；(2) 用所述交聯劑溶液接收靜電紡絲製得納米仿生支架；(3) 用噴墨印表機將含有細胞因子的水溶膠溶液列印到所述納米仿生支 架上，水溶膠固化後即得。
7. 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述含有細胞因子的水溶膠溶液的製備在步驟(2)和步驟(3)之間進行。
8. 如權利要求6或7所述的製備方法，其特徵在於所述步驟(2)和(3) 重複若干次。
9. 如權利要求8所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述靜電紡絲的 參數為注射泵推進速度為0.1~3.0ml/h，紡絲針頭為10、 12、 14、 16、 18或 20號針頭，施加電壓為10-30KV,接收噴絲的細胞培養皿中裝有交聯劑溶液， 生物列印的紙片為電紡製得的納米仿生支架。
全文摘要
本發明提供了一種基於自體細胞的人工關節軟骨及其製備方法。所述人工關節軟骨包括納米仿生支架和附著於其上的水溶膠，所述水溶膠內包覆有一種或幾種細胞因子。本發明還提供了所述人工關節軟骨的製備方法，包括以下步驟製備電紡溶液、含有細胞因子水溶膠溶液和交聯劑溶液；用所述交聯劑溶液接收靜電紡絲製得納米仿生支架；用噴墨印表機將含有細胞因子的水溶膠溶液列印到所述納米仿生支架上，水溶膠固化後即得。本發明採用的三維支架具有理想的降解速度，在關節軟骨層再生後降解，能夠滿足臨床實際應用的需要，可完全降解，而且三維支架有良好的耐磨性，潤滑性，在關節軟骨層再生之前可以代替軟骨的功能。
文檔編號A61L27/54GK101574543SQ20091004011
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月9日 優先權日2009年6月9日
發明者弢 徐, 袁玉宇 申請人:廣州邁普再生醫學科技有限公司