犢牛凝乳酶的製備方法
2023-05-20 20:11:31
專利名稱：犢牛凝乳酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及凝乳酶的製備，尤其涉及犢牛凝乳酶的製備方法。
凝乳酶存在於動物、植物和微生物體內，其作用是使牛乳凝固。國外有關凝乳酶的報導甚多，而且有液體、膠狀、粉劑和片劑等多種形式的凝乳酶商品。但我國目前所用的凝乳酶製劑，主要源於進口，應用於乳品中的凝乳酶的生產還是一項空白。
凝乳酶按其來源可分為動物凝乳酶、植物凝乳醇和微生物凝乳酶。動物凝乳酶是乾酪生產中應用最早的一類酶，不論在風味、質地和產量方面都優於其它來源的凝乳酶。微生物和植物來源的凝乳酶蛋白水解性較差，能把K-酪蛋白水解成較小的多肽片段，而且在成熟過程中易產生苦味，限制了它們在生產中的應用。
動物來源的凝乳酶主要存在於犢牛和羔羊的胃蛋白裡。1960年，美國為提取凝乳酶宰殺了800萬頭犢牛。我國幅員遼闊，並不匱乏犢牛和羔羊資源。用於製作血清、製藥或肉用屠宰的犢牛胃，作為副產品進行廢物利用，目前可收集應用的犢牛有1.8-2.5萬頭，而且仍在增加。
傳統的犢牛凝乳酶的提取是將屠宰後的犢牛皺胃洗淨，置於陰涼通風處，風乾乾燥，然後用粉碎機粉成粉末，粉末即為提取出來的粗酶。傳統犢牛凝乳酶的提取方法不但提取時間長，而且在風乾過程中酶很容易失活，活力回收率不高，酶含量低。
本發明的目的就在於尋找出一種簡便易行、省時經濟、酶含量及活力回收高的犢牛凝乳酶的製備方法。
本發明將新鮮或冷凍的犢牛皺胃清洗後用奶粉和CaCl2抹於表面，經低溫條件下誘導後，剔除膠原、脂肪，切碎，稱重，加入預冷4℃的提取液，提取液內含有5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液，提取液的容積與物料溼重比為3-5∶1；然後勻漿，攪拌浸提30-240min，離心後取上清液；殘渣再加入預冷4℃的含有5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液提取液，提取液的容積與物料溼重比為1-3∶1；然後勻漿，攪拌浸提180-240min，離心後取上清液；合併兩次所得的上清液，於上清液中加入容積數為上清液5％的1mol/L的HCl，沉澱雜蛋白，離心，取上清液，於上清液中加入重量數為上清液5％的NaCl，溶解出酶蛋白；用1mol/L的NaOH調整pH值為微酸性後，即為液體粗酶。
將液體粗酶用DEAE離子交換柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為1.25ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液在280nm波長下出現6個蛋白峰，收集的第12-16管為峰I、21-25管為峰II、30-34管為峰III。實驗證明其中峰I、峰II、峰III與酶活性峰重疊，其餘的是沒有酶活性的蛋白液，而峰I的酶活性最高。取峰I酶液，經透析、聚乙二醇濃縮到原體積的1/3後，再用Sephadex層析柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為5ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液在280nm波長下出現3個蛋白峰，其中峰III與酶活性峰重疊，所收集的第19-26管的蛋白液便是純化的凝乳酶，其餘的是不具有酶活性的蛋白液。純化的凝乳酶，其比活力為171.43U/mg蛋白，蛋白濃度為0.007mg/ml。其主要的酶學性質如下凝乳酶的反應最適的溫度為55℃，當溫度低於25℃時，凝乳很慢，從30℃開始，隨著溫度的升高，活力也隨之增大，但高於55℃時，活力迅速下降；凝乳酶在40℃處理90min，酶活力很穩定，但隨著溫度的升高，酶的活力發生變化，在55℃處理90min，有36.7％的活力喪失；凝乳酶作用的最適pH值為5.8，在pH值5.8以下和以上，酶的活力都有所下降，在pH3.0-6.0之間是穩定的；原料乳乾物質含量小於8％時，30min內不凝固，從9％開始，隨乾物質的增加，其活力也增高；Ca2+濃度在0.025-0.125％範圍內，隨加入量的增加，凝乳酶的活力也增加，Ca2+濃度在0.125％以上，酶活力增加緩慢。
本發明優點一.提取方法簡便易行、省時經濟、酶含量及活力回收高。二.原料來源容易、價廉，適應產品的綜合開發利用。三.工藝生產設備投資少，工藝簡單易行，為我國凝乳酶的開發利用和新型乳製品市場開拓提供新的途徑。
實例將2個新鮮或冷凍的犢牛皺胃清洗後用20g奶粉和2g CaCl2抹於表面，在4℃的低溫條件下誘導2-3天，切碎、去雜，稱取100g，加入預冷4℃的提取液400ml，提取液為含5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液，勻漿，攪拌提取45min，3000r/min離心10min，取上清液；殘渣再加入預冷4℃的提取液200ml，提取液為含5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液，勻漿，攪拌提取240min，3000r/min離心10min，取上清液；合併兩次所得的上清液，加入30ml 1mol/L HCl，攪拌，沉澱雜蛋白，3000r/min離心10min，取上清液；然後再加入60g的NaCl，攪拌溶解，用1mol/L NaOH調整pH值為6.0，得液體粗酶約600ml。
取液體粗酶8ml用DEAE 23離子交換柱層析，0.05mol/L、pH5.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為1.25ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液在280nm波長下出現6個蛋白峰，收集的第12-16管為峰I、21-25管為峰II、30-34管為峰III。取峰I酶液25ml，經透析、聚乙二醇6000濃縮到8ml後，再用Sephadex G-75層析柱層析，0.05mol/L、pH5.6檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為5ml/min，收集器收洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，所收集的第19-26管酶液40ml，為純化的凝乳酶，其比活力為171.43U/mg蛋白，蛋白濃度為0.007mg/ml。
權利要求
1.犢牛凝乳酶的製備方法，其特徵在於將新鮮或冷凍的犢牛皺胃清洗後用奶粉和CaCl2抹於表面，經低溫條件下誘導後剔除膠原和脂肪，切碎，加入預冷4℃的提取液，提取液為含5％的NaCl和10％無水乙醇的水溶液，提取液的容積與物料溼重比為3-5∶1，勻漿，攪拌浸提30-240min，離心，取上清液，重複1-3次，合併幾次所得的上清液，於上清液中加入容積數為上清液5％的1mol/L的HCl沉澱雜蛋白，離心，取上清液，於上清液中加入重量數為上清液5％的NaCl溶解出酶蛋白，再用1mol/L NaOH調整pH值為微酸性後，即為液體粗酶，將液體粗酶用DEAE離子交換柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液的流速為1.25ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，取收集的第12-16管酶液，經透析、聚乙二醇濃縮到原體積的1/3後，再用Sephadex層析柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩衝液進行pH線性梯度洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液的流速為5ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，收集第19-26管即為純化的凝乳酶。
全文摘要
本發明涉及凝乳酶的製備技術領域。以犢牛皺胃為材料,經低溫誘導,用NaCl和乙醇的水溶液提取凝乳酶。粗酶液經離子交換柱、分子篩凝膠純化,得部分純化酶。該酶反應最適溫度為50℃,最適pH值為5.8,在pH3.0－6.0範圍內酶活力穩定,Ca
文檔編號C07K1/00GK1379090SQ02115260
公開日2002年11月13日 申請日期2002年5月23日 優先權日2002年5月23日
發明者陳燕娜 申請人:陳燕娜