潮汐式動物細胞培養生物反應器的製作方法

2023-05-20 20:04:01 2

專利名稱：潮汐式動物細胞培養生物反應器的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於生物細胞培養反應器領域，適用於食品工業加工生產、農林業生物農藥、生物製品、生物製藥、生物疫苗、高密度大規模細胞生產培養及生物醫藥克隆細胞的傳代培養，具體為一種潮汐式動物細胞培養生物反應器。
背景技術：
現有技術中，農林業生物農藥、生物製品、生物製藥、生物疫苗藥廠的細胞培養多數為用試瓶置於培養箱內培養，局限於實驗型、生產型多為轉瓶機轉瓶培養。轉瓶機佔用場地寬、投入成本大、生產運行費用高、細胞產量低、還局限於細胞種類的培養。

實用新型內容針對現有技術的不足之處如轉瓶機佔用場地寬、投入成本大、生產運行費用高、細胞產量低、局限於細胞種類培養的不足等。本實用新型型旨在提供一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，以克服上述不足，使得細胞培養設備佔地面積小，成本低、細胞產量高。為實現上述目的，本實用新型的技術方案是一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，包括培養基補充或回收瓶和加熱恆溫水箱，還包括培養基盛液罐和三氣夾水套恆溫培養箱；其中，培養基盛液罐的上端固定有盛液罐氣體過濾器、PH值檢測電極、糖分檢測電極、溶氧檢測電極、吸液循環管a、進液循環管a和補充液進液管；三氣夾水套恆溫培養箱內設有填充有細胞培養載體的細胞培養反應罐，三氣夾水套恆溫培養箱的一側設有第I蠕動泵、第II蠕動泵和第III蠕動泵，細胞培養反應罐設有攪拌裝置、氣體過濾器、液位電極、進液循環管b和吸液循環管b ;進液循環管b上設有第I換向閥，進液循環管b通過回流管與補充液吸液管連通，回流管上設有第II換向閥；培養基盛液罐設置在加熱恆溫水箱內或者培養基盛液罐外的夾水層通過熱水循環水泵和循環水管與加熱恆溫水箱連通；培養基盛液罐通過吸液循環管a、第II蠕動泵、進液循環管b和第I換向閥與細胞培養反應罐連通；細胞培養反應罐通過吸液循環管a、第III蠕動泵和進液循環管a與培養基盛液罐連通；培養基盛液罐通過吸液循環管a、第II蠕動泵、回流管、第II換向閥、經補充液吸液管與培養基補充或回收瓶連通(此時第I換向閥是處於關閉狀態，第II換向閥處於打開狀態)；培養基補充或回收瓶通過補充液吸液管、第I蠕動泵和補充液進液管與培養基盛液灌連通(此時第II換向閥是處於關閉狀態)。上述攪拌裝置的中部安裝有循環管氣壓接口，攪拌裝置的下端安裝有內循環攪拌器。本實用新型的潮汐式動物細胞培養生物反應器還包括電器控制機箱和操作控制 顯示屏，其中電器控制機箱有工作指示燈和電源開關。本實用新型的潮汐式動物細胞培養生物反應器還包括工作架；加熱恆溫水箱和培養基補充或回收瓶擺放在工作架下層，三氣夾水套恆溫培養箱擺放在工作架的上層，各構件按照上述連接關係連接。[0009]下面對本實用新型做進ー步的解釋和說明一、本實用新型的潮汐式動物細胞培養生物反應器各部分的功能詳細介紹如下I、三氣夾水套恆溫培養箱(18):是集夾水套恆溫、ニ氧化碳、氧氣、氮氣於一體混合式培養箱，通過三氣混合調節閥(31)調節ニ氧化碳、氧氣、氮氣，提供一種適應於細胞生長的環境，有效的保證了細胞在它適應的環境中能高密度快速生長。2、細胞培養反應罐(17):細胞培養反應罐(17)內填充有供細胞貼壁生長載體
(25)，細胞培養反應罐(17)設有攪拌裝置(20)、氣體過濾器(22)、液位電極(21)和進液循環管b(12)和出液循環管b (13)。多孔細胞培養載體(25)是海綿狀多孔固定床載體。細胞培養反應罐的細胞培養原理是將細胞粘貼在培養反應罐內的多孔載體內，培養基盛液罐(3)通過吸液循環管a(10)、第II蠕動泵(15)和進液循環管b(12)向細胞培養反應罐(17)內輸送培養基，使其充滿反應罐並淹沒載體；然後再通過吸液循環管a (13)、第III蠕動泵(16)和出液循環管a(ll)回流至培養基盛液罐(3)內，以暴露出載體；當載體暴露出來時，細胞可以獲得充分的氧氣並釋放出ニ氧化碳。當載體被培養基淹沒時，細胞可以獲得養分並將代謝的廢棄物釋放出來。它的原理形類似於潮起潮落。本設計裝置提供了ー個以小空間高密度細胞、較大細胞生長的表面積，培養基在循環過程中無泡沫、高氧氣供應的環境。可適應於多種細胞的培養。3、培養基盛液罐(3)的上端固定有盛液罐氣體過濾器(4)、PH值檢測電極(5)、糖分檢測電極出)、溶氧檢測電極(7)、吸液循環管a(10)、進液循環管a(ll)和補充液進液管
(9);需要收穫回收液時，關閉第I換向閥(33)、打開第II換向閥(44)，回收液則從培養基盛液罐(3)內通過吸液管a(10)、第II蠕動泵(15)、回流管(45)、第II換向閥(44)和培養基補充吸液管(8)流向培養基補充或回收瓶(30)內；需要補充培養基時，關閉第II換向閥(44)，培養基補充液或回收瓶(30)內的培養基通過補充液吸液管(8)經第I蠕動泵(14)和補充液進液管(9)向培養基盛液罐(3)內補充培養基；實現回收液收穫或補充培養基注入罐體的功能。PH值檢測電極(5)、糖分檢測電極(6)、和溶氧檢測電極(7)用於檢測盛液罐的培養基各方指標反應變化。4、加熱恆溫水箱(2):培養基盛液罐(3)設置在加熱恆溫水箱(2)內或者培養基盛液罐(3)外的夾水層通過熱水循環水泵(37)和循環水管(43)與加熱恆溫水箱(2)連通，使培養基盛液罐(3)內的培養基預熱與細胞培養反應罐(17)內的溫度一致。當培養基循環與生物培養反應罐中時，溫差變化不大，能使細胞在培養過程中不受影響。5、培養基補充或回收瓶(30)的作用是當培養基盛液罐內的培養基含糖量下降時，可通過關閉第II換向閥(44)，培養基補充或回收瓶(30)內的培養基通過補充液吸液管(8)經第I蠕動泵(14)和補充液進液管(9)向培養基盛液罐(3)內補充培養基；反之，需要收穫回收液時，關閉第I換向閥(33)，打開第II換向閥(44)，回收液則從培養基盛液罐(3)內通過吸液管a(10)、第II蠕動泵(15)、回流管(45)培養基補充吸液管(8)流向培養基補充或回收瓶(30)內。6、第I蠕動泵(14)、第II蠕動泵(15)和第III蠕動泵(16):作用於該裝置中，由控制中心來控制執行對細胞培養反應罐與培養基盛液罐內的培養基經管道往復循環或補充新的培養基。7、各種管道作用於新培養液的補充和回收液的收穫及培養基盛液罐與細胞培養反應罐之間往復循環。8、顯示器操作控制屏(26):可以直觀的模擬顯示整個裝置エ藝流程和各個部位檢測及控制操作。本實用新型的潮汐式動物細胞培養生物反應器由操作控制顯示屏進行顯示、操作和控制，顯示全裝置各部分エ藝流程的培養反應。檢測細胞培養、培養基循環、三氣培養比率的自動調配供給和新培養基補充的數據，模擬動態顯示各裝置的反應變化和控制各裝置的培養反應。控制顯示直觀，操作簡單方便。9、控制系統機箱(27):是控制整個裝置中各部位的監測的數據、收集處理及對各執行機構的轉換運行。10、工作指示燈(28):是整個裝置中各執行機構工作指示。ニ、本實用新型的潮汐式動物細胞培養生物反應器的原理本設計方案是將生物反應器整體裝置結構擺放在可移動的工作架(I)上，結構緊·湊，操作方便。該反應器工作原理是將海綿狀多孔培養載體(25)的細胞培養反應罐(17)置入三氣夾水套恆溫培養箱(18)內，設置三氣夾水套培養箱(18)內恆溫度，同時調好三氣比例及恆溫水槽溫度。開機由第II蠕動泵(15)，通過吸液循環管a(10)和進液循環管b(12)將培養基盛液罐(3)內的培養基輸送入細胞培養反應罐(17)內，同時注入細胞種。當細胞培養反應罐(17)內培養基達到一定液位時，液位電極(21)控制第II蠕動泵(15)停止輸送培養基。此時攪拌馬達(20)啟動內循環攪拌器(24)，使細胞培養反應罐(17)內的培養基由罐底往上再順時針旋轉攪拌，管ロ均勻的溢流往返流動，使細胞種能很好的大面積的沉降到多孔載體所有的表面。當內循環攪拌器(24)停止工作時，細胞迅速沉降粘附於載體上，細胞粘附於載體後，細胞進入培養階段，細胞培養反應罐(17)開始培養工作。培養一段時間後，培養反應罐內的培養基定時定量的被吸走，通過吸液循環管a(13)、第III蠕動泵(16)和進液循環管a(ll)回流至培養基盛液罐(3)內，與細胞培養反應罐(17)往返循環。當細胞培養反應罐(17)的培養基被吸走時，暴露出的載體細胞獲得充分的氧氣並釋放出ニ氧化碳。當載體被培養基淹沒時，細胞可以獲得養分並將代謝的廢棄物釋放出來。同時培養基盛液罐(3)的電極時刻檢測培養基的各項指標的反應變化，隨時向培養基盛液罐(3)內補充新培養基，調節培養基糖、酸、鹼度的變化及調節三氣夾水套培養箱(18)內的氣體濃度。與現有技術相比，本實用新型的有益效果是本實用新型的設備投資小、佔用場地小、生產運行成本低、產量高。一臺5升的潮汐式生物培養反應裝置的產量相當於25瓶位、3000ml/瓶的轉瓶培養機15臺，從而有效的提供了生物製品和生物醫藥及生物疫苗的生產平臺，達到了低成本、提高產量的目的。
以下結合附圖
和實施例對本實用新型作進ー步說明圖I是本實用新型實施例2的整體結構示意圖；圖2是圖I的加熱恆溫水箱(2)和培養基盛液罐⑶的結構示意圖(帶局部剖)；圖3是圖I的三氣夾水套培養箱(18)的正視圖(帶局部剖)；圖4是圖I的三氣夾水套培養箱(18)的側視圖(帶局部剖)；圖5是圖I的內循環攪拌器(24)的結構示意圖(帶局部剖)；[0032]圖6是本實用新型實施例3的整體結構示意圖(帶局部剖);圖7是圖6的加熱恆溫水箱⑵和培養基盛液罐⑶的結構示意圖(帶局部剖)；其中I為工作架，2為加熱恆溫水箱，3為培養基盛液罐，4為盛液罐氣體過濾器，5為PH值檢測電極、6為糖分檢測電極、7為溶氧檢測電極,8為補充液吸液管,9為補充液進液管，10為吸液循環管a、11為進液循環管a, 12為進液循環管b和13為吸液循環管b, 14為第I蠕動泵，15為第II蠕動泵，16為第III蠕動泵，17為細胞培養反應灌，18為三氣夾水套恆溫培養箱，19為內循環液出口，20為攪拌裝置，21為液位電極，22為氣體過濾器，23 為循環管氣壓接口，24為內循環攪拌器，25為多孔細胞培養載體，26為操作控制顯示屏，27為電器控制機箱，28為工作指示燈，29為電源開關，30為培養基液補充或回收瓶，31為三氣混合調節器，32為載體託盤，33為第I換向閥，34為氧氣管，35為氮氣管，36為內循環螺旋槳，37是熱水循環水泵，38是培養基綜合攪拌器，39是盛液罐內玻璃視窗，40是攪拌馬達，41是溫度檢測傳感器，42是恆溫加熱器，43循環水管，44為第II換向閥，45為回流管。
具體實施方式
為了更好的理解本實用新型，下面結合實施例對本實用新型做進一步地詳細說明，但是本實用新型要求保護的範圍並不局限於實施例所示的範圍。除特別說明外，本實用新型應用實施例中的百分含量均指質量百分含量。實施例I :一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，還包括培養基盛液罐(3)和三氣夾水套恆溫培養箱(18);其中，培養基盛液罐(3)的上端固定有盛液罐氣體過濾器(4)、PH值檢測電極(5)、糖分檢測電極￠)、溶氧檢測電極(7)、吸液循環管a(10)、進液循環管a(ll)和補充液進液管(9);三氣夾水套恆溫培養箱(18)內設有填充有細胞培養載體(25)的細胞培養反應罐(17)，三氣夾水套恆溫培養箱(18)的一側設有第I蠕動泵(14)、第II蠕動泵
(15)和第III蠕動泵(16)，細胞培養反應罐(17)設有攪拌裝置(20)、氣體過濾器(22)、液位電極(21)、進液循環管b (12)和吸液循環管b(13);進液循環管b(12)上設有第I換向閥
(33)，進液循環管b (12)通過回流管(45)與補充液吸液管(8)連通，回流管(45)上設有第II換向閥(44);培養基盛液罐(3)設置在加熱恆溫水箱(2)內或者培養基盛液罐(3)外的夾水層通過熱水循環水泵(37)和循環水管(43)與加熱恆溫水箱(2)連通；培養基盛液罐
(3)通過吸液循環管a(10)、第II蠕動泵(15)、進液循環管b(12)和第I換向閥(33)與細胞培養反應罐(17)連通；細胞培養反應罐(17)通過吸液循環管a(13)、第III蠕動泵(16)和進液循環管a(ll)與培養基盛液罐(3)連通；培養基盛液罐(3)通過吸液循環管a(10)、第II蠕動泵(15)、回流管(45)、第II換向閥(44)、經補充液吸液管(8)與培養基補充或回收瓶(30)連通(此時第I換向閥是處於關閉狀態，第II換向閥處於打開狀態)；培養基補充或回收瓶(30)通過補充液吸液管(8)、第I蠕動泵(14)和補充液進液管(9)與培養基盛液灌⑶連通(此時第II換向閥是處於關閉狀態)。如圖5所示，所述攪拌裝置(20)的中部安裝有循環管氣壓接口(23)，攪拌裝置
(20)的下端安裝有內循環攪拌器(24)。本實用新型的一種潮汐式動物細胞培養生物反應器還包括電器控制機箱(27)和操作控制顯示屏(26)，其中電器控制機箱(27)有工作指示燈(28)和電源開關(29)。[0040]實施例2 本實用新型的一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，如圖I所示，還包括工作架
(I);加熱恆溫水箱(2)和培養基補充或回收瓶(30)擺放在工作架(I)下層，三氣夾水套恆溫培養箱(18)擺放在工作架(I)的上層，各構件按照實施例I所述連接關係連接。實施例3 本實用新型的一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，反應器如圖6所示，其中培養基盛液罐(3)外的夾水層通過熱水循環水泵(37)和循環水管(43)與加熱恆溫水箱(2)連通；(如圖7所示)，培養基盛液罐(3)擺放在工作架的旁邊，其它各構件跟實施例I相同，按照實施例I所述連接關係連接。實施例4 :本實用新型的一種潮汐式動物細胞培養生物反應器的工作過程 將放有多孔細胞培養載體(25)的細胞培養反應罐(17)置入三氣夾水套恆溫培養箱(18)內，設置三氣夾水套培養箱(18)內恆溫度，同時調好三氣比例及恆溫水槽溫度。開機由第II蠕動泵(15)，通過吸液循環管a (10)和進液循環管b(12)將培養基盛液罐(3)內的培養基輸送入細胞培養反應罐(17)內，同時注入細胞種。當細胞培養反應罐(17)內培養基淹沒全部的多孔細胞培養載體(25)時，液位電極(21)控制第II蠕動泵(15)停止輸送培養基。此時啟動內循環攪拌器(24)，使細胞培養反應罐(17)內的培養基由罐底往上再順時針旋轉攪拌，管口均勻的溢流往返流動，使細胞種能很好的大面積的沉降到多孔載體所有的表面。當內循環攪拌器(24)停止工作時，細胞粘壁後進入培養階段，細胞培養反應罐(17)開始培養反應工作。培養一段時間後，培養反應罐內的培養基定時的被吸走，通過吸液循環管a(13)、第III蠕動泵(16)和進液循環管a(ll)回流至培養基盛液罐(3)內，實現培養基盛液罐(3)內的培養基與細胞培養反應罐(17)往返循環。當細胞培養反應罐
(17)的培養基被吸走時，暴露出的載體細胞獲得充分的氧氣並釋放出二氧化碳。當載體被培養基淹沒時，細胞可以獲得養分並將代謝的廢棄物釋放出來。同時培養基盛液罐(3)的電極時刻檢測培養基的各項指標的反應變化，控制中心隨時向培養基盛液罐(3)內補充新培養基，調節培養基糖、酸、鹼度的變化及調節三氣夾水套培養箱(18)內的氣體濃度。需要收穫回收液時，關閉第I換向閥(33)、打開第II換向閥(44)，回收液則從培養基盛液罐(3)內通過吸液管a(10)、第II蠕動泵(15)、回流管(45)、第II換向閥(44)和培養基補充吸液管(8)流向培養基補充或回收瓶(30)內；需要補充培養基時，關閉第II換向閥(44)，培養基補充液或回收瓶(30)內的培養基通過補充液吸液管(8)經第I蠕動泵(14)和補充液進液管(9)向培養基盛液罐(3)內補充培養基；實現回收液收穫或補充培養基注入罐體的功倉泛。實施例6 :應用實施例I.用5升潮汐式生物反應器培養PK15細胞I. I載體處理取100克細胞培養載體(25)，用PH值為7. 2，0. IM的PBS (去離子水配製)3升浸泡2小時。自然浙幹備用。I. 2滅菌取出細胞培養反應罐(17)，加入處理好的載體和2升PBS，其所有管口用潔淨布包紮好，於滅菌器中116°C滅菌40分鐘。培養基盛液罐(3)的所有管口用潔淨布包紮好，矽膠管等用品用潔淨布包紮好，於滅菌器中121°C滅菌30分鐘。I. 3連接管道在百級潔淨環境，用無菌操作將細胞培養反應罐(17)出口與培養基盛液罐(3)回流ロ用矽膠管連接，將細胞培養反應罐(17)進液ロ與培養基盛液罐(3)出ロ用矽膠管連接。I. 4細胞培養反應罐(17)的參數設定培養箱溫度為37°C，C02的體積濃度5%。攪拌裝置(20)的轉速為150轉/分鐘。培養基盛液罐(3)的水溫設定為37°C。I. 5接種細胞開啟蠕動泵將細胞培養反應罐(17)中的PBS吸取棄去，加入2升含細胞濃度為2 X 105個/ml的PK15種細胞(用含10%新生牛清，雙抗100単位/ml的高糖DMEM培養基配成)。開啟內循環攪拌器(24)攪拌30分鐘，靜止3小時後，再攪拌20分鐘，停止攪拌。I. 6細胞培養具體培養過程同實施例5,控制載體被培養基淹沒的時間為6min,然後吸走培養基使細胞暴露的時間也為6min，如此重複循環，直到細胞培養反應罐(17)運轉96小時左右，培養基的葡萄糖含量小於500mg/L吋，需換新的培養基，此時載體上已布滿 細胞。2.用5升潮汐式高密度載體生物培養反應器培養PK15細胞生產豬瘟疫苗2. I細胞培養同實施例5。2. 2接毒細胞生長良好後，然後棄去舊培養基，加入含4%新生牛清，雙抗100單位/ml，豬瘟脾毒O. 5%的高糖DMEM培養基5升。培養72小時左右，培養基內葡萄糖含量小於500mg/L吋，收穫毒液，換入含4%新生牛清，雙抗100単位/ml的高糖DMEM培養基。每當培養基內葡萄糖含量小於500mg/L時(72小時左右)，收穫毒液、換培養基。2. 3測毒結果，見表I:表I用PK15細胞培養豬瘟活疫苗試驗結果
細胞病毒細胞濃度病毒滴度
PKl 5豬瘟3.7X1072*106 兔感染量/ml
權利要求1.ー種潮汐式動物細胞培養生物反應器，包括培養基補充或回收瓶(30)和加熱恆溫水箱(2)，其特徵是，還包括培養基盛液罐(3)和三氣夾水套恆溫培養箱(18);其中，培養基盛液罐⑶的上端固定有盛液罐氣體過濾器(4)、PH值檢測電極(5)、糖分檢測電極(6)、溶氧檢測電極(7)、吸液循環管a(10)、進液循環管a(ll)和補充液進液管(9);三氣夾水套恆溫培養箱(18)內設有填充有細胞培養載體(25)的細胞培養反應罐(17)，三氣夾水套恆溫培養箱(18)的一側設有第I蠕動泵(14)、第II蠕動泵(15)和第III蠕動泵(16)，細胞培養反應罐(17)設有攪拌裝置(20)、氣體過濾器(22)、液位電極(21)、進液循環管b (12)和吸液循環管b(13);進液循環管b(12)上設有第I換向閥(33)，進液循環管b (12)通過回流管(45)與補充液吸液管(8)連通，回流管(45)上設有第II換向閥(44);培養基盛液罐(3)設置在加熱恆溫水箱(2)內或者培養基盛液罐(3)外的夾水層通過熱水循環水泵(37)和循環水管(43)與加熱恆溫水箱(2)連通；培養基盛液罐(3)通過吸液循環管a(10)、第II蠕動泵(15)、進液循環管b (12)和第I換向閥(33)與細胞培養反應罐(17)連通；細胞培養反應罐(17)通過吸液循環管a(13)、第III蠕動泵(16)和進液循環管a(ll)與培養基盛液罐⑶連通；培養基盛液罐⑶通過吸液循環管a(10)、第II蠕動泵(15)、回流管(45)、第II換向閥(44)、經補充液吸液管(8)與培養基補充或回收瓶(30)連通；培養基補充或回收瓶(30)通過補充液吸液管(8)、第I蠕動泵(14)和補充液進液管(9)與培養基盛液灌(3)連通。
2.根據權利要求I所述的ー種潮汐式動物細胞培養生物反應器，其特徵是，所述攪拌裝置(20)的中部安裝有循環管氣壓接ロ(23)，攪拌裝置(20)的下端安裝有內循環攪拌器(24)。
3.根據權利要求I所述的ー種潮汐式動物細胞培養生物反應器，其特徵是，還包括電器控制機箱(27)和操作控制顯示屏(26)，其中電器控制機箱(27)有工作指示燈(28)和電源開關(29)。
4.根據權利要求I所述的ー種潮汐式動物細胞培養生物反應器，其特徵是，還包括エ作架(I);加熱恆溫水箱(2)和培養基補充或回收瓶(30)擺放在工作架(I)下層，三氣夾水套恆溫培養箱(18)擺放在工作架(I)的上層，各構件按照權利要求I所述的連接關係連接。
專利摘要本實用新型提供了一種潮汐式動物細胞培養生物反應器，主要包括培養基盛液罐(3)和三氣夾水套恆溫培養箱(18)；三氣夾水套恆溫培養箱(18)內設有細胞培養反應罐(17)；培養基盛液罐(3)設置在加熱恆溫水箱(2)內或者培養基盛液罐(3)外的夾水層通過熱水循環水泵(37)與加熱恆溫水箱(2)連通；細胞培養反應罐(17)通過第III蠕動泵(16)與培養基盛液罐(3)連通，培養基盛液罐(3)通過第II蠕動泵(15)與培養基補充或回收瓶(30)連通，培養基補充或回收瓶(30)通過第I蠕動泵(14)與培養基盛液灌(3)連通。本實用新型的潮汐式動物細胞生物培養反應器投資小、佔用場地小、生產運行成本低、產量高。
文檔編號C12M3/04GK202415569SQ2011204838
公開日2012年9月5日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者向開興, 陶伯輝 申請人:向開興