改進的安卡拉痘苗病毒(mva)基因組中作為插入位點的基因間隔區的製作方法

2023-04-29 10:31:56 2

專利名稱：改進的安卡拉痘苗病毒(mva)基因組中作為插入位點的基因間隔區的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於將外源DNA序列整合到MVA基因組中的新插入位點。
背景技術：
改進的安卡拉痘苗病毒(MVA)是正痘病毒家族成員，通過痘苗病毒(CVA)的安卡拉病毒株在雞胚成纖維細胞上連續傳代約570代而得到(綜述可參見Mayr，A.等 ，Infection 3，6-14)。作為傳代的結果，得到的MVA病毒與CVA相比缺少31kb的基因組信息，並且對宿主具有高度選擇性(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038 )。MVA的特徵在於其極度減毒，也就是說毒力和感染性下降，但是仍然具有良好的免疫原性。在各種動物模型中進行檢測，證明MVA甚至在免疫受到抑制的個體中也是無致病力的。更加重要的是，MVA病毒株的優良特性已經在大量臨床試驗中被證實(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390 )。在這些超過12萬人參與的試驗中，包括高危患者，沒有產生副作用(Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392 )。
在哺乳動物細胞中還發現，MVA在病毒複製周期的最後階段被阻斷(Sutter，G和Moss，B. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)。從而，MVA完全複製其DNA，合成早期、中期和晚期的基因產物，但是不能組裝成熟的感染性病毒體，病毒體從被感染的細胞中釋放出。因此，由於複製受到限制，MVA被推薦作為一種基因表達載體。
最近，MVA被用於生產重組疫苗，表達插入到MVA基因組的胸苷激酶(tk)基因位點上(US5,185,146)或者天然存在的缺失位點上(PCT/EP96/02926)的抗原性序列。
雖然tk插入位點被廣泛地用於生產重組痘病毒的生產，特別用於生產重組痘苗病毒(Mackett等 P.N.A.S.USA 79，7415-7419)。這種技術不適用於MVA。Scheiflinger等證明，與其他痘病毒相比，MVA對基因組的修飾更加敏感，這種修飾可用於生產重組痘病毒。Scheiflinger等特別證明了用於將異源DNA整合到痘病毒基因組中的最常用的位點之一，即胸苷激酶(tk)基因座，不能被用於生產重組MVA。任何生成的tk(-)重組MVA被證明是高度不穩定的，並且在純化後立即刪除插入的DNA以及MVA的DNA基因組的某些部分(Scheiflinger等， ，Arch Virol，141663-669)。
因此，不穩定性以及大概率的基因組重組是痘病毒學中的已知問題。事實上，MVA是在長期的傳代過程中被建立，利用了CVA病毒基因組在組織培養細胞中體外複製時不穩定的事實。成千上萬的核苷酸(31kb)已經從MVA基因組中被刪除，與原始的CVA基因組相比，表現為6種主要的和無數小片段的缺失。
最近，MVA的基因組結構被描述(Antoine等， ，Virology 244，365-396)。178kb的MVA基因組被密集地包裹，包含193個獨立的開放閱讀框(ORF)，編碼長度至少為63個胺基酸的蛋白質。與高感染性的天花病毒以及稱作哥本哈根(Copenhagen)病毒株的痘苗病毒原型相比，MVA的大多數ORF被切成片段或被截短(Antoine等， ，Virology 244，365-396)。但是，極少例外，所有ORF被轉錄和翻譯成蛋白質，包括片段化的和截短的ORF。在下文中，採用Antoine等的命名，適當時也指明了基於限制性酶消化的命名。
迄今，僅將外源DNA插入到MVA基因組的天然缺失位點上獲得穩定的重組MVA(PCT/EP96/02926)。不幸的是，MVA基因組中僅有有限數量的天然缺失位點。此外，已經證明其他插入位點如tk基因座幾乎不能被用於生產重組MVA(Scheiflinger等， ，Arch Virol 141663-669)。
發明目的本發明的目的是確定MVA基因組的其他插入位點，並提供插入載體，該插入載體引導外源DNA序列插入到MVA基因組的所述新確定的位點上。
本發明還有一個目的是提供重組MVA，其包括被穩定地整合到MVA基因組的新插入位點上的外源DNA序列。
發明詳述本發明的發明者確定用於將外源DNA序列插入到改進的安卡拉痘苗(MVA)病毒基因組的新位點。新插入位點定位在病毒基因組的基因間隔區(IGR)，反過來說，其中所述IGR定位在MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或與兩個相鄰的ORF側面連接。
因此，本發明涉及包含插入到病毒基因組的IGR的異源DNA序列的重組MVA。按照本發明，一種或多種外源DNA序列可以被插入到一個或多個IGR中。
令人驚奇地發現，外源DNA序列實際上被穩定地插入到MVA基因組的IGR中如上面已經指出，MVA基因組被認為是十分不穩定的。似乎，病毒繁殖不必需的基因或DNA序列都被刪除或切割。儘管還驚奇地發現，當異源DNA序列被插入到MVA基因組的天然缺失位點時，得到了穩定的重組MVA(PCT/EP96/02926)，另一方面還發現，被廣泛地用於生產其他重組痘病毒的宿主範圍基因如tk-基因座不是MVA中的合適插入位點。Vero-MVA具有一個額外的基因組缺失的事實(PCT/EP01/02703)也說明了基因組在某種意義上是高效能的(dynamic)，它很容易刪除繁殖所不需要的基因。因此，可以預料，將對於病毒繁殖來說不是必需的異源DNA序列插入ORF之間的位置上同樣會被病毒刪除。
ORF的核苷酸序列編碼構成肽、多肽或蛋白質的胺基酸序列，兩個ORF之間的IGR不具有編碼能力，但是可能包含參與病毒基因表達的轉錄調控所必需的調控元件，結合位點，啟動子和/或增強子序列。因此，IGR可能參與病毒生活周期的調控。然而，本發明的發明人也證明新的插入位點具有意想不到的優點，外源DNA序列可以被穩定地插入到MVA基因組中，而不影響或改變MVA的典型特徵和基因表達。因為新的插入位點不會改變MVA的ORF或編碼序列，所以是特別有用的。
而且，驚奇地發現被插入到IGR的外源基因的表達水平高於被插入到MVA基因組的缺失位點的外源基因的表達水平(另參見實施例1)。
ORF的核苷酸序列規律性地以起始密碼子開始而且以終止密碼子結束。根據兩個鄰近的ORF的方向，這些ORF之間的區域IGR與兩個鄰近的ORF的兩個終止密碼子側面連接，或者與兩個鄰近的ORF的兩個起始密碼子側面連接，或者與第一個ORF的終止密碼子和第二個ORF的起始密碼子側面連接，或者與第一個ORF的起始密碼子和第二個ORF的終止密碼子側面連接。
相應地，外源基因插入IGR的插入位點位於第一個ORF的下遊或3』終止密碼子端。當鄰近ORF，也稱作第二個ORF，具有與第一個ORF相同的方向時，位於第一個ORF的終止密碼子下遊的插入位點位於第二個ORF的起始密碼子的上遊或5』起始密碼子端。
當第二個ORF具有與第一個ORF相反的方向時，也就是說兩個鄰近ORF的方向彼此相對時，那麼插入位點位於兩個ORF的終止密碼子的下遊。
作為第三種選擇，在兩個鄰近的ORF以相反方向讀取時，但是兩個鄰近的ORF的取向相互背離，這等同於這樣的分布，其特徵在於兩個ORF的起始密碼子相互鄰近，外源DNA被插入到相對於兩個起始密碼子的上遊。
MVA基因組中的ORF以兩種編碼方向存在。結果聚合酶從左到右地起作用即正向，和相應地從右到左起作用(反向)。這是痘病毒學中的常規操作，並且成為通過痘苗病毒在基因組的不同HindIII限制性消化片段上的方向和位置來確定ORF的標準分類。對於該命名，不同HindIII片段通過對應於其遞減大小的遞減首字母來命名。ORF從左到右在各個HindIII片段上編號，ORF的方向用大寫字母L(表示轉錄從右到左)或R(表示轉錄從左到右)來表示。另外，較近公開的MVA基因組結構中採用了不同命名，從基因組的左邊到右邊簡單命名ORF，用大寫L或R表示它們的方向(Antoine等， ，Virology244，365-396)。作為一個實例，按照老的命名I4L ORF對應於按照Antoine等命名的064L ORF。如果沒有另外指出，本發明採用按照Antoine等的命名。
按照本發明，異源DNA序列可以被插入到選自下組的兩個鄰近ORF之間的一個或多個IGR中，該組包括001L-002L，002L-003L，005R-006R，006L-007R，007R-008L，008L-009L，017L-018L，018L-019L，019L-020L，020L-021L，023L-024L，024L-025L，025L-026L，028R-029L，030L-031L，031L-032L，032L-033L，035L-036L，036L-037L，037L-038L，039L-040L，043L-044L，044L-045L，046L-047R，049L-050L，050L-051L，051L-052R，052R-053R，053R-054R，054R-055R，055R-056L，061L-062L，064L-065L，065L-066L，066L-067L，077L-078R，078R-079R，080R-081R，081R-082L，082L-083R，085R-086R，086R-087R，088R-089L，089L-090R，092R-093L，094L-095R，096R-097R，097R-098R，101R-102R，103R-104R，105L-106R，107R-108L，108L-109L，109L-110L，110L-111L，113L-114L，114L-115L，115L-116R，117L-118L，118L-119R，122R-123L，123L-124L，124L-125L，125L-126L，133R-134R，134R-135R，136L-137L，137L-138L，141L-142R，143L-144R，144R-145R，145R-146R，146R-147R，147R-148R，148R-149L，152R-153L，153L-154R，154R-155R，156R-157L，157L-158R，159R-160L，160L-161R，162R-163R，163R-164R，164R-165R，165R-166R，166R-167R，167R-168R，170R-171R，173R-174R，175R-176R，176R-177R，178R-179R，179R-180R，180R-181R，183R-184R，184R-185L，185L-186R，186R-187R，187R-188R，188R-189R，189R-190R，192R-193R。
按照老的命名，ORF 006L對應於C10L，019L對應於C6L，020L對應於N1L，021L對應於N2L，023L對應於K2L，028R對應於K7R，029L對應於F1L，037L對應於F8L，045L對應於F15L，050L對應於E3L，052R對應於E5R，054R對應於E7R，055R對應於E8R，056L對應於E9L，062L對應於I1L，064L對應於I4L，065L對應於I5L，081R對應於L2R，082L對應於L3L，086R對應於J2R，088R對應於J4R，089L對應於J5L，092R對應於H2R，095R對應於H5R，107R對應於D10R，108L對應於DHL，122R對應於A11R，123L對應於A12L，125L對應於A14L，126L對應於A15L，135R對應於A24R，136L對應於A25L，137L對應於A26L，141L對應於A30L，148R對應於A37R，149L對應於A38L，152R對應於A40R，153L對應於A41L，154R對應於A42R，157L對應於A44L，159R對應於A46R，160L對應於A47L，165R對應於A56R，166R對應於A57R，167R對應於B1R，170R對應於B3R，176R對應於B8R，180R對應於B12R，184R對應於B16R，185L對應於B17L，187R對應於B19R。
優選地，異源序列被插入到與兩個鄰近ORF側面連接的IGR中，所述兩個鄰近的ORF選自包含007R-008L、018L-019L044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的組。
異源的或外源的DNA序列是實際上通常與本發明所用的痘病毒無關的序列。按照本發明的還有一個實施方案，外源DNA序列包含至少一個編碼序列。該編碼序列被可操作地與轉錄控制元件連接，優選連接到痘病毒轉錄控制元件上。另外，還可以採用痘病毒轉錄調控元件與例如內部核糖體進入位點的組合。
按照還有一個實施方案，外源DNA序列還可以包含兩個或多條編碼序列，被連接到一個或多個轉錄控制元件上。優選地，編碼序列編碼一種或多種蛋白質、多肽、肽、外源抗原或抗原表位，特別是那些具有治療意義的基因。
按照本發明的治療上有意義的基因可以是來自致病的病原體或感染性微生物的基因或者與之同源的基因。因此，在本發明的上下文中，這種治療上有意義的基因被呈遞給生物體的免疫系統來影響、優選誘導特定的免疫反應和，從而接種免疫或預防性地保護生物體抵抗微生物的感染。在本發明的還有一個優選實施方案中，治療上有意義的基因選自感染性病毒的基因，例如但不限於登革病毒、日本腦炎病毒、B肝病毒或C肝病毒，或免疫缺陷病毒如HIV。
來源於登革病毒的基因優選為NS1和PrM基因，其中所述基因可以來自一種、兩種、三種或所有的四種登革病毒血清型。NS1基因優選來源於登革病毒血清2型，並優選被插入到ORF 064L-065L(I4L-I5L)之間的IGR中。PrM基因優選來源於所有四種登革病毒血清型，並優選被插入到ORF之間的IGR中，所述ORF選自007R-008L、044L-045L、136L-137L或148R-149L。更加優選地，來自登革病毒血清1型的PrM(prM 1)被插入到148R-149L之間的IGR中，PrM 2插入007R-008L之間的IGR中，PrM 3插入ORF 044L-045L之間的IGR中，和PrM 4插入IGR 136L-137L中。
按照本發明的還有一個方面，異源DNA序列來自HIV，並且編碼HIVenv，其中HIV env優選被插入到ORF 007R-008L之間的IGR中。
而且，按照本發明的治療上有意義的基因還包括疾病相關基因，其對增生紊亂、癌症或代謝疾病具有治療作用。例如，與癌症相關的治療上有意義的基因可以作為癌症抗原，能夠誘導特定的抵抗癌症的免疫反應。
按照本發明的還有一個實施方案，編碼序列包含至少一個標記或選擇基因。
選擇基因將特定抗性轉導給細胞，從而能夠使用一些選擇方法。技術人員熟悉各種選擇基因，它們可以被應用於痘病毒系統中。在這些基因中有新黴素抗性基因(NPT)或磷酸核糖轉移酶基因(gpt)。
標記基因在被轉導的細胞中誘導顯色反應，可以用來確定被轉導的細胞。技術人員熟悉各種標記基因，它們可以被應用於痘病毒系統。在這些基因中有編碼例如β半乳糖苷酶(β-gal)、β-葡糖苷酶(β-glu)、綠色螢光蛋白(EGFP)或藍色螢光蛋白的基因。
按照本發明的還有一個實施方案，外源DNA序列包含間隔序列(spacersequence)，間隔序列將痘病毒轉錄控制元件和/或外源DNA序列中的編碼序列與鄰近ORF的終止密碼子和/或起始密碼子分開。位於鄰近ORF的終止/起始密碼子和外源DNA的插入編碼序列之間的間隔序列具有穩定插入外源DNA以及任何生成的重組病毒的優點。間隔序列的大小是可變的，只要該序列不具有自身編碼或調控功能。
按照另一個實施方案，將痘病毒轉錄調控元件和/或外源DNA序列中的編碼序列與鄰近ORF的終止密碼子分開的間隔序列至少為1個核苷酸長度。
按照本發明的另一個實施方案，將痘病毒轉錄調控元件和/或外源DNA序列中的編碼序列與鄰近ORF的起始密碼子分開的間隔序列至少為30核苷酸。特別地，在典型的痘苗病毒啟動子元件位於起始密碼子的上遊時，插入外源DNA不能將啟動子元件與鄰近ORF的起始密碼子分開。典型的痘苗病毒啟動子元件可以通過掃描例如晚期啟動子序列「TAAAT」(Davison Moss，J.Mol.Biol.1989；210771-784)和早期啟動子的富含A/T的結構域來鑑定。約30個核苷酸的間隔序列是保護位於ORF的起始密碼子上遊的痘病毒啟動子不被幹擾的優選距離。此外，按照另一個優選實施方案，插入的外源DNA和鄰近ORF的起始密碼子的距離約50個核苷酸，更優選為約100個核苷酸。
按照本發明的另一個優選實施方案，間隔序列包含其他痘病毒轉錄調控元件，其能夠控制鄰近ORF的轉錄。
可以按照本發明被用於製備重組MVA的典型MVA病毒株是MVA-575，其已經被保藏在歐洲動物細胞培養物保藏中心(European Collection ofAnimal Cell Cultures)，保藏號為ECACC V00120707。
另一個優選MVA病毒株是MVA-Vero或其衍生物。MVA-Vero病毒株被保藏在歐洲動物細胞培養物保藏中心，保藏號為ECACC V99101431和01021411。MVA-Vero的安全性通過生物的、化學的和物理的特性反映，如在國際專利申請PCT/EP01/02703中所描述。與其他MVA病毒株比較，Vero-MVA包括一個額外的基因組缺失。
還有另一種優選的MVA病毒株是MVA-BN。MVA-BN已經被保藏在歐洲動物細胞培養物保藏中心，保藏號為ECACC V00083008。MVA-BN病毒是極度減毒的病毒，也是來源於改進的安卡拉痘苗病毒(還參見PCT/EP01/13628)。
按照本發明，術語病毒的「衍生物」是指具有與親本病毒相同的典型特徵，但是在基因組的一個或多個部分不同的後代病毒。術語「MVA衍生物」表述一種病毒，其具有一些與MVA相同的功能特徵。例如，MVA-BN衍生物具有MVA-BN的典型特徵。MVA-BN或其衍生物的這些特徵之一是其在人HaCat細胞中毒力下降並不能複製。
本發明的重組MVA可以用作藥物或疫苗。按照另一個實施方案，重組MVA被用於將外源編碼序列導入到目標細胞中，所述序列與目標細胞的基因組同源或異源。
可以在體外將外源編碼序列導入到目標細胞中來製備蛋白質、多肽、肽、抗原或抗原表位。這種方法包括用本發明的重組MVA感染宿主細胞，在合適條件下培養被感染的宿主細胞，和分離和/或富集由所述宿主細胞生產的多肽、肽、蛋白質、抗原、表位和/或病毒。
而且，將一種或多種同源的或一種或多種異源序列導入細胞的方法可應用於體外和體內治療。例如，在體外治療中，按照本發明用重組MVA在先(離體(ex vivo))感染的分離細胞被施用給活動物機體來影響，優選誘導免疫反應。對於體內治療，按照本發明的重組痘病毒被直接施用到活動物機體中來影響，優選誘導免疫反應。在這種情況下，接種部位周圍的細胞以及病毒通過如血流轉運到達的細胞被按照本發明的重組MVA在體內直接感染。感染後，這些細胞合成治療性基因的蛋白質、肽或抗原表位，由外源編碼序列編碼並隨後將它們或其部分呈遞到細胞表面。免疫系統的特化細胞(specializedcell)識別這種異源蛋白、肽或表位的存在，並發動特異的免疫反應。
由於MVA是高度生長受限的，和極度減毒的，因此，其可以被用於治療廣大哺乳動物包括人，包括免疫受損的動物或人。本發明還提供用於在活動物機體包括人中誘導免疫反應的藥物組合物和疫苗。
藥物組合物通常包括一種或多種藥學上可接受的和/或允許的載體、添加劑、抗生素、防腐劑、佐劑、稀釋劑和/或穩定劑。這種輔助物質可以是水、鹽水、甘油、乙醇、潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的分子如蛋白質、多糖、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集物等。
對於疫苗製備，按照本發明的重組痘病毒被轉化為生理上可接受形式。這可以根據在製備用於免疫接種抵抗天花的痘病毒疫苗的經驗來進行(如Stickl，H.等， Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所描述)。例如純化的病毒以5×10E8 TCID50/ml的滴度配製在約10mM Tris，140mM NaCl pH7.4中，保存在-80℃。對於製備疫苗散粒(vaccine shot)，如病毒的10E2-10E8顆粒被凍幹在安瓿中的含有2％蛋白腖和1％人白蛋白的100ml磷酸緩衝液(PBS)中。可選擇地，疫苗散粒可以通過逐步冷凍乾燥製劑中的病毒來製備。這種製劑可以含有其他添加劑，例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他適合於體內施用的酸如抗氧化劑或惰性氣體、穩定劑或重組蛋白質(如人血清白蛋白)。然後將玻璃安瓿密封，可以在4℃和室溫之間保存數月。但是，只要不被使用，安瓿優選保存在低於-20℃溫度。
用於免疫接種或治療，凍乾物可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液中，優選在生理鹽水或Tris緩衝液中，系統地或局部地施用，即胃腸外、皮下、肌肉內，通過劃痕或技術人員知曉的其他施用路徑。施用的模式、劑量和次數可以由本領域技術人員以已知方式優化。但是，最常規的是在第一次免疫接種注射(shot)後約一個月到六周進行第二次注射免疫接種患者。
本發明還涉及質粒載體，其可以被用於製備本發明的重組MVA，還涉及一些DNA序列一般地，位於兩個鄰近ORF之間或者與兩個鄰近ORF側面連接的IGR包括其中可插入目標外源DNA序列的苷酸序列。相應地，本發明的質粒載體包含來源於MVA基因組或與MVA基因組同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含位於或側面連接於病毒基因組的兩個鄰近ORF之間的IGD序列的完整或部分片段。優選地，質粒載體包含在所述IGR來源序列的至少一個克隆位點插入目標外源DNA序列和，優選地，插入被連接到所述異源DNA序列的痘病毒轉錄控制元件。可選擇地，質粒載體包含報導和/或選擇基因表達盒。質粒載體優選還包含側面連接所述IGR序列的完整或部分片段的兩個鄰近ORF的序列。
已經確定了一些不包括核苷酸序列的IGR。在這種情況下，質粒載體包含IGR側翼序列(IGR flanking sequence)的DNA序列，即兩個鄰近ORF的DNA序列。優選地，用於插入異源DNA序列的克隆位點被插入到IGR中。IGR側翼序列的DNA被用於引導外源DNA序列插入到MVA基因組的相應IGR中。這種質粒載體還包括IGR序列的完整或部分片段，IGR序列包含用於插入異源DNA序列和可選擇地插入報導和/或選擇基因表達盒的克隆位點。
IGR-DNA序列以及兩個鄰近ORF序列的IGR側翼序列優選地分別從選自001L-002L、002L-003L、005R-006R、006L-007R、007R-008L、008L-009L、017L-018L、018L-019L、019L-020L、020L-021L、023L-024L、024L-025L、025L-026L、028R-029L、030L-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、036L-037L、037L-038L、039L-040L、043L-044L、044L-045L、046L-047R、049L-050L、050L-051L、051L-052R、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079R、080R-081R、081R-082L、082L-083R、085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、092R-093L、094L-095R、096R-097R、097R-098R、101R-102R、103R-104R、105L-106R、107R-108L、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、122R-123L、123L-124L、124L-125L、125L-126L、133R-134R、134R-135R、136L-137L、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、162R-163R、163R-164R、164R-165R、165R-166R、166R-167R、167R-168R、170R-171R、173R-174R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R、188R-189R、189R-190R、192R-193R的IGR和ORF中選擇。
更加優選地，這些序列從分別選自007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148L-149L的IGR和ORF中選擇。IGR來源的序列優選選自核苷酸序列-Seq ID No.32的527-608-Seq ID No.33的299-883-Seq ID No.34的339-852-Seq ID No.35的376-647-Seq ID No.36的597-855-Seq ID No.37的400-607。
與兩個鄰近ORF序列側面連接的IGR優選地選自核苷酸序列-Seq ID No.32的1-525和609-1190-Seq ID No.33的101-298和884-1198-Seq ID No.34的1-338和853-1200-Seq ID No.35的1-375和648-1200-Seq ID No.36的1-596和856-1200-Seq ID No.37的1-399和608-1081。
DNA序列優選來源於保藏在ECACC的保藏號為V00083008的MVA的基因組或與該基因組同源。
為了製備本發明的質粒載體，所述序列被分離並克隆到常規克隆載體上，如pBluescript(Stratagene)，其中這些序列位於將被插入到MVA基因組中的外源DNA的側面。可選擇地，這種質粒載體包含選擇或報導基因盒，由於所述表達盒中包括了重複序列，表達盒可以從最終的重組病毒中被刪除。
通過質粒載體將外源DNA序列導入MVA基因組的方法以及獲得重組MVA的方法是本領域技術人員熟知的，此外，可以從如下參考文獻中得到-「分子克隆實驗手冊」，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis編寫，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989描述如何進行常規分子生物學技術的技術和知識，如DNA克隆、RNA分離、western印跡分析、RT-PCR和PCR擴增技術。
-「病毒學方法手冊」，由Brian WJ Mahy和Hillar0 Kangro編寫，Academic Press，1996描述病毒的處理和加工技術；-「分子病毒學操作方法」，由AJ Davison和RM Elliott編寫，ThePractical Approach Series.IRL Press at Oxford University Press.Oxford 1993，第9章通過痘苗病毒載體表達基因；-「分子生物學常用方法」，出版者John Wiley和Son Inc.1998，第16章，第IV節採用痘苗病毒載體在哺乳動物細胞中表達蛋白質描述如何處理、加工和遺傳工程MVA的技術和知識。
本發明的MVA，優選為以保藏號V00083008保藏在ECACC的MVA，通過用本發明的質粒載體轉染細胞，用MVA感染被轉化的細胞，和接著鑑定、分離和，任選可選擇地純化本發明的MVA來製備。
本發明的DNA序列可以被用於鑑定或分離本發明的MVA或其衍生物和用本發明的MVA感染的細胞或個體。所述DNA序列例如被用於製備PCR引物、雜交探針或被用於陣列技術。


附圖1載體構建體BNX39(附圖1a)、pBNX70(附圖1b)和pBN84(附圖1c)的限制性酶切圖，包含與位於I4L ORF後的插入位點側面連接的約600bp的MVA序列。所述質粒在側翼序列Flank 1(F1 I4L-I5L)和Flank 2(F2 I4L-I5L)之間還包含在痘病毒啟動子P)轉錄調控下的外源DNA(分別為Ecogpt和hBFP)。Flrpt鏈是Flank 1的重複序列，以便從生成的重組病毒上刪除報導表達盒。pBN84(附圖1c)還編碼登革病毒NS1蛋白(NS1 DEN)。其他縮寫AmpR＝氨苄青黴素抗性基因；bps＝鹼基對。
附圖2載體構建體BNX51(附圖2a)、pBNX67(附圖2b)和pBN27(附圖2c)的限制性酶切圖，包含與位於ORF 137L後的插入位點側面連接的約600bp的MVA序列(Flank 1F1136-137對應於MVA基因組的129340-129930；Flank 2F2136-137對應於MVA基因組的129931-130540)。此外，載體pBNX67(附圖2b)在側翼序列之間包含受痘病毒啟動子P)轉錄調控下的外源DNA(NPT II基因＝新黴素抗性)。F2rpt鏈是Flank 2的重複序列，以從生成的重組病毒中刪除報導表達盒。pBN27(附圖2c)還編碼在痘病毒啟動子調控下的登革病毒PrM4。其他縮寫AmpR＝氨苄青黴素抗性基因；bps＝鹼基對；IRES內部核糖體進入位點；EGFP＝增強綠色螢光蛋白基因。
附圖3載體構建體pBNX79(附圖3a)、pBNX86(附圖3b)、pBNX88(附圖3c)、pBN34(附圖3d)和pBN56(附圖3e)的限制性酶切圖，包含與位於ORF007R和008L之間的插入位點側面連接的約600bp的MVA序列(Flank 1F1IGR 07-08起始於MVA基因組的12200；Flank 2F2 IGR 07-08終止於MVA基因組的13400)。F2rpt鏈為Flank 2的重複序列，以從生成的重組病毒上刪除報導表達盒。另外載體pBNX88(附圖3c)和pBNX86(附圖3b)在側翼序列之間包含受痘病毒啟動子P)調控的外源DNA(分別是BFP+gpt和NPTII+EGFP)。F2rpt鏈是Flank 2的重複序列，以從生成的重組病毒上刪除報導表達盒。PBN56(附圖3e)還編碼HIV-1 env蛋白，而pBN34(附圖3d)含有在痘病毒調控下的登革病毒PrM2編碼序列。其他縮寫AmpR＝氨苄青黴素抗性基因；bps＝鹼基對。
附圖4載體構建體pBNX80(附圖4a)、pBNX87(附圖4b)和pBN47(附圖4c)的限制性酶切圖，包含與位於ORF 044L和045L之間的插入位點側面連接的600/640bp的MVA序列(Flank 1F1 IGR44-45起始於MVA基因組的36730；Flank 2F2 IGR44-45終止於MVA基因組的37970)。此外，載體pBNX87(附圖4b)在側翼序列之間包含受痘病毒啟動子P)轉錄調控的外源DNA(NPTII基因+EGFP)。F2rpt鏈為Flank 2的重複序列，以從生成的重組病毒上刪除報導表達盒。PBN47(附圖4c)還編碼受痘病毒啟動子調控的登革病毒PrM3。其他縮寫AmpR＝氨苄青黴素抗性基因；bps＝鹼基對。
附圖5載體構建體pBNX90(附圖5a)、pBNX92(附圖5b)和pBN54(附圖5c)的限制性酶切圖，包含與位於ORF 148R和149L之間的插入位點側面連接的596/604的MVA序列(Flank 1F1 IGR148-149起始於MVA基因組的136900；Flank 2F2 IGR148-149終止於MVA基因組的138100)。此外，載體pBNX92(附圖5b)在側翼序列之間包含受痘病毒啟動子P)轉錄調控的外源DNA(gpt+BFP)。PBN54(附圖5c)還編碼登革病毒PrM1。F2rpt鏈為Flank 2的重複序列，以從生成的重組病毒上刪除報導表達盒。其他縮寫AmpR＝氨苄青黴素抗性基因；bps＝鹼基對。
附圖6MVA(Genbank Ac.U94848)的整合插入位點的示意圖。
附圖7重組MVA中的IGR I4L-I5L的PCR分析，在IGR I4L-I5L中插入登革NS1。泳道「BN」表示使用MVA-BN空載體的PCR產物。使用NS1重組MVA，較大的片段是可檢測的(1、2、3、4不同濃度DNA)。M＝分子量標記，H2O水陰性對照。
附圖8附圖8aPCR分析重組MVA中的IGR 136-137，在IGR 136-137中插入登革病毒PrM4。泳道「BN」表示採用MVA-BN空載體的PCR產物。使用PrM4重組MVA，較大片段是可檢測的(mBN23，1/10，1/100不同濃度DNA)。M＝分子量標記，H2O＝水陰性對照，pBN27＝質粒陽性對照。
附圖8bMVA-BN空載體和在IGR 136-137中插入PrM4的重組MVA(MVA-mBN23)的多步生長曲線。
附圖9附圖9aPCR分析重組MVA中的IGR 07-08，在IGR 07-08中插入登革PrM2。泳道3表示採用MVA-BN空載體的PCR產物。使用PrM2重組MVA，較大片段是可檢測的(泳道2)。M＝分子量標記，泳道1＝水陰性對照。
附圖9bMVA-BN空載體和在IGR 07-08中插入PrM2的重組MVA(MVA-mBN25)的多步生長曲線。
附圖10PCR分析重組MVA中的IGR 07-08，在IGR 07-08中插入HIVenv。泳道BN表示採用MVA-BN空載體的PCR產物。使用PrM2重組MVA，較大片段是可檢測的(泳道1、2、3)。M＝分子量標記，-＝水陰性對照，+＝質粒陽性對照。
附圖11附圖11aPCR分析重組MVA中的IGR 44-45，在IGR 44-45中插入登革病毒PrM3。泳道BN表示採用MVA-BN空載體的PCR產物。使用PrM3重組MVA，較大片段是可檢測的(泳道1-4，不同濃度DNA)。M＝分子量標記，-＝水陰性對照。
附圖11bMVA-BN空載體和在IGR 44-45中插入PrM3的重組MVA(MVA-mBN28)的多步生長曲線。
附圖12附圖12aPCR分析重組MVA中的IGR 148-149，在IGR 148-149中插入登革病毒PrM1。泳道BN表示採用MVA-BN空載體的PCR產物。使用PrM1重組MVA，較大片段是可檢測的(泳道1)。M＝分子量標記，-＝水陰性對照，+＝質粒陽性對照。
附圖12bMVA-BN空載體和在IGR 44-45中插入PrM1的重組MVA(MVA-mBN33)的多步生長曲線。
如下實施例將進一步闡明本發明。任何一位本領域技術人員將能夠理解，所提供的實施例決不被解釋為在某種程度上將本發明限制在這些實施例中。本發明的保護範圍僅僅由附隨的權利要求書的全部保護範圍來限定。
實施例1插入載體pBNX39、pBNX70和pBN84為了將外源序列插入到鄰近MVA的065L ORF的基因間隔區(插入位點在基因組的56760)，構建包含鄰近於該插入位點的約1200bp的側翼序列的載體。這些側翼序列被分成兩個側翼(flank)，在一個側翼上包含約610bp的065L ORF(另一種命名I4L ORF)和在另一個上包含065L ORF後的約580bp的基因間隔區以及最近的ORF的部分。在這些側翼序列之間，Ecogpt基因(從大腸桿菌中分離的磷酸核糖轉移酶基因的gpt鏈)和BFP(藍色螢光蛋白)分別位於痘病毒啟動子的轉錄調控之下。此外，至少有一個用於插入其他基因或序列的克隆位點被插入到I4L ORF後的基因間隔區。按照本發明的示例性載體構建體被公開在附圖1a)和b)中(pBNX39，pBNX70)。在載體pBN84(附圖1c)中，登革病毒NS1的編碼序列被插入到pBNX70的克隆位點上(附圖1b)。
通過同源重組製備重組MVA外源基因可以通過同源重組被插入到MVA基因組中。為了將目的外源基因克隆到質粒載體中，如上所述。該載體被轉染到MVA感染的細胞中。在被感染和被轉染的細胞的細胞質中發生重組。藉助插入載體中還含有的選擇和/或報導表達盒，包括重組病毒的細胞被鑑定和分離。
為同源重組，BHK(幼年倉鼠腎)細胞或CEF(原始雞胚成纖維細胞)被種植在6孔平板中，使用DMEM(Dulbecco′s Modified Eagles Medium，GibcoBRL)+10％胎牛血清(FCS)或VP-SFM(Gibco BRL)+4mmol/l L-穀氨醯胺用於無血清製備過程。
細胞需要仍處於生長階段並且在轉染當天達到60-80％匯合。細胞在植入之前計數，獲知細胞數量決定感染複數(moi)。
用於感染，MVA母液在DMEM/FCS或VP-SFM/L-穀氨醯胺中被稀釋，使得500μl的稀釋液中含有大約產生0.1-1.0moi的病毒含量。假定細胞在植入後分裂一次。去除培養液，細胞用500μl稀釋的病毒感染1h，在室溫下旋轉。去除接種物，用DMEM/VP-SFM洗滌細胞。被感染的細胞分別溶解在1.6ml DMEM/FCS和VP-SFM/L-穀氨醯胺中，而開始轉染反應(QiagenEffectene Kit)。
對於轉染，使用″Effectene″轉染試劑盒(Qiagen)。轉染混合物用1-2μg線性化插入載體(多次轉染的總量)與緩衝液EC製備，最終體積為100μl。加入3.2μl Enhancer，搖晃並在室溫下溫育5min。然後，在搖晃母液管後加入10μlEffectene通過搖晃和在室溫下溫育10min來充分混合溶液。分別加入600μlDMEM/FCS和VP-SFM/L-穀氨醯胺，混合，接著將全部轉染混合液加入到細胞中，這些細胞已經浸沒在培養液中。輕輕地搖動培養皿來混合轉染反應液。在37℃、5％CO2中培養過夜。第二天，去除培養液，用鮮新的DMEM/FCS或VP-SFM/L-穀氨醯胺替換。繼續培養直到第3天。
回收時，細胞被刮到培養液中，然後將細胞懸浮液轉移到適當試管中，凍存在-20℃以短期保存或者在-80℃長期保存。
在MVA的I4L插入位點插入Ecogpt在第一輪中，細胞用MVA按照上述方案感染，並且另外用含有作為報導基因的Ecogpt基因(Ecogpt或者被切短為gpt磷酸核糖轉移酶基因的鏈)的插入載體pBNX39(附圖1a)轉染。生成的重組病毒通過三輪噬斑純化來純化，在磷酸核糖轉移酶代謝選擇條件下加入黴酚酸、黃嘌呤和次黃嘌呤。黴酚酸(MPA)抑制的次黃苷單磷酸脫氫酶，並導致嘌呤合成中斷和大部分細胞系中病毒複製被抑制。這種中斷可以通過由組成型啟動子表達Ecogpt並提供底物黃嘌呤和次黃嘌呤來克服。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增預期插入位點的引物對。為了擴增I4L插入位點，使用引物對BN499(CAA CTC TCTTCT TGA TTA CC，SEQ ID NO1)和BN500(CGA TCAAAG TCA ATC TAT G，SEQ ID NO2)。當空載體病毒MVA被擴增的情況下，期望的PCR片段長為328個核苷酸(nt)，在重組MVA被擴增的情況下，片段相應地被擴大，重組MVA在I4L插入位點上具有併入的外源DNA。
在MVA的IGR064L-065L(I4L-I5L)插入位點上插入NS1在第一輪中，按照上述操作用MVA感染細胞，並再用含有用於選擇的Ecogpt基因和作為報導基因的BFP(藍色螢光蛋白)的插入載體pBN84(附圖1c)轉染。生成的重組病毒通過七輪噬斑純化來純化，在磷酸核糖轉移酶代謝選擇條件下加入黴酚酸、黃嘌呤和次黃嘌呤。黴酚酸(MPA)抑制的次黃苷單磷酸脫氫酶，並導致嘌呤合成中斷和大部分細胞系中病毒複製被抑制。這種中斷可以通過由組成型啟動子表達Ecogpt並提供底物黃嘌呤和次黃嘌呤來克服。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增預期插入位點的引物對。為了擴增I4L插入位點，使用引物對BN499(CAA CTC TCTTCT TGA TTA CC，SEQ ID NO1)和BN500(CGA TCAAAG TCA ATC TAT G，SEQ ID NO2)。當空載體病毒MVA被擴增的情況下，期望的PCR片段長為328個核苷酸(nt)，在NS1的重組MVA被擴增的情況下，重組MVA在I4L插入位點上具有併入的登革病毒NS1編碼區，片段預期為1683bp。附圖7中的PCR結果清楚表明在17輪病毒擴增後，NS1穩定地插入I4L插入位點。
體外檢測包括NS1的recMVA(MVA-BN22)T25燒瓶裝有的約80％匯合的單層BHK細胞與100μl在具有1％FCS的MEMα中稀釋到1×107的病毒母液培養，在室溫下旋轉30min。在各個燒瓶中加入5ml具有3％FCS的MEMα，在CO2培養箱中、30℃培養。48h後回收燒瓶。從燒瓶中取出上清液，在4℃下以260g旋轉10min。上清液以等分試樣保存在-80℃。沉澱用5ml 1xPBS洗滌兩次，然後再懸浮在1ml含有1％ TX100的低滲douncing緩衝液中。回收細胞溶解產物，並以16,000g旋轉5min，上清液在-80℃保存在微型離心管中。
培養了包括GFP的MVA、缺失位點上包括NS1基因的MVA(MVA-BN07)的燒瓶，以及模擬被感染的燒瓶也用上面描述的相同方法來處理。
細胞/病毒溶解產物和上清液在不加熱/加熱條件下，在非還原/還原樣本緩衝液中處理。在10％ SDS PAGE上分離蛋白質，並轉移到硝化纖維膜上。斑點是用收集的康復期的患者血清(PPCS)以1∶500稀釋後探查過夜。在用1XPBS洗滌3次後，斑點用抗人IgG-HRP(DAKO)在室溫溫育2h。在如前面描述洗滌斑點之後，用4氯-1-萘酚顯色。
Western印跡結果表明，MVA-BN22中的NS1被大量表達。NS1以正確的構象被表達，在不加熱條件下作為二聚體，在加熱條件下為單體。
在MVA-BN22和MVA-BN07中比較NS1的表達。BHK細胞用相同pru培養，在48h後回收。結果表明BN22中NS1的表達大大地高於BN07。Western印跡結果還表明與BN07相比，在BN22構建體的上清液中有更多被分泌的NS1。
這些結果還表明在用BN22感染的細胞中表達的NS1具有抗原性，被收集的康復期的患者血清識別。
結果，NS1在用BN22感染的BHK細胞中大量地並且以正確構象表達。二聚體和單體都具有抗原性，並被收集的康復期的患者血清識別。
實施例2插入載體pBNX67和pBN27與ORF 136L和137L之間的新插入位點(基因組的129940位置)鄰近的MVA序列通過目標序列的標準PCR擴增方法分離，採用如下引物oBN543(TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT；SEQ IDNO3)和oBN544(TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT；SEQ IDNO4)來分離Flank 1；oBN578(CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC；SEQ ID NO5)和oBN579(CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG；SEQ ID NO6)分離Flank 2。
包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和XbaI處理，並連接到SacII/XbaI消化的脫磷酸基礎載體上，如pBluescript(Stratagene)。
生成的質粒用XhoI/ApaI消化，脫磷酸化，並連接到用Xhol/Apal消化的包含Flank 2的PCR片段上。
可選擇地，Flank 2的重複序列通過PCR分離，採用引物oBN545(CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC；SEQID NO7)和oBN546(CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT；SEQ IDNO8)，並用HindIII/PstI消化，被插入到生成的載體的HindIII/PstI位點上。附圖2a)表示該載體(pBNX51)。
包含合成的啟動子、NPT II基因(新黴素抗性)、poly-A區、IRES、EGFP基因(Ps-NPTII-polyA-IRES-EGFP)的報導基因表達盒用Ec1136II/XhoI消化，並被插入到插入載體的HindIII/XhoI位點上，其中HindIII位點用T4 DNA聚合酶(Roche)末端補平，按照本實施例的示例性載體的限制性酶切圖公開在附圖2b)中(pBNX67)。
為了構建pBN27(附圖2c)，血清4型的登革病毒PrM被插入到pBNX67的單個PacI位點上。
通過同源重組製備重組MVA載體pBNX67(附圖2b)可以被用於製備重組MVA，採用上述方法-例如採用pBN27(附圖2c)來同源重組，獲得在兩個鄰近ORF之間的基因間隔區中含有登革病毒PrM4的重組MVA。
將PrM4插入到MVA的IGR136-137插入位點上在第一輪中，細胞按照上面描述的方法用MVA感染，並且還用含有用於選擇的NPT基因和作為報導基因的EGFP(增強綠色螢光蛋白)的插入載體pBN27(附圖2c)轉染。得到的重組病毒通過G418選擇下四次噬菌斑純化來純化。
得到的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性擴增期望位點的引物對。為了擴增IGR136-137插入位點，採用引物對BN900(cgttcgcatgggttacctcc，SEQ ID NO9)和BN901(gacgcatgaaggctgaac，SEQ IDNO10)。當空載體病毒MVA的DNA被擴增的情況下，期望的PCR片段長度為88個核苷酸(nt)，當PrM4的重組MVA被擴增時，片段有望達到880bp，該重組MVA在IGR136-137插入位點上插入了登革病毒PrM4編碼序列。附圖8a)中的PCR結果清楚表明，在22輪病毒擴增後，在IGR136-137插入位點上穩定地插入了PrM4。重組MVA還具有與MVA-BN相同的生長特徵。這種病毒在雞胚成纖維細胞(CEF細胞)中複製，並在哺乳動物細胞中減毒地生長(附圖8b)。
實施例3插入載體pBNX79、pBNX86、pBNX88、pBN34和pBN56鄰近ORF 007R和008L的新插入位點(在基因組12800)的MVA序列通過標準PCR擴增目標序列來分離，採用如下引物IGR07/08 Flup(CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC；SEQ ID NO11)和IGR07/08 Flend(AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT；SEQ ID NO12)來分離Flank 1；IGR07/08 F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC；SEQ ID NO13)和IGR 07/08 F2end(CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG；SEQ ID NO14)來分離Flank 2。
包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI來處理，並被連接到用SacII/SacI消化和脫磷酸的基礎載體上，如pBluescript(Stratagene)。
得到的質粒用XhoI/ApaI消化，脫磷酸，並被連接到用XhoI/ApaI消化的含有Flank 2的PCR片段上。
可選擇地，Flank 2的重複序列通過PCR分離，採用引物IGR 07/08F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC；SEQ IDNO13)和IGR 07/08 F2mid(TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA；SEQID NO15)，並用BamHI/PstI消化，並插入到得到的載體的BamHI/PstI位點上。
任何包含報導或治療性基因的表達盒，具有如痘病毒啟動子、標記基因、poly-A區域和可選擇的IRES元件、其他基因，如表達治療活性物質或基因產物，該表達盒在限制性消化後用T4 DNA聚合酶(Roche)末端補平，並被插入到質粒載體的合適克隆位點上。按照本實施例的示例性限制性酶切圖公開在附圖3a)中(pBNX79)。插入NPT/EGFP選擇性表達盒得到載體pBNX86(附圖3b)，而插入gpt/BFP選擇性表達盒得到載體pBNX88(附圖3c)。鑑於治療性基因的表達單位包含治療性基因和被可操作地連接的啟動子，這種表達單位被插入到PacI位點上。為了構建pBN34(附圖3d)，登革病毒PrM2被克隆到pBNX88中(附圖3c)來合成pBN56(附圖3e)，HIV env編碼區被通過PacI克隆到pBNX86中(附圖3b)。
通過同源重組製備重組MVA載體pBNX86(附圖3b)和pBNX88(附圖3c)分別被用於製備重組MVA，採用上述的方法。採用pBN34(附圖3d)進行同源重組，得到在兩個鄰近ORF之間的基因間隔區中含有登革病毒PrM2的重組MVA。用MVA-BN基因組重組pBN56(附圖3e)得到重組MVA，其在相應的IGR中含有HIV env基因。
在MVA的IGR07-08插入位點中插入PrM2在第一輪中，細胞按照上面描述的方法用MVA感染，並且用含有用於選擇的gpt基因和作為報導基因的BFP的插入載體pBN34(附圖3d)轉染。生成的重組病毒如實施例1所描述在黴酚酸選擇下通過三輪噬菌斑純化來純化。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增期望插入位點的引物對。為了擴增IGR07-08插入位點，採用引物對BN902(ctggataaatacgaggacgtg，SEQ ID NO16)和BN903(gacaattatccgacgcaccg，SEQ IDNO17)。在擴增空載體病毒MVA的DNA情況下，預期的PCR片段的長度為190個核苷酸(nt)，當擴增PrM2的重組MVA時，片段有望達到950bp，該重組MVA在IGR07-08插入位點上插入了登革病毒PrM2、編碼區。附圖9a)中的PCR結果清楚表明，在20輪病毒擴增後，在IGR07-08插入位點上穩定地插入了PrM2。重組MVA還具有與MVA-BN相同的生長特性。其在雞胚成纖維細胞(CEF細胞)中複製，並在哺乳動物細胞中減毒生長(附圖9b)。
在MVA的IGR07-08插入位點上插入HIV env在第一輪中，細胞按照上述方法用MNA感染，並還用含有用於選擇的NPT基因和作為報導基因的EGFP的插入載體pBN56(附圖3e)轉染。生成的重組病毒在G418選擇下通過六輪噬菌斑純化來純化。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增期望插入位點的引物對。為了擴增IR07-08插入位點，採用引物對BN902(ctggataaatacgaggacgtg，SEQ ID NO16)和BN903(gacaattatccgacgcaccg，SEQID NO17)。在擴增空載體病毒MVA的DNA情況下，預期的PCR片段長度為190個核苷酸(nt)，當擴增env的重組MVA時，片段有望達到2.6kp，該重組MVA在IGR07-08插入位點上插入了HIV env編碼區。附圖10中的PCR結果清楚表明，在20輪病毒擴增後，在IGR07-08插入位點上穩定地插入了env。
實施例4插入載體pBNX80、pBNX87和pBN47鄰近ORF 044L和045L的新插入位點(在基因組37330)的MVA序列通過標準PCR擴增目標序列來分離，採用如下引物IGR44/45Flup(CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA；SEQ IDNO18)和IGR44/45Flend(AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG；SEQ IDNO19)來分離Flank 1；IGR44/45F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT；SEQ ID NO20)和IGR44/45F2end(CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT；SEQ ID NO21)來分離Flank 2。
包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI來處理，並被連接到用SacII/SacI消化和脫磷酸的基礎載體上，如pBluescript(Stratagene)。
得到的質粒用XhoI/ApaI消化，脫磷酸，並被連接到用XhoI/ApaI消化的含有Flank 2的PCR片段上。
可選擇地，Flank 2的重複序列通過PCR分離，採用引物IGR44/45F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT；SEQ ID NO20)和IGR44/45F2mid(TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG；SEQ IDNO22)，並用BamHI/PstI消化，並插入到得到的載體的BamHI/PstI位點上。
任何包含報導或治療性基因的表達盒，具有例如痘病毒啟動子、標記基因、poly-A區域和可選擇的IRES元件、其他基因，例如表達治療活性物質的基因或基因產物，這些表達盒在限制性消化後用T4 DNA聚合酶(Roche)末端補平，並被插入到質粒載體的合適克隆位點上。考慮到報導基因表達盒，Flank 2和Flank-2-重複序列之間的PstI、EcoRI、EcoRV、HindIII、Aval或XhoI限制性酶切位點優選作為克隆位點。為了構建pBNX87(附圖4b)，NPT/EGFP選擇表達盒被插入到pBNX80中(附圖4a)。
用於治療性基因的表達單位包含治療性基因和可操作地連接的啟動子，該表達單位被插入到PacI位點。
按照本實施例的示例性限制性酶切圖公開在附圖4a)和b)中(pBNX80，pBNX87)。
按照上面描述的方法，載體可以被用於製備在兩個鄰近ORF之間的基因間隔區中含有外源序列的重組MVA。為了構建pBN47(附圖4c)，登革病毒血清型3的PrM被克隆到pBNX87中(附圖4b)。
在MVA的IGR44-45插入位點中插入PrM3在第一輪中，細胞按照上面描述方法用MVA感染，並還用含有用於選擇的NPT基因和作為報導基因的EGFP的插入載體pBN57(附圖4c)轉染。生成的重組病毒在G418選擇下通過三輪噬菌斑純化來純化。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增期望插入位點的引物對。為了擴增IGR44-45插入位點，採用引物對BN904(cgttagacaacacaccgacgatgg，SEQ ID NO23)和BN905(cggatgaaaaatttttggaag，SEQ ID NO24)。在擴增空載體病毒MVA的DNA情況下，預期的PCR片段長度為185個核苷酸(nt)，當擴增PrM3的重組MVA時，片段有望達到850bp，該重組MVA在IGR44-45插入位點上插入了登革病毒PrM3編碼區。附圖11a)中的PCR結果清楚表明，在19輪病毒擴增後，在IGR44-45插入位點上穩定地插入了PrM3。重組MVA還具有與MVA-BN相同的生長特性。其在雞胚成纖維細胞(CEF細胞)中複製，並在哺乳動物細胞中減毒生長(附圖11b)。
實施例5插入載體pBNX90、pBNX92和pBN54鄰近ORF 148R和149L的新插入位點(在基因組137496的位置)的MVA序列通過標準PCR擴增目標序列來分離，採用如下引物IGR148/149Flup(TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG；SEQ IDNO25)和IGR148/149Flend(CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC；SEQ ID NO26)來分離Flank1；IGR148/149F2up(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC；SEQ ID NO27)和IGR148/149F2end(TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG；SEQ ID NO28)來分離Flank 2。
包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI來處理，並被連接到用SacII/SacI消化和脫磷酸的基礎載體上，如pBluescript(Stratagene)。
得到的質粒用HindIII/ApaI消化，脫磷酸，並被連接到用HindIII/ApaI消化的含有Flank 2的PCR片段上。
可選擇地，Flank 2的重複序列通過PCR分離，採用引物GR148/149F2up(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC；SEQ IDNO27)和IGR148/149F2mid(TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC；SEQID NO29)，並用BamHI/PstI消化，並插入到得到的載體的BamHI/PstI位點上。
任何包含報導或治療性基因的表達盒，具有例如痘病毒啟動子、標記基因、poly-A區域和可選擇的IRES元件、其他基因，如表達治療活性物質的基因或基因產物，該表達盒在限制性消化後用T4 DNA聚合酶(Roche)末端補平，並被插入到質粒載體的合適克隆位點上。為了構建pBNX92(附圖5b)，gpt/BFP表達盒被插入到該克隆位點上。考慮到報導基因表達盒，Flank 2和Flank-2-重複序列之間的PstI、EcoRI、EcoRV、HindIII限制性酶切位點優選作為克隆位點。治療性基因的表達單位包含治療性基因和被可操作地連接的啟動子，該表達單位被插入到PacI位點上。為了構建pBNX54(附圖5c)，登革病毒PrM1被插入到該PacI位點上。
按照本實施例的示例性載體構建體的限制性酶切圖被公開在附圖5a)和b)中(pBNX90，pBNX92)。
按照上面描述的方法，載體可以被用於製備在兩個鄰近ORF之間的基因間隔區中含有外源序列的重組MVA。為了製備表達登革病毒PrM1的重組MVA，pBN54(附圖5c)被用於同源重組。
在MVA的IGR148-149插入位點中插入PrM1在第一輪中，細胞按照上面描述方法用MVA感染，並還用含有用於選擇的gpt基因和作為報導基因的BFP的插入載體pBN54(附圖5c)轉染。生成的重組病毒在黴酚酸選擇下通過三輪噬菌斑純化來純化。
生成的重組病毒通過標準PCR分析來鑑定，採用選擇性地擴增期望插入位點的引物對。為了擴增IGR148-149插入位點，採用引物對BN960(ctgtataggtatgtcctctgcc，SEQ ID NO30)和BN961(gctagtagacgtggaaga，SEQ ID NO31)。在擴增空載體病毒MVA的DNA情況下，預期的PCR片段長度為450個核苷酸(nt)，當擴增PrM1的重組MVA時，片段有望達到1200bp，該重組MVA在IGR148-149插入位點上插入了登革病毒PrM1編碼區。附圖12a)中的PCR結果清楚表明，在23輪病毒擴增後，在IGR148-149插入位點上穩定地插入了PrM1。重組MVA還具有與MVA-BN相同的生長特性。其在雞胚成纖維細胞(CEF細胞)中複製，並在哺乳動物細胞中減毒生長(附圖12b)。

關於微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
表格bp/4(只此一頁)
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格

1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
表格BP/4(第1頁)
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
分析試驗的證書產物描述 MVA-575保藏號00120707


批准人＿＿ECACC質量主管日期 ＿＿＿＿
分析試驗的證書產物描述 MVA-575保藏號00120707


批准人＿＿ECACC質量主管日期 ＿＿＿＿

關於微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
Orm sp/4(只此一頁)
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
BP/4表格(第一頁)
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
BP/9表格(第二頁和最後一頁)

關於微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
BP/4表格(只此一頁)
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
BP/9表格(第二頁和最後一頁)

關於微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
Bp/4表格(只此一頁)
分析試驗的證書產物描述 MVA-BN保藏號00083008


批准人＿＿ECACC質量主管日期 ＿＿＿＿
分析試驗的證書產物描述 MVA-BN保藏號00083008


批准人＿＿ECACC質量主管＿＿日期＿＿
序列表110巴法裡安諾迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)120改進的安卡拉痘苗病毒(MVA)基因組中作為插入位點的基因間隔區130BN45PCT150DK PA 2002 007521512002-05-1616037170PatentIn version 3.1210121120212DNA213引物4001caactctctt cttgattacc20210221119212DNA213引物4002cgatcaaagt caatctatg 19210321133212DNA213引物4003tccccgcgga gaggcgtaaa agttaaatta gat 33
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21126212DNA213引物40029tttctgcagt gtataatacc acgagc 262103021122212DNA213引物40030ctgtataggt atgtcctctg cc 222103121118212DNA213引物40031gctagtagac gtggaaga 18210322111192212DNA213痘苗病毒(vaccinia virus)220
221ORF C 64L片段222(1)..(526)223
220
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220
221ORF C 65L片段222(609)..(1190)223
40032caccttctat agatctgaga atggatgatt ctccagtcga aacatattct accatggatc60cgtttaattt gttgatgaag atggattcat ccttaaatgt tttctctgta atagtttcca 120ccgaaagact atgcaaagaa tttggaatgc gttccttgtg cttaatgttt ccatagacgg 180cttctagaag ttgatacaac ataggactag ccgcggtaac ttttattttt agaaagtatc 240catcgcttct atcttgttta gatttatttt tataaagttt agtctctcct tccaacataa 300taaaagtgga agtcatttga ctagataaac tatcagtaag ttttatagag atagacgaac 360aattagcgta ttgagaagca tttagtgtaa cgtattcgat acattttgca ttagatttac 420taatcgattt tgcatactct ataacacccg cacaagtctg tagagaatcg ctagatgcag 480taggtcttgg tgaagtttca actctcttct tgattacctt actcatgatt aaacctaaat 540aattgtactt tgtaatataa tgatatatat tttcacttta tctcatttga gaataaaaat 600gtttttgttt aaccactgca tgatgtacag atttcggaat cgcaaaccac cagtggtttt 660attttatcct tgtccaatgt gaattgaatg ggagcggatg cgggtttcgt acgtagatag 720tacattcccg tttttagacc gagactccat ccgtaaaaat gcatactcgt tagtttggaa 780taactcggat ctgctatatg gatattcata gattgacttt gatcgatgaa ggctcccctg 840tctgcagcca tttttatgat cgtcttttgt ggaatttccc aaatagtttt ataaactcgc 900ttaatatctt ctggaaggtt tgtattctga atggatccac catctgccat aatcctattc 960ttgatctcat cattccataa ttttctctcg gttaaaactc taaggagatg cggattaact 1020acttgaaatt ctccagacaa tactctccga gtgtaaatat tactggtata cggttccacc 1080gactcattat ttcccaaaat ttgagcagtt gatgcagtcg gcataggtgc caccaataaa 1140ctatttctaa gaccgtatgt tctgatttta tcttttagag gttcccaatt cc 1192210332111200212DNA213痘苗病毒220
221ORF 135R片段222(1)..(96)223
220
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220
221IGR 136-137222(299)..(883)223
220
221ORF C 137L片段222(884)..(1198)223
40033agaggcgtaa aagttaaatt agatttcgaa cgaaggcctc cttcgtttta taaaccatta60gataaagttg atctcaaacc gtcttttctg gtgtaatatt ctagtttggt agtagataca 120tatcaatatc atcaaattcg agatccgaat tataaaatgg gcgtggattg ttaactatag 180aatcggacgt ctgatattcg aaaatctgtg gagttttagg ttttggtgga ggtgtaactg 240ctacttggga tactgaagtc tgatattcag aaagctgggg gatgttctgg ttcgacatcc 300accgatggtg tcacatcact aatcggttcg gtaacgtctg tggacgatgg aggcaccact 360tctacaggtt ctggttcttt atcctcagtc atcaacggag ctacttcaat gcgaggaaat 420gtataatttg gtaatggttt ctcatgtgga tctgaagaag aggtaagata tctactagaa 480agataccgat cacgttctag ttctcttttg tagaacttaa ctttttcttt ctccgcatct 540agttgatatt ccaacctctt cacgttcgca tgggttacct ccgcagtttt tacgagcgat 600ttcacgttca gccttcatgc gtcttatagc atgaattcgc ttatcgttat cgggtttagc 660ttctgtcacc ttagcaattc cttttttatt aaactctaca taatcatatc catttctatt 720gtttgttcta atataaacga gtatagcatc attgctaaat ttttcaatag tatcgaaaac 780agaatatcct aaaccatata atatatattc aggaacactc aaactaaatg tccaggattc 840tcctaaatac gtaaacttta atagtgcgaa atcattcaaa aatctaccac ttatagatag 900atagatagta cataaatgcg tatagtagtc tacctatctc tttattatga aaaccggcat 960tacgatcata tatgtcgtga tatacctgtg atccgtttac gttaaaccat aaatacatgg 1020gtgatcctat aaacatgaat ttatttctaa ttctcagagc tatagttaat tgaccgtgta 1080atatttgctt acatgcatac ttgatacgat cattaataag atttttatca ttgctcgtta 1140tttcagaatc gtatatataa ggagtaccat cgtgattctt accagatatt atacaaaata 1200
210342111200212DNA213痘苗病毒220
221ORF 07R片段222(1)..(338)223
220
221IGR 07-08222(339)..(852)223
220
221ORF C 08L片段222(853)..(1200)223
40034aataaaaaaa agttttacta atttaaaatt atttacattt ttttcactgt ttagtcgcgg60atatggaatt cgatcctgcc aaaatcaata catcatctat agatcatgta acaatattac 120aatacataga tgaaccaaat gatataagac taacagtatg cattatcaca aaaataaatc 180cacatttggc taatcaattt cgggcttgga aaaaacgtat cgccggaagg gactatatga 240ctaacttatc tagagataca ggaatacaac aatcaaaact tactgaaact gtcaaaaaaa 300tagaaacata tatggtctat atatacacta caatttagtt attaattgga taaccgatgt 360gattatcaat caatattaag aaggttggta aattggtaca tagctaataa tacctataca 420cccaataata caacaaccat ttctgagttg gatatcatca aaatactgga taaatacgag 480gacgtgtata gagtaagtaa agaaaaagaa tgtgaaattt gctatgaagt tgtttactca 540aaacgataga tactttggtt tattggattc gtgtaatcat atattttgca taacatgcat 600caatatatgg catagaacac gaagagaaac cggtgcgtcg gataattgtc ctatatgtcg 660tacccgtttt agaaacataa caatgagcaa gttaactaat aaataaaaag tttaatttgt 720tgacgacgta tgtcgttatt ttttctcgta taaaagatta atttgattct aatataatct 780ttagtattgg ataaatatca attcaaatta attccattag attatatcat aaataaaaat 840agtagcacgc actacttcag ccaaatattc ttttttgaaa cgccatctat cgtagtgagg 900
acacaagtga acctataatg agcaaattta ttagtatcgg ttacatgaag gactttacgt 960agagtggtga ttccactatc tgtggtacga acggtttcat cttctttgat gccatcaccc 1020agatgttcta taaacttggt atcctttgcc aaccaataca tatagctaaa ctcaggcata 1080tgttccacac atcctgaaca atgaaattct ccagaagatg ttacaatgtc tagatttgga 1140catttggttt caaccgcgtt aacatatgag tgaacacacc catacatgaa agcgatgaga 1200210352111200212DNA213痘苗病毒220
221ORF C 44L片段222(1)..(375)223
220
221IGR 44-45222(376)..(647)223
220
221ORF C 45L片段222(648)..(1200)223
40035atttcttagc tagagtgata atttcgttaa aacattcaaa tgttgttaaa tgatcggatc60taaaatccat attttctggt agtgtttcta ccagcctaca ttttgctccc gcaggtaccg 120gtgcaaatgg ccacatttag ttaacataaa aacttataca tcctgttcta tcaacgattc 180tagaatatca tcggctatat cgctaaaatt ttcatcaaag tcgacatcac aacctaactc 240agtcaatata ttaagaagtt ccatgatgtc atcttcgtct atttctatat ccgtatccat 300tgtagattgt tgaccgatta tcgagtttaa atcattacta atactcaatc cttcagaata 360caatctgtgt ttcattgtaa atttataggc ggtgtattta agttggtaga ttttcaatta 420tgtatcaata tagcaacagt agttcttgct cctccttgat tctagcatcc tcttcattat 480tttcttctac gtacataaac atgtccaata cgttagacaa cacaccgacg atggcggccg 540ccacagacac gaatatgact aaaccgatga ccatttaaaa acccctctct agctttcact 600
taaactgtat cgattattct tttagaacat gtataatata aaaacattat tctatttcga 660atttaggctt ccaaaaattt ttcatccgta aaccgataat aatatatata gacttgttaa 720tagtcggaat aaatagatta atgcttaaac tatcatcatc tccacgatta gagatacaat 780atttacattt tttttgctgt ttcgaaactt tatcaataca cgttaataca aacccaggaa 840ggagatattg aaactgaggc tgttgaaaat gaaacggtga atacaataat tcagataatg 900taaaatcatg attccgtatt ctgatgatat tagaactgct aatggatgtc gatggtatgt 960atctaggagt atctatttta acaaagcatc gatttgctaa tatacaatta tcattttgat 1020taattgttat tttattcata ttcttaaaag gtttcatatt tatcaattct tctacattaa 1080aaatttccat ttttaattta tgtagccccg caatactcct cattacgttt cattttttgt 1140ctataatatc cattttgttc atctcggtac atagattatc caattgagaa gcgcatttag 1200210362111200212DNA213痘苗病毒220
221ORF 148R片段222(1)..(596)223
220
221IGR 148-149222(597)..(855)223
220
221ORF C 149L片段222(856)..(1200)223
40036ctcatagatt atcgacgatt atactctgta ttagttctgt cggaggatgt gttatctcta60tagataatga cgtcaatggc aaaaatattc taacctttcc cattgatcat gctgtaatca 120tatccccact gagtaaatgt gtcgtagtta gcaagggtcc tacaaccata ttggttgtta 180aagcggatat acctagcaaa cgattggtaa catcgtttac aaacgacata ctgtatgtaa 240
acaatctatc actgattaat tattcgccgt tgtctgtatt cattattaga cgagttaccg 300actatttgga tagacacata tgcgatcaga tatttgcgaa taataagtgg tattccatta 360taaccatcga caataagcag tttcctattc catcaaactg tataggtatg tcctctgcca 420agtacataaa ttctagcatc gagcaagata ctttaataca tgtttgtaac ctcgagcatc 480cattcgactt agtatacaaa aaaatgcagt cgtacaattc tgtacctatc aaggaacaaa 540tattgtacgg tagaattgat aatataaata tgagcattag tatttctgtg gattaataga 600tttctagtat ggggatcatt aatcatctct aatctctaaa tacctcataa aacgaaaaaa 660aagctattat caaatactgt acggaatgga ttcattctct tctcttttta tgaaactctg 720ttgtatatct actgataaaa ctggaagcaa aaaatctgat aaaaagaata agaataagat 780caaggattat tataaaataa caatagttcc tggttcctct tccacgtcta ctagctcgtg 840gtattataca catgcctagt aatagtctct ttgcgttgac ggaaagcaga ctagaaataa 900caggctaaaa tgttcagaca ccataatagt tcccaaccca gataataaca gagtaccatc 960aacacattcc tttaaactca atcccaaacc caaaaccgtt aaaatgtatc cggccaattg 1020atagtagata atgaggtgta cagcgcatga tgatttacac agtaaccaaa atgaaaatac 1080tttagtaatt ataagaaata tagatggtaa cgtcatcatc aacaatccaa taatatgccg 1140gagagtaaac attgacggat aaaacaaaaa tgctccgcat aactctatca tggcaataac 1200210372111200212DNA213痘苗病毒220
221ORF 018L片段222(1)..(399)223
220
221IGR 018L-019L222(400)..(607)223
220
221ORF C 019L片段222(608)..(1081)223
220
221非編碼區222(1082)..(1200)223
40037ggatgagtag ttttcttctt taactttata ctttttacta atcatattta gactgatgta60tgggtaatag tgtttaaaga gttcgttctc atcatcagaa taaatcaata tctctgtttt 120tttgttatac agatgtatta cagcctcata tattacgtaa tagaacgtgt catctacctt 180attaactttc accgcatagt tgtttgcaaa tacggttaat cctttgacct cgtcgatttc 240cgaccaatct gggcgtataa tgaatctaaa ctttaatttc ttgtaatcat tcgaaataat 300ttttagtttg catccgtagt tatccccttt atgtaactgt aaatttctca acgcgatatc 360tccattaata atgatgtcga attcgtgctg tatacccata ctgaatggat gaacgaatac 420cgacggcgtt aatagtaatt tactttttca tctttacata ttgggtacta gttttactat 480cataagttta taaattccac aagctactat ggaataagcc aaccatctta gtataacaca 540catgtcttaa agtttattaa ttaattacat gttgttttat atatcgctac gaatttaaac 600agagaaatca gtttaggaaa aaaaaatatc tatctacatc atcacgtctc tgtattctac 660gatagagtgc tactttaaga tgagacatat ccgtgtcatc aaaaatatac tccattaaaa 720tgattattcc ggcagcgaac ttgatattgg atatatcaca acctttgtta atatctacga 780caatagacag cagtcccatg gttccataaa cagtgagttt atctttcttt gaagagatat 840tttgtagaga tcttataaaa ctgtcgaatg acatcgcatt tatatcttta gctaaatcgt 900atatgttacc atcgtaatat ctaaccgcgt ctatcttaaa cgtttccatc gctttaaaga 960cgtttccgat agatggtctc atttcatcag tcatactgag ccaacaaata taatcgtgta 1020taacatcttt gatagaatca gactctaaag aaaacgaatc ggctttatta tacgcattca 1080tgataaactt aatgaaaaat gtttttcgtt gtttaagttg gatgaatagt atgtcttaat 1140aattgttatt atttcattaa ttaatattta gtaacgagta cactctataa aaacgagaat 1200
權利要求
1.改進的重組安卡拉痘病毒(MVA)，包含被插入到該病毒基因組的基因間隔區(IGR)的異源DNA序列。
2.按照權利要求1的MVA，其中異源DNA序列被插入到選自包含007R-008L，018L-019L，044L-045L，064L-065L，136L-137L，148R-149L的組的兩個鄰近的開放閱讀框(ORF)之間的IGR中。
3.按照權利要求1或2的MVA，其中異源DNA序列包含至少一個編碼序列，優選在痘病毒轉錄調控元件的轉錄控制下。
4.按照權利要求1-3中任一項的MVA，其中異源DNA序列編碼一種或多種蛋白質、多肽、肽、外源抗原或抗原表位。
5.按照權利要求1-4中任一項的MVA，其中異源DNA序列來源於登革病毒、日本腦炎病毒、B肝病毒或C肝病毒和/或免疫缺陷病毒，優選人免疫缺陷病毒HIV。
6.按照權利要求5的MVA，其中來源於登革病毒的異源DNA序列選自包含NS1和PrM的組。
7.按照權利要求6的MVA，其中NS1基因被插入到ORF 064L-065L之間的IGR中。
8.按照權利要求6或7的MVA，其中PrM基因來源於4種登革病毒血清型中的一個或多個登革病毒血清型。
9.按照權利要求6-8中任一項的MVA，其中PrM基因被插入到選自包含007R-008L，044L-045L，136L-137L，148R-149L的組的ORF之間的IGR中。
10.按照權利要求5的MVA，其中來源於免疫缺陷病毒的異源DNA序列編碼HIV env。
11.按照權利要求10的MVA，其中HIV env基因被插入到ORF007R-008L之間的IGR中。
12.按照權利要求1-11中任一項的MVA為以保藏號V00083008保藏在ECACC的MVA。
13.用作治療劑和/或疫苗的按照權利要求1-12的MVA。
14.按照權利要求1-13中任一項的MVA在製備用於治療和/或預防病毒感染和/或增生性疾病的治療劑和/或疫苗中的用途。
15.按照權利要求14的用途，所述藥物和/或疫苗用於治療或預防登革病毒感染或免疫缺陷病毒感染，優選HIV感染。
16.包含按照權利要求1-13中任一項的MVA的疫苗。
17.一種藥物組合物，其包含按照權利要求1-13中任一項的MVA和藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和/或添加劑。
18.用於在包括人的活動物機體中影響，優選誘導，免疫應答的方法，包含將按照權利要求1-13之一的MVA、按照權利要求16的疫苗和/或按照權利要求17的組合物施用給需要這種應答的動物包括人。
19.一種體外製備蛋白質、多肽、肽、抗原或表位的方法，包括步驟-用按照權利要求1-13之一的重組MVA感染宿主細胞，-在合適條件下培養被感染的宿主細胞，-分離和/或富集多肽、蛋白質、肽、抗原、表位和/或由所述宿主細胞生產的病毒。
20.體外將DNA序列導入細胞的方法，所述DNA序列與所述細胞的基因組同源和/或異源，其中該細胞用按照權利要求1-13之一的MVA感染。
21.離體將將DNA序列導入細胞的方法，所述DNA序列與所述細胞的基因組同源和/或異源，其中該細胞用按照權利要求1-13之一的MVA感染，和其中被感染的細胞隨後被施用給活動物機體，包括人。
22.將DNA序列導入活動物機體包括人的方法，所述DNA序列與所述動物機體的基因組同源和/或異源，將按照權利要求1-13之一的MVA，按照權利要求16的疫苗和/或按照權利要求17的組合物施用給動物，包括人。
23.包含按照權利要求1-13之一的MVA的細胞。
24.一種質粒載體，包含來源於MVA基因組的DNA序列或與MVA基因組同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含位於病毒基因組的兩個鄰近ORF之間IGR序列的完整或部分片段，以及被插入到所述IGR序列的克隆位點，該克隆位點用於插入MVA基因組的異源DNA序列和可選擇地插入報導基因和/或選擇基因表達盒。
25.一種質粒載體，其包含來源於MVA基因組的DNA序列或與MVA基因組同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含兩個鄰近ORF的IGR側翼序列，以及被插入到所述IGR的克隆位點，該克隆位點用於插入與MVA基因組異源的DNA序列和可選擇地插入報導基因和/或選擇基因表達盒。
26.按照權利要求25的質粒載體，其中所述DNA序列包含IGR序列的完整或部分片段，所述IGR序列包含用於插入異源DNA序列和可選擇地插入報導和/或選擇基因表達盒的克隆位點。
27.按照權利要求24-26中任一項的質粒載體，其中IGR序列來源於如下ORF之間的IGR，所述的ORF選自包含007R-008L，018L-019L，044L-045L，064L-065L，136L-137L，148R-149L的組。
28.按照權利要求24-27的質粒載體，其中IGR來源的序列包含從由核苷酸序列-Seq ID No.32的527-608；-Seq ID No.33的299-883；-Seq ID No.34的339-852；-Seq ID No.35的376-647；-Seq ID No.36的597-855；-Seq ID No.37的400-607構成的組選擇的序列。
29.按照權利要求24-28中任一項的質粒載體，其中兩個鄰近ORF的IGR側翼序列選自包含007R-008L，018L-019L，044L-045L，064L-065L，136L-137L，148R-149L的組。
30.按照權利要求24-29中任一項的質粒載體，其中兩個鄰近ORF的IGR側翼序列包含從由核苷酸序列-Seq ID No.32的1-525和609-1190；-Seq ID No.33的101-298和884-1198；-Seq ID No.34的1-338和853-1200；-Seq ID No.35的1-375和648-1200；-Seq ID No.36的1-596和856-1200；-Seq ID No.37的1-399和608-1081構成的組選擇的序列。
31.按照權利要求24-30中任一項的質粒載體，其中DNA序列來源於保藏號為V00083008、保藏在ECACC的MVA的基因組，或者該DNA序列與該MVA的基因組同源。
32.一種製備按照權利要求1-13之一的MVA的方法，包含步驟-用按照權利要求24-31之一的質粒載體轉染細胞；-用MVA感染被轉染的細胞；-鑑定、分離和，可選擇地，純化按照權利要求1-13之一的MVA。
33.按照權利要求32的方法，其中細胞用以保藏號為V00083008、保藏在ECACC的MVA感染。
34.一種來源於MVA基因組或與該MVA基因組同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含位於該病毒基因組的兩個鄰近的ORF之間的IGR的完整或部分片段。
35.一種來源於MVA基因組或與該MVA基因組同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含與兩個鄰近的ORF序列側面連接的IGR。
36.按照權利要求35的DNA序列，其中所述DNA序列包含IGR序列的完整或部分片段。
37.按照權利要求34-36中任一項的DNA序列，其中與MVA基因組異源的外源DNA序列被插入到IGR中。
38.按照權利要求34-37中任一項的DNA序列，其中IGR序列來源於選自包含007R-008L，018L-019L，044L-045L，064L-065L，136L-137L，148R-149L的組的ORF之間的IGR。
39.按照權利要求34-38中任一項的DNA序列，其中IGR來源的序列包含選自由核苷酸序列-Seq ID No.32的527-608；-Seq ID No.33的299-883；-Seq ID No.34的339-852；-Seq ID No.35的376-647；-Seq ID No.36的597-855；-Seq ID No.37的400-607組成的組的序列。
40.按照權利要求34-39中任一項的DNA序列，其中兩個鄰近ORF的IGR側翼序列選自包含007R-008L，018L-019L，044L-045L，064L-065L，136L-137L，148R-149L的組。
41.按照權利要求34-40中任一項的DNA序列，其中兩個鄰近ORF的IGR側翼序列選自包含核苷酸序列-Seq ID No.32的1-525和609-1190；-Seq ID No.33的101-298和884-1198；-Seq ID No.34的1-338和853-1200；-Seq ID No.35的1-375和648-1200；-Seq ID No.36的1-596和856-1200；-Seq ID No.37的1-399和608-1081的組的序列。
42.按照權利要求34-41中任一項的DNA序列，其中DNA序列來源於以保藏號V00083008保藏在ECACC的MVA的基因組或該DNA序列與該基因組同源。
全文摘要
本發明涉及用於將外源基因整合到改進的安卡拉痘苗病毒(MVA)基因組上的新插入位點。本發明還提供質粒載體來將外源DNA插入到MVA基因組。此外，本發明提供作為治療劑或疫苗的重組MVA，其包含被插入到所述新插入位點的外源DNA序列。
文檔編號C12N15/863GK1653184SQ03811122
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月14日 優先權日2002年5月16日
發明者保羅·豪利, 桑賈·利勒 申請人:巴法裡安諾迪克有限公司