一種低分子量肝素的製備方法

2023-04-29 02:41:16 2

專利名稱：：一種低分子量肝素的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種低分子量肝素的製備方法，尤其是利用非哺乳類魚類資源，採用改進酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法。
背景技術：
：凝血是參與維持哺乳動物正常止血的生理途徑，在血管受傷的情況下，凝血途徑受到激發而形成血凝塊，阻止血液損失，血管受傷發生後，血小板立即開始在受傷部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受傷血管也通過血管收縮來減少流經此區域的血流，而血纖維蛋白則開始凝集形成覆蓋破裂區域的不溶性網絡或凝塊。當凝血途徑傾向於過量凝結的不平衡狀態時，其結果是血栓趨勢的形成，通常表現為心臟病發作、中風、深靜脈血栓和急性冠狀動脈症候群，例如心肌梗死和不穩定型心絞痛。此外，血栓可以弓I發栓塞，並造成肺栓塞或包括中風或短暫缺血性發作在內的腦血管栓塞。目前與凝血途徑中的不平衡相關的病變的治療方法存在很多風險，必須進行謹慎的控制。肝素是一類具有抗凝性質的硫酸化的葡糖胺聚糖的名稱。肝素在醫學上廣泛用作醫用介入設備(invasivemedicalequipment)的塗層劑例如導管和植入體的塗層劑，以及治療劑和預防劑。此外，已經將肝素與體外循環血液透析一起使用，作為化療藥物和抗炎藥物的助劑，作為生長因子的調節劑，並且用於治療血液動力學紊亂(haemodynamoicdisorder)、先兆子癇(pre-eclampsia)、腸炎疾病(inflammatorboweldisease)、癌症(cancer)、靜脈血栓疾病(venousthromboembolic)、不穩定的冠脈局部缺血疾病(unstablecoronaryischemicdisease)和急性腦血管局部缺血(acutecerebravascularischemia)。肝素是天然的抗凝藥物，廣泛分布在哺乳動物的肝、肺、心、脾、腎、胸腺、腸黏膜、肌肉和血液中，多與蛋白質結合成複合物存在，這種複合物無抗凝活性，隨著蛋白質去除而活性增加。各種組織中肝素的含量與肥大細胞的數目有關，肥大細胞內的顆粒含有肝素或肝素前體，當物理或化學的刺激使肥大細胞脫顆粒時，肝素被釋放出來，在體內被肝素酶滅或而通過尿液排洩出去。肝素具有聚合結構，因而肝素組合物通常包含分子量通常為5kDa至40kDa的肝素(例如參見Mulloyetal.,Thromb.Haemost.841052-1056(2000))ο分子量範圍如此廣的肝素通常是指未分級肝素(unfractionatedheparin,UFH)。低分子肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)是由未分級肝素經化學或酶解聚的方法得到的低相對分子量(Mr)的肝素片段或經分級得到的低Mr肝素組分，Mr範圍一般為3000-8000，平均Mr為5000左右。低分子肝素的抗凝血酶FIIa活性遠低於其抗Xa因子的活性。LMWH具有抗凝血、抗血栓、調血脂、抗腫瘤等作用，與UHl相比具有以下幾個優點它更好地被吸收，並且可以進行皮下給藥；在血流中保留更長的時間；具有更可預測的臨床響應；可能引起更少的與UFH有關的不利副作用例如出血過多、血小板數量偏低、骨質疏鬆和刺激注射部位。低分子肝素可從肝素直接分離，或把肝素降解後再純化得到。分離方法包括有機溶劑分級沉澱法、凝膠色譜法、親和色譜法、離子交換色譜法和超濾法等。這些方法保持了未分級肝素原有的結構特徵和生物學活性，但由於低分子量的成分再UHl中的含量低，不宜於大規模生產。降解方法有肝素酶解法、亞硝酸降解法、過氧化氫降解法、過碘酸降解法、β_消除法、Y-照射法等。不同方法製備得到的LMWH之間結構差異最大之處在於其末端結構，由亞硝酸降解得到的產物，其末端具有無水甘露醇殘基，β-消除法的產物具有非硫酸化或2-0-硫酸化的不飽和糖醛酸非還原末端。由於化學降解法反應的劇烈，使得肝素分子中的某些功能基團再反應過程中或多或少被破壞，從而對其某些生物學功能帶來一定影響。而酶法降解由於其反應條件溫和、便於檢測以及生物活性保持較好等特點，成為近年來LMWH提取研究的熱點。現在商品肝素主要來源於牛肺、豬肺、豬腸黏膜和羊肺等動物器官。但是，由於認識到哺乳動物不同種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染，對源自哺乳動物的LMWH的使用所帶來的副作用倍受關注。針對上述問題，本發明提供了一種使用極為廣泛的非哺乳類魚類資源，改進酶法提取工藝，獲取高凝血活性低分子量肝素的製備方法。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種利用非哺乳類魚類資源，採用改進酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法，以避免哺乳動物種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染，同時改進酶提取方法，提高了低分子量肝素的凝血酶活性。為解決上述技術問題，本發明提供一種製備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級肝素組分，用肝素酶降解未分級肝素，得到低分子量肝素凍幹純品，並對其含量和活性進行測定。本發明提供的製備低分子量肝素的方法，還包括使用高效液相質譜對所獲得的低分子量肝素的純度和分子量的分析。其中，從魚類組織中粗提獲取未分級肝素組分的步驟為在組織攪拌機中加入等量的魚類組織和PBS緩衝液進行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調節pH到9.O,升溫至80°C溫育3小時，並以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時，8000rpm離心，收集上清施加至強鹼性陰離子交換樹脂，並使用含有4MNaCl的PBS緩衝液對肝素進行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對洗脫液進行濃縮和脫鹽，加入95%乙醇洗滌2_3次後進行真空凍幹處理，即獲得未分級肝素凍幹品。其中，所述的魚類為鮭魚，特別的，所述魚類組織選自頭、皮、鰓和內臟。其中，所述強鹼性陰離子交換樹脂優選為美國RohmHass生產的Amberlite系列、德國拜爾公司生產的Lewatit系列。其中，所述用肝素酶降解未分級肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UHl組分溶於PH7.4的PBS溶液中，充分溶解後離心去除雜質，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應10小時後，不加入相同量的肝素酶III，繼續反應10小時，然後水浴升溫加熱至80°C，I小時候停止反應並IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然後加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉澱析出，8000rpm離心20min後,棄去上清收集沉澱,重複上述鹽析、脫水步驟,將獲得的沉澱凍幹處理後即得低分子量肝素純品。其中，所述低分子量肝素含量的測定的方法採用咔唑比色法。其中，所述低分子量肝素純度和分子量分析採用高效液相質譜聯用儀和聚丙烯醯胺凝膠電泳法。其中，所述高效液相-質譜法的具體操作步驟為將凍幹純品溶解於蒸餾水配製成Iμg/μI的濃度，進樣5μI。流動相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65ν/ν)，兩個流動相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調節至6.5。梯度洗脫程序為0%B流動相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內使得B在總流動相中的比例由O%勻速增加到100%。色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為ΙΟμΙ/min。洗脫液直接接入電噴霧離子源質譜分析儀中，電噴霧接口設置為負電模式，進口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮氣分別被用作乾燥氣(5L/min)和中和氣(20psi),數據處理採用DataAnalysis2.0。其中，聚丙烯醯胺凝膠電泳法的具體步驟為將所獲得的低分子量肝素純品用雙蒸水配成5mg/ml,再與等體積40%蔗糖混勻配成上樣液，溴酚藍作指示劑。電泳膠濃度採用22%的分離膠加5%的濃縮膠，150V電泳Ih後，調電壓為200V繼續電泳1.5h。上樣量為1020μI,染色用O.25%阿利辛藍，染色半O.5h,脫色用2%醋酸脫至背景無色。其中，對低分子量肝素活性的測定包括羊血漿法測定抗IIa效價和生色底物法測定抗Xa效價。其中，所述羊血漿法測定抗IIa效價的步驟為取16支幹淨帶塞糖管編號I至16置於37°C水浴中，按逐管遞增10μI規律依次加入100μI到250μI的標準肝素(8IU/ml)。再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉3次使混勻並溼潤管內壁，勿產生氣泡。置於水浴中恆溫Ih後將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標準肝素的1/2凝固體積(標準肝素V1/2)。精確稱取層析分離後的肝素寡糖凍乾粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時按估計效價用O.9%氯化鈉稀釋適當倍數。用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)。按如下公式計算各供試品的抗凝血酶效價供試品效價(IU/mg)=(標準肝素V1/2/供試品Vl/2)X標準肝素效價X稀釋倍數。其中，所述生色底物法測定抗Xa效價的步驟為參照英國藥典方法將對照品依諾肝素用Tris2NaCl緩衝液(ρΗ7·4)配製成4個具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液。精密稱取肝素寡糖凍乾粉適量，用上述緩衝液溶解成Img/ml，測定時再用緩衝液稀釋適當倍數。ATIII和Xa因子均用上述緩衝液溶解按說明稀釋成適宜濃度。生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩衝液(pH8.4)稀釋成0.5mmol/L溶液。取乾淨具塞試管置於37°C水浴中，加入對照品或供試品溶液80μ1，空白管中加入ΡΗ7.4的緩衝液80μI。再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μ1，每次加試劑後都迅速漩渦振蕩混勻，勿產生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min。最後加入37%的醋酸600μI終止反應，在波長405nm處測定吸收度。以對照品效價為橫坐標，空白管減去對照管吸收值為縱坐標做標準曲線，根據供試品的吸收值差值在標曲上查出相應的效價值。圖1表示高效液相-質譜圖。圖2表示聚丙烯醯胺凝膠電泳圖，圖中泳道從左往右依次為肝素dplO，部分降解的肝素樣品，本發明所得LMWH，UFH，商品LMWH。具體實施例方式以下將結合附圖及實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題，並達成技術效果的實現過程能充分理解並據以實施。本發明提供一種製備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級肝素組分，用肝素酶降解未分級肝素，得到低分子量肝素凍幹純品，並對其含量和活性進行測定。本發明所提供的製備低分子量肝素的方法，還包括使用高效液相質譜對所獲得的低分子量肝素的純度和分子量的分析。所述從魚類組織中粗提獲取未分級肝素組分的步驟為選取鮭魚頭、皮、鰓和內臟等加工廢棄物，在組織攪拌機中加入等量的魚類組織和PBS緩衝液進行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調節pH到9.0，升溫至80°C溫育3小時，並以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時，8000rpm離心，收集上清施加至強鹼性陰離子交換樹脂，並使用含有4MNaCl的PBS緩衝液對肝素進行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對洗脫液進行濃縮和脫鹽，力口入95%乙醇洗滌2-3次後進行真空凍幹處理，即獲得未分級肝素凍幹品。所述強鹼性陰離子交換樹脂優選為美國RohmHass生產的Amberlite系列、德國拜爾公司生產的Lewatit系列。所述用肝素酶降解未分級肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UHl組分溶於PH7.4的PBS溶液中，充分溶解後離心去除雜質，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應10小時後，不加入相同量的肝素酶III，繼續反應10小時，然後水浴升溫加熱至80°C，I小時候停止反應並IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然後加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉澱析出，8000rpm離心20min後，棄去上清收集沉澱，重複上述鹽析、脫水步驟，將獲得的沉澱凍幹處理後即得低分子量肝素純品。所述低分子量肝素含量的測定的方法採用咔唑比色法(CarbazoleAssay),LMWH凍幹後配製成0.01mg/ml,O.05mg/ml和0.2mg/ml三個濃度。另外取同樣量的肝素和商品低分子量肝素各適量，重複以上的純化步驟，測定重量後凍幹配製成相對應的濃度作為對照。所述低分子量肝素純度和分子量分析採用高效液相質譜聯用儀和聚丙烯醯胺凝膠電泳法。所述高效液相-質譜法的具體操作步驟為將凍幹純品溶解於蒸餾水配製成Iμg/μI的濃度，進樣5μI。流動相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65v/V)，兩個流動相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調節至6.5。梯度洗脫程序為0%B流動相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內使得B在總流動相中的比例由O%勻速增加到100%。色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為ΙΟμΙ/min。洗脫液直接接入電噴霧離子源質譜分析儀中，電噴霧接口設置為負電模式，進口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮氣分別被用作乾燥氣(5L/min)和中和氣(20psi),數據處理採用DataAnalysis2.O。圖1中顯示了上述高效液相色譜一質譜分析的結果。所述聚丙烯醯胺凝膠電泳法的具體步驟為將所獲得的低分子量肝素純品用雙蒸水配成5mg/ml,再與等體積40%蔗糖混勻配成上樣液，溴酚藍作指示劑。電泳膠濃度採用22%的分離膠加5%的濃縮膠，150V電泳Ih後，調電壓為200V繼續電泳1.5h。上樣量為1020μ1，染色用O.25%阿利辛藍，染色半O.5h,脫色用2%醋酸脫至背景無色。本發明所獲得的低分子量肝素產物和肝素對照品一起進行聚丙烯醯胺凝膠，其獲得的結果見圖2，圖中蛋白條帶顯示本發明純化所得的蛋白質分子量約為5700Da，與已有的肝素樣品分子量類似。對低分子量肝素活性的測定包括對IIa效價和抗Xa效價的檢測，採用羊血漿法測定抗IIa效價和生色底物法測定抗Xa效價。所述羊血漿法測定抗IIa效價的步驟為取16支幹淨帶塞糖管編號I至16置於37°C水浴中，按逐管遞增10μI規律依次加入100μI到250μI的標準肝素(8IU/ml)。再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉3次使混勻並溼潤管內壁，勿產生氣泡。置於水浴中恆溫Ih後將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標準肝素的1/2凝固體積(標準肝素V1/2)。精確稱取層析分離後的肝素寡糖凍乾粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時按估計效價用O.9%氯化鈉稀釋適當倍數。用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)。按如下公式計算各供試品的抗凝血酶效價供試品效價(IU/mg)=(標準肝素V1/2/供試品Vl/2)X標準肝素效價X稀釋倍數。所述生色底物法測定抗Xa效價的步驟為參照英國藥典方法將對照品依諾肝素用Tris2NaCl緩衝液(ρΗ7·4)配製成4個具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液。精密稱取肝素寡糖凍乾粉適量，用上述緩衝液溶解成Img/ml，測定時再用緩衝液稀釋適當倍數。ATIII和Xa因子均用上述緩衝液溶解按說明稀釋成適宜濃度。生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩衝液(pH8.4)稀釋成0.5mmol/L溶液。取乾淨具塞試管置於37°C水浴中，加入對照品或供試品溶液80μ1，空白管中加入ΡΗ7.4的緩衝液80μI。再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μ1，每次加試劑後都迅速漩渦振蕩混勻，勿產生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min。最後加入37%的醋酸600μI終止反應，在波長405nm處測定吸收度。以對照品效價為橫坐標，空白管減去對照管吸收值為縱坐標做標準曲線，根據供試品的吸收值差值在標曲上查出相應的效價值。測定結果顯示如表I本發明LMWH與對照品依諾肝素對IIa和Xa半抑制率對比權利要求1.一種製備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級肝素組分，用肝素酶降解未分級肝素(UFH)，得到低分子量肝素凍幹純品，分析其分子量，並對其含量和活性進行測定。2.如權利要求1所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，從魚類組織中粗提獲取未分級肝素組分的步驟為在組織攪拌機中加入等量的魚類組織和PBS緩衝液進行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調節pH到9.0，升溫至80°C溫育3小時，並以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時，8000rpm離心，收集上清施加至強鹼性陰離子交換樹脂，並使用含有4MNaCl的PBS緩衝液對肝素進行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對洗脫液進行濃縮和脫鹽，加入95%乙醇洗滌2-3次後進行真空凍幹處理，即獲得未分級肝素凍幹品。3.如權利要求2所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述的魚類為海魚，優選鮭魚。4.如權利要求2所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述魚類組織選自頭、皮、鰓和內臟。5.如權利要求1一4任一所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，用肝素酶降解未分級肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UFH組分溶於pH7.4的PBS溶液中，充分溶解後離心去除雜質，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應10小時後，不加入相同量的肝素酶III，繼續反應10小時，然後水浴升溫加熱至80°C，I小時候停止反應並IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然後加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉澱析出，8000rpm離心20min後，棄去上清收集沉澱，重複上述鹽析、脫水步驟，將獲得的沉澱凍幹處理後即得低分子量肝素純品。6.如權利要求1一5任一所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述低分子量肝素含量的測定的方法採用咔唑比色法。7.如權利要求1一6任一所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述低分子量肝素純度和分子量分析採用高效液相質譜聯用儀和聚丙烯醯胺凝膠電泳法，其中高效液相-質譜法的具體操作步驟為將凍幹純品溶解於蒸餾水配製成Iμg/μI的濃度，進樣5μ1，流動相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65ν/ν)，兩個流動相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調節至6.5，梯度洗脫程序為O%B流動相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內使得B在總流動相中的比例由0%勻速增加到100%，色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為10μI/min,洗脫液直接接入電噴霧離子源質譜分析儀中，電噴霧接口設置為負電模式，進口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮氣分別被用作乾燥氣(5L/min)和中和氣(20psi)，數據處理採用DataAnalysis2.O。8.如權利要求1一7任一所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，對低分子量肝素活性的測定包括羊血漿法測定抗IIa效價和生色底物法測定抗Xa效價。9.如權利要求8所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述羊血漿法測定抗IIa效價的步驟為取16支幹淨帶塞糖管編號I至16置於37°C水浴中，按逐管遞增10μI規律依次加入100μI到250μI的標準肝素(8IU/ml)，再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉3次使混勻並溼潤管內壁，勿產生氣泡，置於水浴中恆溫Ih後將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標準肝素的1/2凝固體積(標準肝素V1/2)，精確稱取層析分離後的肝素寡糖凍乾粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時按估計效價用O.9%氯化鈉稀釋適當倍數，用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)，按如下公式計算各供試品的抗凝血酶效價供試品效價(IU/mg)=(標準肝素V1/2/供試品Vl/2)X標準肝素效價X稀釋倍數。10.如權利要求8所述的製備低分子量肝素的方法，其特徵在於，所述生色底物法測定抗Xa效價的步驟為參照英國藥典方法將對照品依諾肝素用Tris2NaCl緩衝液(pH7.4)配製成4個具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液，精密稱取肝素寡糖凍乾粉適量，用上述緩衝液溶解成Img/ml，測定時再用緩衝液稀釋適當倍數，ATIII和Xa因子均用上述緩衝液溶解按說明稀釋成適宜濃度，生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩衝液(pH8.4)稀釋成O.5mmol/L溶液，取乾淨具塞試管置於37°C水浴中，加入對照品或供試品溶液80μI,空白管中加入ΡΗ7.4的緩衝液80μ1，再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μI,每次加試劑後都迅速漩渦振蕩混勻，勿產生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min，最後加入37%的醋酸600μI終止反應，在波長405nm處測定吸收度，以對照品效價為橫坐標，空白管減去對照管吸收值為縱坐標做標準曲線，根據供試品的吸收值差值在標曲上查出相應的效價值。全文摘要本發明提供了一種利用非哺乳類魚類資源製備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級肝素組分，用肝素酶降解未分級肝素，得到低分子量肝素凍幹純品，採用咔唑比色法計算含量，使用高效液相質譜聯用儀和聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析分子量和純度，並通過羊血漿法測定抗Ⅱa效價和生色底物法測定抗Ⅹa效價對其活性進行評價。本發明利用非哺乳類魚類資源，克服了由於哺乳動物不同種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染所帶來的不利影響，並改進酶提取方法最終獲得高凝血酶活性低分子量肝素。文檔編號C12P19/26GK103060404SQ201310003149公開日2013年4月24日申請日期2013年1月6日優先權日2013年1月6日發明者曲輝,張春革,李萍,張永勤申請人:青島亞博生物科技有限公司