呼腸弧病毒的病毒修飾作用的製作方法

2023-04-29 02:40:36 2

專利名稱：：呼腸弧病毒的病毒修飾作用的製作方法
技術領域：
：本發明提供了一種用於屬於呼腸弧病毒科(Reoviridae)的病毒(即，呼腸弧病毒(Reoviruses))的反向遺傳系統，其各種應用，遺傳修飾的呼腸弧病毒，呼腸弧病毒選擇/生產和繁殖系統、藥物和疫苗。背景呼腸弧病毒科(呼吸道腸道孤兒病毒(RespiratoryEnteriticOrphanviruses))構成了具有分段雙鏈RNA基因組的無包膜病毒的家族。呼腸弧病毒科家族包括影響胃腸系統的病毒(如輪狀病毒(Rotaviruses))，其引起呼吸道感染。術語「孤兒病毒」指特定的病毒與任何已知的疾病無關，並且，儘管呼腸弧病毒科已經與許多疾病相關，但仍然使用其最初的名稱(Tyler，2001)。輪狀病毒屬可從人到人直接地傳播，並且是全世界2歲以內的兒童中嚴重腹瀉病的主要病原媒介，導致每年死亡約500，000人(Kapikian等人，2001)。哺乳動物正呼腸弧病毒(Orthoreoviruses)的原型已從人呼吸道和腸道分離，但與嚴重的人類疾病無關。其中，人呼腸弧病毒3型Dearing(T3D)常常被用來研究並用作該家族的模型(Mbert等人，2001)。此外，在最近十年期間，哺乳動物正呼腸弧病毒，尤其是T3D，已經在臨床前和臨床癌症治療實驗中用作溶瘤劑(Norman等人，2000；Shmulevitz等人，2005)。本發明部分地基於下面的觀察，S卩，呼腸弧病毒誘導腫瘤細胞但不誘導健康的未轉化細胞中的細胞死亡和凋亡(Hashiro等人，1977；Duncan等人，1978)。迄今為止，已經在加拿大、美國和英國開始了幾個臨床試驗，以研究此種方式對癌症治療的可行性。野生型呼腸弧病毒可使用幾種不同的蛋白作為結合其靶細胞的受體。首先，已經證明連接粘附分子-A(JunctionAdhesionMolecule-Α)(Jam_A，也稱為連接粘附分子1，或Jam-I)充當正呼腸弧病毒1型和3型的受體，並可介導病毒附著和感染(Chappell等人，2002d)。Jam-A是整合的緊密連接蛋白並且呼腸弧病毒T3D的Sigma-I蛋白的球狀頭部中的區域與Jam-A相互作用(Chappell等人，2002c)。另外，刺突蛋白(spikeprotein)Sigma-I的柄結構域(shaftdomain)中的序列可與細胞表面唾液酸分子相互作用以引起生痰性感染(Chappell等人，1997)。Sigma-I蛋白由RNA節段Sl(也稱為σ1)編碼。儘管呼腸弧病毒受體普遍存在，但一些腫瘤細胞在其細胞表面上可具有有限數目的受體。例如，Smakman(2005)描述來自具有結腸直腸轉移的患者的13個腫瘤片段沒有一個易於發生呼腸弧病毒T3D感染(Smakman，2005)。腫瘤細胞上呼腸弧病毒受體的缺乏阻礙了呼腸弧病毒作為溶瘤劑的功效。眾所周知，呼腸弧病毒科的遺傳修飾很困難，這歸因於它們的雙鏈RNA基因組的分段結構。為此，本發明涉及一種用於呼腸弧病毒科成員的反向遺傳(reversegenetics)方法。Roner等人，2001&ROner等人，1990開發了一種複雜的呼腸弧病毒反向遺傳系統，該系統涉及RNA節段之一的體外合成，該RNA的體外加帽，以及此RNA與其他9個節段的單鏈(正鏈)和/或雙鏈RNA的共轉染。為了啟動複製，用緩慢形成空斑(slow-plaqueing)的呼腸弧病毒變體呼腸弧病毒T2或Tl作為輔助病毒來感染被轉染的細胞(Roner等人，2001)。儘管生成了攜帶有氯黴素乙醯轉移酶基因的單重組呼腸弧病毒T3D，但該方法的效率低且很繁瑣。已經由Komoto和Sasaki(Komoto等人，2006)描述了備選方法，他們描述了用於輪狀病毒的反向遺傳系統的建立。儘管他們成功地拯救了重配的輪狀病毒，但該方法的效率非常低，需要進行改進。Kobayashi和合作者最近描述了使用完全基於質粒的系統來生成重組呼腸弧病毒T3D。(Kobayashi,T.，A.A.R.Antar，K.W.Boehme,P.Danthi,E.A.Eby,K.M.Guglielmi,G.H.Holm,Ε.Μ.Johnson,Μ.S.Maginnis,S.Naik,W.B.Skelton,J.D.Wetzel,G.J.Wilson,J.D.Chappe11,禾口Τ·S.Dermody.2007.APlasmid-BasedReverseGeneticsforAnimalDouble-StrandedRNAViruses(用於動物雙鏈RNA病毒的基於質粒的反向遺傳系統).CellHost&Microbe(細胞宿主與微生物)1147-157)。這兩種方法均依賴於具有真正節段末端的單鏈正鏈RNA的產生。這阻礙了重組體的形成，因為眾所周知，通常非聚腺苷酸化的單鏈RNA在哺乳動物細胞中的壽命很短。(Zeevi等人，1982)因此，本發明的目的之一是消除或減輕現有技術的上述問題。發明的概述本發明基於用於呼腸弧病毒科的有效反向遺傳系統的發展，該系統可以在例如，呼腸弧病毒的遺傳修飾的和/或宿主範圍的變體的開發中具有特殊的應用。在一個方面，本發明提供了一種修飾屬於呼腸弧病毒科的病毒的基因組的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將編碼呼腸弧病毒基因組的修飾部分的核酸引入至細胞中；(b)用呼腸弧病毒感染所述細胞；以及(c)在誘導產生修飾病毒的條件下保持所述細胞；其中所述修飾病毒，相對於步驟(b)中使用的呼腸弧病毒，包含修飾的基因組，所述修飾的基因組包含所述呼腸弧病毒基因組的修飾部分。本發明基於下面出人意料的觀察，S卩，當在細胞中表達時，呼腸弧病毒基因組的修飾部分可結合至新形成的呼腸弧病毒粒子中。不希望受理論的約束，相信該修飾的呼腸弧病毒基因組部分，一旦被引入至細胞中，就轉錄產生mRNA分子，該mRNA分子在真5'帽處起始，在3'端處未被截斷，且其延伸以進一步包含多聚腺苷酸區(polyAtract)。呼腸弧病毒科是具有分段雙鏈RNA基因組的無包膜病毒家族，包括，例如，正呼腸弧病毒屬(Orthoreovirus)、環狀病毒屬(Orbivirus)、輪狀病毒屬(Rotavirus)和科羅拉多比蜱傳熱症病毒屬(Coltivirus)物種。為此，本發明提供了一種修飾屬於呼腸弧病毒科家族的那些病毒的基因組的方法。在一個實施方案中，本發明提供了一種遺傳修飾正呼腸弧病毒屬物種，如例如，呼腸弧病毒3型Dearing株(T3D)的基因組的方法。典型地，用呼腸弧病毒感染細胞的步驟(上面的步驟(b))可能需要使用「野生型呼腸弧病毒」。野生型呼腸弧病毒可以是屬於呼腸弧病毒科的任何病毒的天然或自然存在形式。優選地，野生型呼腸弧病毒是待經曆本文所述的方法的呼腸弧病毒的野生型形式。作為實例，如果該方法涉及修飾正呼腸弧病毒屬物種的基因組，則用來感染細胞的呼腸弧病毒屬病毒可以是所述正呼腸弧病毒屬物種的野生型形式。備選地，用呼腸弧病毒感染細胞的步驟可用呼腸弧病毒突變體或變體來進行。例如，在某些實施方案中，可能需要使用，例如，熱敏感的和/或宿主範圍的突變體。另外地，5或備選地，上面步驟(b)中提到的呼腸弧病毒可以是這樣的呼腸弧病毒，其與相同物種的參考或野生型毒株相比，包含修飾的基因組。在此情況下，本文所述的方法的步驟(b)中使用的呼腸弧病毒的基因組可根據本文所述的任意方法或本領域技術人員已經知曉的任意方法來修飾。如上所述地，步驟(b)中使用的變異的、突變的或修飾的呼腸弧病毒優選地是待經曆本文所述的方法的呼腸弧病毒的變體、突變體或修飾形式。作為實例，如果該方法涉及修飾環狀病毒屬物種的基因組，則用來感染細胞的呼腸弧病毒可以是所述環狀病毒屬物種的變體、突變體和/或修飾形式。應該理解，經曆本文所述的方法的病毒相對於用來感染細胞的呼腸弧病毒是「修飾的」，並且步驟(b)中使用的呼腸弧病毒可以是同一病毒的野生型、變體、突變體或修飾形式。因此，短語「修飾的基因組」意欲指當與來源於步驟(b)中使用的病毒的基因組相比時，以某種方式被改變或不同的基因組。例如，基因組可被修飾以含有其他的核苷酸和/或取代的和/或反向核苷酸。另外地，或備選地，基因組可被修飾以使得，相對於用來感染細胞的病毒的基因組，某些核苷酸被刪除。此外，術語「細胞」包括能夠被野生型呼腸弧病毒感染的任意類型的細胞。熟知的實例包括細胞系'911'、PER.C6、『293'、HeLa、A549和L929。在一個實施方案中，本文所述的方法可用來修飾包含呼腸弧病毒基因組的一個或多個雙鏈RNA基因組節段。另外地，或備選地，該方法可用來修飾一個或多個雙鏈RNA基因組節段的一部分或多部分。應該理解，通過本文所述的方法引入的基因組修飾作用可表現為這樣的病毒的組分(例如，一種或多種結構和/或非結構蛋白)中的一種或多種修飾作用，所述病毒是由根據第一個方面的方法的步驟(b)中感染的細胞產生的。換句話說，由本文所述的方法產生的修飾的基因組可編碼一種或多種修飾的病毒組分。因此，除了提供能夠產生具有修飾的基因組的呼腸弧病毒的方法以外，本發明還提供修飾由該基因組編碼的一種或多種病毒組分的方法。以此方式，由上面步驟(b)中感染的細胞產生的病毒可包含一種或多種修飾的組分(例如結構和/或非結構蛋白)和/或修飾的基因組。在另一個實施方案中，該方法可用來修飾一種或多種結構組分如包含，例如，核心或衣殼結構的那些組分。另外地，或備選地，該方法可用來修飾一種或多種非結構組分如，例如，參與感染、複製、裝配和/或釋放的蛋白。特別地，該方法可用來修飾包括病毒衣殼的一種或多種蛋白。另外地，或備選地，本文所述的方法可用來修飾呼腸弧病毒基因組使得其包含一種或多種異源核酸序列。在一個實施方案中，異源核酸序列可編碼異源組分和/或蛋白。例如，基因組可被修飾，從而用相應的異源組分置換一種或多種天然或自然的呼腸弧病毒組分。在另一個實施方案中，呼腸弧病毒基因組可被修飾使得其除由呼腸弧病毒基因組編碼的天然或自然組分以外，編碼一種或多種異源組分和/或蛋白。還另一個實施方案中，異源核酸序列可編碼誘導細胞死亡或凋亡的一種或多種化合物或可抑制或阻礙一種或多種細胞過程的一種或多種化合物。應該理解，術語「異源」是指來自除經曆本文所述的方法的特定呼腸弧病毒以外的來源的核酸序列和/或其產物(例如，由其編碼的蛋白)。在正呼腸弧病毒屬-呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)的情況下，除了修飾包含所述基因組的一個或多個雙鏈RNA節段(或其一部分或多部分)以外，本文所述的任一方法還可用來修飾T3D的一種或多種組分，例如，結構和/或非結構組分。特別地，這些方法可用來修飾包括T3D內衣殼和/或外衣殼的一種或多種蛋白。蛋白σ1、σ3、λ2和μIc是外衣殼的組分，且蛋白λ、λ3、σ2和μ2是內衣殼的部分。本領域技術人員應該理解，為了修飾許多病毒組分，可將各自編碼病毒的修飾組分的許多核酸引入至細胞中。優選地，一種或多種)組分是結構和/或非結構組分。例如，結構組分可以是包括病毒衣殼的蛋白。優選地，並且在一個實施方案中，待引入至細胞的核酸可由下列的方法提供，所述方法包括包括生成病毒基因組的一個選擇部分或多個選擇部分的互補DNA(cDNA)拷貝的步驟。有利地，病毒基因組的一個或多個選擇部分可編碼病毒的一種或多種組分。在一個實施方案中，細胞(宿主細胞)可用來繁殖將經曆本文所述的方法的病毒。適合用作宿主細胞的細胞可包括例如，911細胞、PER.C6細胞、293細胞、HeLa細胞、A549細胞和L929細胞。典型地，在其中繁殖了病毒的細胞可經歷RNA提取流程。在一個實施方案中，RNA提取流程可涉及使宿主細胞經受誘導溶胞的條件的步驟。此類條件可包括凍融含病毒細胞懸液的應用。以此方式，宿主細胞內的任何病毒粒子可被釋放並通過，例如，離心，優選地通過超速離心而收穫。有利地，收穫的病毒粒子可經受誘導溶胞的條件。這些條件可包括使用，例如，能夠變性病毒粒子和滅活否則可變性和/或破壞核酸的酶的離液化合物。所述化合物可包括，例如，尿素和/或胍鹽化合物如鹽酸胍或硫氰酸胍。典型地，殘餘的病毒和/或細胞碎片可通過更多輪次的離心來去除，從而保留包含病毒RNA的上清液。優選地，RNA提取可通過核酸沉澱技術來完成，該技術涉及使用化合物如苯酚_氯仿、矽石珠，粒子或硅藻和/或設計用於從溶液中提取RNA的微旋轉(micro-spin)柱(QIAGEN)。關於這些技術的更多信息可從，例如，Boom等人，Rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids(純化核酸的快速和簡單的方法)，JournalofClinicalMicrobiology(臨床微生物學雜誌)，卷(3)28，495-503頁；Shafer等人，Interlaboratorycomparisonofsequence-specificPCRandligasedetectionreactiontodetectahumanimmunodeficiencyvirustype1drugresistancemutation(用於檢貝Ij1型人體免疫缺陷病毒藥物抗性突變的序列特異PCR和連接酶檢測反應的實驗室間比較).TheAIDSClinicalTrialsGroupVirologyCommitteeDrugResistancefforkingGroup(AIDS臨床試驗組病毒學委員會藥物抗性工作組)J.Clin.Microbiol.(臨床微生物學雜誌)1996341849-1853和MolecularCloning=ALaboratoryManual(ThirdEdition)(分子克隆實驗室指南(第三版))；Sambrook等人；CSHLPress(CSHL出版社)獲得。優選地，提取的RNA可經歷擴增流程，在該擴增流程中，特異於一條或多條特定病毒RNA序列(以後稱為靶病毒序列)的寡核苷酸引物用來擴增所選擇的一條或多條序列。典型地，寡核苷酸引物被設計成與某些核苷酸序列特異性雜交。在一個實施方案中，靶病毒序列編碼某些病毒結構組分和/或非結構組分。例如，靶病毒序列可編碼一種或多種衣殼蛋白。有利地，該寡核苷酸引物與病毒RNA在允許生成靶病毒序列的cDNA拷貝的條件下接觸。所述條件可涉及能夠將RNA逆轉錄為cDNA的酶的使用。在一個實施方案中，一條或多條靶序列通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來擴增。關於RT-PCR的更多信息可見，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)(分子克隆實驗室指南(第三版))；Sambrook等人；CSHLPress(CSHL出版社)。優選地，並且在一個實施方案中，靶病毒序列可被修飾，從而提供這樣的序列，即當與相應的野生型病毒序列相比時，該序列以某種方式改變或不同。例如，靶病毒序列可被修飾，從而包含編碼這樣的胺基酸序列的核苷酸，即當與該病毒的野生型中的相應胺基酸序列相比時，所述胺基酸序列包括一個或多個添加的、缺失的、置換的或倒置(inverted)的胺基酸殘基。有利地，靶病毒序列可在擴增流程期間被修飾。優選地，除了與靶序列特異性雜交的那些核苷酸以外，用於上述RT-PCR擴增流程中的寡核苷酸引物可進一步包含編碼待引入至所得cDNA中的修飾的核苷酸序列。另外地或備選地，該寡核苷酸可包含導致由該病毒靶序列編碼的一個或多個胺基酸的缺失、置換或倒置的核苷酸序列。因此，本文所述的方法可包括將編碼呼腸弧病毒基因組的修飾部分和/或呼腸弧病毒的修飾組分的互補DNA(cDNA)引入至細胞中的步驟。涉及將核酸引入至細胞中的步驟是本領域技術人員所熟知的，並且可涉及，例如，轉染流程或載體(例如，真核基因表達載體)如轉錄盒(transcriptioncassette)、質粒或病毒載體的使用。理想地，所述載體不是痘苗病毒，T7RND聚合酶驅動的載體。有利地，本發明的方法不依賴於輔助病毒的使用。典型地，轉染流程使用使細胞膜可透過諸如核酸的化合物的條件。作為實例，有可能使用電穿孔、熱激和/或如磷酸鈣的化合物將核酸轉染進細胞中。另外地，或備選地，核酸可藉助於基因槍被引入至細胞內。在這種情況下，待引入的核酸可以與可被直接遞送至細胞的粒子締合或否則綴合。優選地，待引入至細胞中的核酸包含在RNA聚合酶II依賴性轉錄盒如，例如，病毒載體內。以此方式，核酸可被穩定地表達。在一個實施方案中，轉錄盒能夠穩定地整合入細胞的基因組中，使得引入的核酸的產物被穩定地表達。優選地，RNA聚合酶II依賴性轉錄盒是慢病毒載體。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種修飾屬於呼腸弧病毒科家族的病毒的基因組和/或組分的方法，其中核酸(例如cDNA)包含在RNA聚合酶II依賴性轉錄盒如，例如，載體內。有利地，所述載體是病毒載體，優選是慢病毒載體。屬於呼腸弧病毒科的病毒可與某些細胞的表面上存在的特定類型的受體分子結合。例如，連接粘附分子-A(Jam-Α另外還稱為連接粘附分子1，或Jam-I)已知充當正呼腸弧病毒屬1型和3型的受體(介導附著和感染)。更具體地，T3D衣殼蛋白Sigma-I(Sl)的一部分(球狀頭部區)與Jam-A相互作用，而Sl的柄結構域內的某些其他序列可與細胞表面上存在的唾液酸分子相互作用。在結合特定的細胞分子(以後稱為「細胞受體」)時，該病毒可被內化並因此「感染」細胞。病毒結構組分和細胞受體之間的特異性相互作用促成屬於呼腸弧病毒科的病毒8所表現的特定細胞向性(即，結合和感染性特異性)。因此，在進一步的方面，提供了一種修飾屬於呼腸弧病毒科的病毒的細胞向性(cellulartropism)的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將編碼呼腸弧病毒的修飾組分的核酸引入至細胞中；(b)用呼腸弧病毒感染所述細胞；以及(c)在誘導產生具有修飾的細胞向性的修飾的呼腸弧病毒的條件下保持所述細胞；其中所述具有修飾的向性的修飾的呼腸弧病毒，相對於步驟(b)中使用的呼腸弧病毒，包含所述呼腸弧病毒的修飾組分。優選地，呼腸弧病毒的修飾組分可以是修飾的結構組分如病毒衣殼蛋白。有利地，該修飾作用使該病毒組分能夠結合步驟(b)中使用的呼腸弧病毒不能結合的細胞受體。在另一實施方案中，修飾屬於呼腸弧病毒科的病毒的細胞向性的方法，可包括修飾病毒的基因組使得其編碼能夠結合特定細胞的蛋白的步驟。以此方式有可能使呼腸弧病毒粒子靶向細胞如樹突細胞、巨噬細胞和/或其他類型的免疫細胞或白血細胞和/或來源於人體或動物體的組織和器官的細胞。在一個實施方案中，本發明提供了一種修飾T3D的細胞向性的方法，所述方法包括以下的步驟(a)提供編碼修飾的Sl衣殼蛋白的核酸；(b)將該核酸引入至細胞中；(c)用T3D病毒感染所述細胞；以及(d)在適合產生具有修飾的細胞向性的新T3D病毒的條件下保持所述細胞；其中所述具有修飾的向性的新T3D，相對於步驟(c)中使用的T3D病毒，包含所述修飾的Sl衣殼蛋白。典型地，步驟(c)中使用的T3D病毒是經歷上述方法的T3D的野生型、突變體、變體或修飾形式。優選地，修飾的Sl蛋白包含修飾的一級結構，該結構使Sl蛋白能夠結合步驟(C)中使用的T3D呼腸弧病毒的Sl蛋白不能結合的細胞受體。在一個實施方案中，Sl蛋白的修飾作用，相對於步驟(c)中使用的呼腸弧病毒的Sl蛋白，可包括向初級Sl胺基酸序列，或從初級Sl胺基酸序列上添加、缺失、置換或倒置一個或多個胺基酸。有利地，該修飾作用可包括對Sl蛋白的羧基末端的修飾作用。更優選地，該修飾作用包括向Sl初級序列上添加胺基酸，並且在一個實施方案中，該修飾作用包括向Sl衣殼蛋白的羧基末端上添加一個或多個組氨酸殘基。在另一個實施方案中，經歷上述修飾細胞向性的方法的呼腸弧病毒可用於某些疾病和/或病症的研究和/或治療中。在這些疾病和/或病症中，有可能研究和/或治療的是細胞增殖和/或分化障礙如癌症。由於已知呼腸弧病毒誘導癌細胞中的凋亡，因此被修飾以顯示對特定細胞類型的向性的呼腸弧病毒可用來治療癌症。有利地，和在另一個實施方案中，呼腸弧病毒可進一步被修飾以包含一條或多條核酸序列，這些序列編碼可誘導細胞死亡或凋亡的一種或多種化合物或可抑制或阻礙一個或多個細胞過程的一種或多種化合物。例如，所述一種或多種化合物可影響參與蛋白生成和/或細胞(分裂)周期的那些過程。例如，呼腸弧病毒基因組可進一步被修飾以包含編碼這樣的化合物的核酸序列，所述化合物如，例如，反義寡核苷酸序列，幹擾或抑制正常細胞過程的SiRNA和/或iRNA序列。在另一個實施方案中，修飾的基因組可包含編碼這樣的化合物的核酸序列，所述化合物對細胞具有細胞毒性、細胞凋亡和/或抑制作用。以此方式，根據本發明的修飾的呼腸弧病毒粒子可用來治療某些疾病或病症。在另一個實施方案中，呼腸弧病毒基因組可被修飾，從而包含編碼一種或多種化合物的核酸序列，所述化合物允許細胞內的檢測。例如，修飾的基因組可包含編碼螢光性化合物如GFP等的核酸。在另一個實施方案中，本發明提供一種修飾呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)的Sigma-I(Sl)衣殼蛋白的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將包含編碼修飾的T3DSl蛋白的cDNA的慢病毒載體引入至細胞中；(b)用T3D呼腸弧病毒感染所述細胞；以及(c)在誘導產生具有修飾的Sl蛋白的修飾T3D病毒的條件下保持所述細胞；其中所述具有修飾的Sl衣殼蛋白的修飾的T3D病毒，相對於步驟(b)中使用的T3D呼腸弧病毒，還包含編碼所述修飾的Sl衣殼蛋白的修飾的基因組。典型地，步驟(b)中使用的T3D呼腸弧病毒是經歷上述方法的T3D的野生型、突變體、變體或修飾形式。在第四個方面，提供通過本文所述的方法產生的屬於呼腸弧病毒科家族的修飾病在第五個方面，提供修飾的呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)，所述病毒包含修飾的Sl衣殼蛋白，所述修飾的Sl衣殼蛋白在其羧基末端處包含至少一個組氨酸殘基。在第六個方面，提供一種製備包含修飾的Sl衣殼蛋白的呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將編碼修飾的T3DSl衣殼蛋白的cDNA引入至細胞中；(b)用T3D呼腸弧病毒感染所述細胞；以及(c)在誘導產生修飾的T3D病毒的條件下保持所述細胞；其中所述修飾的T3D病毒，相對於野生型病毒，包含所述修飾的Sl衣殼蛋白。典型地，步驟(b)中使用的T3D呼腸弧病毒是經歷上述方法的T3D的野生型、突變體、變體或修飾形式。在第七個方面，本發明提供了繁殖呼腸弧病毒的方法。這些方法可能需要根據本文所述的任意一種方法修飾呼腸弧病毒的一種或多種組分，以及隨後使修飾的呼腸弧病毒與細胞(例如，修飾的細胞)相接觸，所述細胞表達能夠與所述修飾的呼腸弧病毒的修飾的組分結合或相互作用的結構部分(如蛋白質化合物，例如，抗體等)。有利地，呼腸弧病毒可被修飾，從而包含修飾的衣殼組分，所述修飾的衣殼組分能夠與由細胞表達或細胞上存在的化合物或結構部分相互作用或結合。以此方式，經與細胞的結構部分和呼腸弧病毒的修飾組分的相互作用(或之間的結合)，該細胞可被修飾的呼腸弧病毒感染。本領域技術人員應該理解，通過在允許產生/生成新病毒的條件下保持所述修飾的細胞，有可能繁殖該呼腸弧病毒。同樣地，本發明提供一種繁殖修飾的呼腸弧病毒的方法，所述方法包括以下的步10驟(a)使根據本文所述的任意一種方法修飾的呼腸弧病毒與包含能夠與所述修飾的呼腸弧病毒結合或相互作用的結構部分的細胞在允許所述修飾的呼腸弧病毒感染所述細胞的條件下進行接觸；和(b)在誘導產生修飾的呼腸弧病毒的條件下保持所述細胞。由於上文，並且在一個實施方案中，提供一種繁殖修飾的呼腸弧病毒的方法，所述方法包括以下的步驟(a)根據本文所述的任意一種方法修飾Sl衣殼蛋白，使得其在其羧基末端處包含至少一個組氨酸殘基；(b)將修飾的呼腸弧病毒與被修飾以表達能夠結合所述至少一個組氨酸殘基的結構部分的細胞接觸；以及(C)在誘導產生修飾的病毒的條件下保持所述細胞。優選地，所述修飾的呼腸弧病毒是修飾的呼腸弧病毒T3D，並且「細胞」來源於成膠質細胞瘤細胞系。在一個實施方案中，所述細胞是U118MG細胞。有利地，能夠結合所述至少一個組氨酸殘基的結構部分是肽，如，例如，抗體。術語「結合結構部分」也可用來包括任何此類肽或抗體的組氨酸結合片段/部分。例如，並且在抗體的情況下，該片段可包括重鏈和/或輕鏈和/或F(ab)和/或F(ab)2片段中的一種或多種。例如，所述結合結構部分可以是單鏈抗體。本領域技術人員應該理解，儘管缺少天然呼腸弧病毒受體(例如，JAM-A受體)，攜帶HIS-修飾的Sl衣殼蛋白的修飾的呼腸弧病毒可感染細胞並在細胞(如U118MG細胞)中繁殖，所述細胞已經被修飾以表達與所述修飾的Sl衣殼蛋白的至少一個組氨酸殘基相互作用的單鏈抗體。在一個具體的實施方案中，根據第七個方面的方法除了修飾衣殼蛋白以外，可允許繁殖呼腸弧病毒，該方法進一步包括對一種或多種其他的衣殼蛋白的修飾作用。例如，待繁殖的呼腸弧病毒可包括在Si衣殼蛋白的羧基末端上添加至少一個組氨酸殘基的修飾作用以及對同一或另一衣殼蛋白的一種或多種另外的修飾作用。這些另外的修飾作用可包括，例如，一個或多個胺基酸的缺失、插入和置換，所述胺基酸包括負責與天然呼腸弧病毒受體相互作用的衣殼(例如Si)蛋白。應該理解「天然」的呼腸弧病毒受體可被認為是一般由呼腸弧病毒結合以便感染細胞的受體。此類受體可存在於正常、健康細胞上。在呼腸弧病毒T3D的情況下，天然受體可被認為是JAM-A。通過修飾負責與天然呼腸弧病毒受體相互作用的胺基酸序列，可能阻止或抑制修飾的呼腸弧病毒和天然呼腸弧病毒受體之間的結合、相互作用和/或締合。因此，並且在另一個實施方案中，根據第七個方面的方法可涉及繁殖修飾的呼腸弧病毒的方法，所述修飾的呼腸弧病毒包括在其羧基末端上添加至少一個組氨酸殘基的修飾作用以及對改變與天然呼腸弧病毒受體相互作用的胺基酸的衣殼蛋白進行的另外的修飾作用。有利地，所述另外的修飾作用可包括對呼腸弧病毒T3D的Sl蛋白的胺基酸Asn369到Glu384的修飾作用。本領域技術人員應該理解，這些特定的殘基已經被提示與JAM-A相互作用(Campbell等人，(2005)JunctionalAdhesionMoleculeAServesasaReceptorforPrototypeandField-IsolateStrainsofMammalianReovirus(連接粘附分子A充11當哺乳動物呼腸弧病毒的原型和野外分離株的受體).(JOURNALOFVIROLOGY(病毒學雜誌)，797967-7978)。上述方法可用來繁殖病毒，所述病毒除了攜帶對Sl蛋白的羧基末端的組氨酸修飾以外，還包括將阻止病毒與天然受體相互作用、結合或否則締合的修飾引入至衣殼蛋白中的修飾作用。這樣的病毒可用於治療疾病，如癌症，因為它們可特異地靶向腫瘤細胞而非健康細胞。在第八個方面，提供了一種分離修飾的呼腸弧病毒粒子的方法，所述方法包括使具有至少一種修飾的衣殼組分的修飾的呼腸弧病毒與能夠與所述至少一種修飾的衣殼組分結合或相互作用的結構部分在這樣的條件下相接觸的步驟，所述條件允許所述至少一種修飾的衣殼組分和能夠與所述至少一種修飾的衣殼組分結合或相互作用的結構部分之間的結合。例如，該方法可包括使在Si蛋白的羧基末端處具有一個組氨酸殘基的修飾的呼腸弧病毒與組氨酸結合結構部分在這樣的條件下相接觸的步驟，所述條件允許所述至少一個組氨酸殘基和該組氨酸結合結構部分之間的結合。本領域技術人員應該理解，組氨酸結合結構部分可以是上述的任意一種結構部分。另外地，或備選地，組氨酸結合結構部分可包括金屬離子，如鎳離子。優選地，金屬離子可結合或否則固定在一些形式的支持物上，如，例如，瓊脂糖凝膠(s印harose)、玻璃、塑料、硝化纖維、瓊脂糖等。組氨酸結合結構部分可以柱的形式提供。作為實例，該柱可包括與鎳離子偶聯或綴合的瓊脂糖凝膠。該方法可包括洗滌步驟，在該步驟期間去除不與該組氨酸結合結構部分結合的任何修飾的呼腸弧病毒。以此方式，修飾的呼腸弧病毒可從水溶液、細胞溶胞產物等中分離和/或濃縮。在第九個方面，本發明提供了由本文所述的任意一種方法產生的修飾的呼腸弧病毒在製備針對由呼腸弧病毒科的成員弓丨起或促成的疾病的疫苗中的應用。在第十個方面，提供了由本文所述的任意一種方法產生的修飾的呼腸弧病毒在製造用於治療細胞增殖和分化病症如，例如，癌症的藥物中的應用。詳述現在參考下面的附圖描述本發明，附圖中顯示圖1不同細胞系中的呼腸弧病毒產率。圖2:S1cDNA序列和由其編碼的Sigmal蛋白的胺基酸序列。圖3=SlHIScDNA序列和由其編碼的sigmal_HIS蛋白的胺基酸序列。圖4編碼HAJam-A，scFvHIS和SlHIS的慢病毒構建體的圖示。圖5證明U118MG細胞中缺少Jam-AmRNA的逆轉錄酶PCR分析。下方的部分圖示了引物相對於Jam-AmRNA的位置。圖6如用WST細胞生存力測定法確定，呼腸弧病毒T3D感染的911和U118MG細胞的存活。圖7如通過採用HA抗血清的Western分析檢測，HAJam在U118MG細胞中的異源表達。圖8呼腸弧病毒T3D感染後兩天時在U118MG-HAJam細胞和U118MG細胞中的致細胞病變(cyopathic)效應。圖9如圖所示，呼腸弧病毒T3D感染細胞的[35S]甲硫氨酸-標記檢測呼腸弧病毒蛋白的λ，σ和μ類。圖10用LV-SlHIS-IRES-Neo轉導的911細胞中的Sigmal-HIS蛋白。如通過採用抗HIS抗血清的western分析檢測。圖11對來自在911-SlHIS細胞上傳代2次(P2)或3次(P3)的呼腸弧病毒T3D的蛋白提取物或作為對照對911細胞進行的Western分析。採用5-HIS(pentaHIS)血清進行該western分析以檢測含HIS-標記物的Sigmal蛋白的存在。圖12對用LV-scFvHIS-IRES-Neo細胞感染的U118MG細胞的蛋白提取物的Western分析。使用抗HA血清進行該western分析以檢測轉導的細胞中HA-標記的scFvHIS的存在。圖13如用WST細胞存活測定法檢測，用野生型呼腸弧病毒T3D和sigmal-HIS負荷的呼腸弧病毒感染後的細胞存活。圖14用於富集獲得了Sl-HIS基因組節段的呼腸弧病毒T3D的選擇系統的示意性簡圖。圖15分別在911-SlHis細胞和U118MG_scFvHIS細胞上連續傳代(P)和選擇⑶期間的呼腸弧病毒T3D的Western分析，其使用5HIS(pentaHIS)血清，以檢測HIS標記的sigmal蛋白。M=分子量標記，wt從911細胞中分離的野生型呼腸弧病毒T3D的樣品。圖16逆轉錄酶PCR，用於檢測野生型呼腸弧病毒T3D和已經在U118MG-ScFvHIS細胞上選擇的Sl-HIS呼腸弧病毒上的修飾的Sl基因組節段。圖17由來自在U118MG-scFvHIS細胞上針對存在HIS-標記物而選擇的呼腸弧病毒的Sl-HIS節段編碼的Sigmal_HIS蛋白的胺基酸序列。來自4個分離株RT5、RT6、RT8和RTlO的序列與在911細胞中表達的Sigmal-HIS(最上面的行)比較。本公開書描述了本發明用於改造Sigma-I蛋白或呼腸弧病毒T3D中的胺基酸的異源序列段的應用。這些胺基酸容許攜帶修飾的Sigma-I蛋白的病毒結合併利用腫瘤細胞外部上的新蛋白受體。如從下面的觀察顯而易見的是相互作用是功能性的，所述觀察是攜帶含有該胺基酸序列段的Sigma-I蛋白的呼腸弧病毒T3D能夠感染表達能夠結合所述胺基酸序列段的關聯蛋白受體的腫瘤細胞，而親代野生型呼腸弧病毒T3D則不能。攜帶含有該胺基酸序列段的Sigma-I蛋白的呼腸弧病毒T3D可在表達能夠結合所述胺基酸序列段的關聯蛋白受體的腫瘤細胞系上繁殖，而親代野生型呼腸弧病毒T3D則不能。本發明的方法依賴於使用常規的真核基因表達載體表達修飾的呼腸弧病毒T3D基因組節段。在本公開書中，申請人修飾了Sigmal基因組節段以編碼攜帶由一束6個組氨酸組成的羧基末端延長的Sigmal蛋白。以如下的方式構建表達盒，即，mRNA在正鏈Sigma-IRNA的真CAP位點處起始。與野生型Sl基因組節段相反，修飾的形式在正義RNA的正常3'端處是不截斷的，而是延長並包含多聚腺苷酸束。任何常規的RNA聚合酶II依賴性轉錄盒可達到此目的。在目前的形式中，使用標準慢病毒載體。藉助於標準慢病毒載體法(Carlotti等人，2004)，表達盒被轉移至所謂的911細胞中。在生成的細胞中，野生型呼腸弧病毒T3D繁殖了3代。生成的病毒儲液用來感染在其表面上表達結合HIS-標記物的單鏈(scFv)抗體的U118MG細胞。U118MG細胞缺少正常的呼腸弧病毒T3D受體Jam_A。野生型呼腸弧病毒既不能感染U118MG細胞也不能感染其表達scFvHIS受體的衍生物。然而，含有HIS-標記的Sl蛋白的修飾的呼腸弧病毒T3D可使用scFvHIS受體作為替代受體並可在這些細胞中繁殖。我們通過western印跡和通過Sl節段的核苷酸序列分析確認了子代病毒中HIS-標記物的存在。綜合我們的數據證明(i)具有多腺苷酸化mRNA的呼腸弧病毒科的反向遺傳學可行性，(ii)呼腸弧病毒科的遺傳再靶向是可行的，以及(iii)Sl蛋白的C末端是用於插入修飾宿主範圍的修飾突變的有效位置。這將直接用於生成更有效的溶瘤性呼腸弧病毒，並將促進用於致病性呼腸弧病毒科的新疫苗的開發。引物表1本研究中使用的引物下劃線的是限制性位點(NotI和HindIII)和HIS-標記物的序列實施例1構建用於異源表達呼腸弧病毒受體和呼腸弧病毒Sigma1的載體在第一個試驗中，呼腸弧病毒T3D在小鼠L細胞上繁殖。感染後5天，通過凍融培養基和在其中重新懸浮的細胞而從感染細胞中釋放子代病毒。使用此溶胞產物的一個等分試樣來感染911細胞(Fallaux等人，1996)、911細胞的SV40大T表達克隆、PER.C6細胞(Fallaux等人，1998)和最初被稱為293/tsA1609neo的293T細胞(DuBridge等人，1987)。在初次感染(在37°C，5%CO2下2小時)後，用含有10%胎牛血清(FCS)的標準達爾伯克氏改良伊格爾培養基(normalDulbecco'smodifiedEaglesmedium)(DMEM)更換培養基，並繼續溫育。在感染後48小時，在所有呼腸弧病毒T3D感染的細胞系中致細胞病變效應均很明顯。在多個時間點處，收穫培養基，並將細胞以IO9AiL的密度重新懸浮在含有2%FCS的磷酸鹽緩衝液(PBS)中。通過凍融三個循環使病毒從細胞中釋放。溶胞產物通過在臺式離心機中以1200xg離心10分鐘而變得澄清。如先前對腺病毒載體所述地，通過對911細胞進行標準的空斑測定法來測定病毒的濃度(Fallaux等人，1996)。圖1中表示的數據顯示所有被測的細胞系均產生了合理量的呼腸弧病毒T3D。在感染後48小時在911細胞中14獲得最高產率。為方便起見，911細胞系用作病毒生產和通過空斑測定法量化的標準細胞系。為了獲得Sigma1基因組節段的互補DNA(cDNA)克隆，在DMEM/2%FCS中用呼腸弧病毒T3D以5空斑形成單位(pfu)/細胞感染911細胞。在初次感染(37°C，5%CO2下2小時)後，用含10%FCS的標準DMEM更換培養基。感染後24小時，使用Stratagene絕對RNART-PCR小量製備試劑盒(StratageneAbsolutelyRNART-PCRMiniprepKit)根據生產廠商的流程，從感染的細胞中提取RNA。採用引物對ReoSl/H3和ReoSl/m(表1)並採用獲自Invitrogen的SuperscriptII逆轉錄酶，Sl基因組節段被拷貝為互補DNA(cDNA)並使用獲自Promega的Taq聚合酶通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增。在瓊脂糖凝膠電泳後，Sl-DNA片段用JETsorb凝膠提取試劑盒(Genomed)純化，並用限制性核酸內切酶HindIII和NotI消化。將生成的片段克隆在HindIII和NotI消化的質粒pcDNA3.1+中。使用由此獲得的連接混合物來轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)株T0P10F'，並且分離並擴增(expanded)含有具有期望結構的質粒的克隆，命名為pCDNART3Sl。來自克隆pCDNART3Sl的質粒DNA用於在萊頓基因組技術中心(LeidenGenomeTechnologyCenter)使用引物對ReoSl/H3和ReoSl/附進行序列分析。代表Sl節段的cDNA的序列顯示在圖2中。下劃線的是理論翻譯起始序列。給出了Sigma-I蛋白的推測的胺基酸序列。為了將呼腸弧病毒重新靶向至備選的受體，新的肽配體可包含在病毒衣殼中。一種選擇是將編碼此配體的密碼子引入至編碼衣殼組分的基因節段之一中。在衣殼組分和位置的選擇中，需要以下列的方式選擇用於插入關於該配體的密碼子的位點，即，在病毒粒子中配體易接近被靶向的受體，並且不妨礙被修飾的衣殼組分的基本結構或功能。因此，我們選擇將配體插入至Sigma-I蛋白中。呼腸弧病毒T3D的Sigma-I蛋白的一部分的晶體結構是已知的(Chappell等人，2002b)，並且以1KKE，D0I10.2210/pdblkke/pdb保藏在布魯克港胃白(BrookhavenProteindatabank)中。將人工配體插入在Sigma-I蛋白的羧基末端處，因為該區位於頭部結構域(headdomain)中，該頭部結構域靠近被假設與充當呼腸弧病毒T3D的天然受體的Jam-A蛋白相互作用的區域。(Chappell等人，2002b)。另外，Sigma1的羧基末端以下列的方式定位，即，末端胺基酸指向外側。因此，推測在羧基末端處融合另外的胺基酸應該不影響頭部結構域的空間結構。此外，我們假設附加的胺基酸會在頭部結構域的表面處被暴露，使得它們是可評估的並使它們能夠與被靶向的受體相互作用。為了向Sigma-I蛋白編碼區的羧基末端添加編碼6個組氨酸殘基(『HIS-標記物')的核苷酸序列，使用聚合酶鏈式反應克隆策略。製備兩個不同的構建體，兩個都含有與Sigma1的那些相融合的HIS-標記物的密碼子。第一個構建體含有HIS-標記物但缺少HIS標記的Sigma1下遊的所有呼腸弧病毒序列。因此該質粒缺少HIS-標記的Sigma1蛋白編碼區下遊的非編碼序列。第二個構建體含有編碼HIS-標記的Sigma-I的節段的全部cDNA。該構建體含有整個3'非翻譯區。第一個質粒通過使用引物對HisReoSlM2和ReoSlH3(其序列見表1)的聚合酶鏈式反應製備。為了生成含有平端的產物，使用Pfu聚合酶(Promega)。PCR產物用HindIII消化，然後進行凝膠電泳，凝膠提取和片段純化。該產物被克隆進用HindIII和EcoRV消化的ρ⑶NA3.1+的質粒DNA中。具有預期的限制圖譜的質粒被命名為pRT3SlHISst0p，並用於15進一步研究。插入至ρ⑶NA3.1+中的片段的序列通過DNA序列分析確定。結果驗證片段的身份和預期序列。使用pRT3SlHISstop作為模板以及SigmaEndRev和ReoSlH3的引物組合通過聚合酶鏈式反應生成質粒pRT3SlHISC0mplete。PCR產物用HindIII消化，然後進行凝膠電泳、凝膠提取和片段純化。該產物被克隆進用HindIII和EcoRV消化的ρ⑶NA3.1+的質粒DNA中。具有預期的限制圖譜的質粒被命名為pRT3SlHISC0mplete，其用於進一步的研究。插入至ρ⑶NA3.1+中的片段的序列通過DNA序列分析確定。結果驗證片段的身份和預期序列。修飾的呼腸弧病毒Sl基因組節段的cDNA序列顯示在圖3中，在該序列下面顯示了Sigma-I-HIS蛋白的胺基酸序列。為了生成穩定表達異源互補DNA(cDNA)克隆的細胞系，可相對容易地使用慢病毒載體。對於隨後的試驗，通過標準的克隆技術生成四種不同的慢病毒載體。在本研究中使用的所有慢病毒構建體均基於在pLV-CMV-IRES-NEO載體(Vellinga等人，2006)中製備的載體。圖4給出了製備的構建體的圖示。為了生成質粒pLV-CMV-SlHIS-IRES-NEO和pLV-CMV-SlHISstop-IRES-NEO，構建體pRT3SlHISComplete和pRT3SlHISstop用Ecol05I和XbaI消化，並克隆在質粒pLV-CMV-IRES-NEO的Ecol05I和Xbal位點之間。為了生成質粒pLV-CMV-HAJam-IRES-NEO，質粒pCDNA-HAJam(Naik等人，2001)(由Dr.U.PNaik友情提供)使用限制性核酸內切酶Ecol05I和XbaI消化，並插入在質粒pLV-CMV-IRES-NEO的Ecol05I和Xbal位點之間。為了生成編碼單鏈HIS-標記物受體的構建體，pHISsFv.rec(Douglas等人，1999)(由Dr.D.T.Curiel友情提供)用Ecol05I和XhoI消化並插入在質粒pLV-CMV-IRES-NEO的Ecol05I和XhoI位點之間。圖4給出了製備的構建體的概貌。慢病毒載體儲液的生產完全如前所述地(Carlotti等人，2004；Vellinga等人，2006)在293T細胞上使用磷酸鈣共沉澱法來進行。所有慢病毒載體均在轉染後48小時收-M-犾。為了產生穩定表達轉基因的細胞系，在Syg/ml聚凝胺(polybrene)(SigmaAldrich(西格瑪奧德裡奇)，Zwijndrecht，荷蘭)的存在下將不同慢病毒載體儲液的適當稀釋物加入至細胞系(濃度為I-IOngp24/2500細胞)中，並溫育過夜。第二天，向細胞提供新鮮培養基。48小時後，通過胰蛋白酶消化分離細胞，並將其重新塗布在含有700μg/mlG418(lnvitr0gen，布萊達(Breda)，荷蘭)的培養基中以選擇G418抗性細胞群。開始選擇後3-5天時，用含有200μgG418/ml的培養基更換培養基。實施例2:U118MG細胞由於缺少呼腸弧病毒受體Jam-A而抵抗呼腸弧病毒感染。幾個小組已經證明U118MG完全地抵抗呼腸弧病毒感染。(Wilcox等人，2001；Yang等人，2003)。為了針對我們的U118MG驗證此觀察結果，，我們通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(rtPCR)分析了Jam-AmRNA的存在。作為陽性對照，我們在此分析中包括了911細胞。用於逆轉錄酶反應的引物列舉在表1中。U118MG細胞和911細胞接種在5cm皿中。在培養物匯合後，使用獲自Stratagene的絕對RNA小量製備試劑盒(AbsolutelyRNAMiniprepKit)從細胞中分離RNA。使用RevRThJam引物(根據說明書，每次反應2pmol)，在採用SuperscriptII(Invitrogen)第一鏈合成中使用600ngRNA/細胞系。使用2μ116cDNA來進行使用RevRThJam和hjamnewF的引物組合的擴增反應以擴增hJam_A的全編碼區(928bp)。另外，使用引物對組合hjamnestR和hjamnewF來擴增較短的產物(359bp)。使用Taq聚合酶(Promega)以由下列循環組成的方案來擴增3分鐘95°C，(30s95°C-40s58°C-1分鐘72°C)x30-10分鐘72°C-10分鐘4°C-結束。結果描繪在圖5中。儘管Jam-ARNA很容易在911細胞中檢測到，但在Ul18MG來源的樣品中沒有明顯的信號，這表明MGl18細胞缺少可檢測水平的Jam-AmRNA。為了驗證U118MG細胞對呼腸弧病毒T3D感染有抗性，使U118MG細胞的培養物暴露於各種感染複數的呼腸弧病毒T3D病毒。作為此試驗中的對照，911細胞的培養物在相同的感染複數下暴露。儘管致細胞病變效應在911細胞的培養物中很容易觀察到，但在MG118培養物中病毒感染時改變不明顯，甚至在較長的溫育時間時也不明顯。這些培養物中細胞的生存力用WST細胞生存力測定法進行測定(圖6)。這些數據再次確證儘管呼腸弧病毒T3D很容易殺死911細胞，但U118MG細胞完全抵抗呼腸弧病毒T3D感染。為了證明這種結果是由於缺少Jam-A受體，使U118MG細胞暴露於慢病毒載體pLV-CMV-HAJam-IRES-NEO,以迫使充當呼腸弧病毒的初級受體的HA-標記的Jam-A蛋白的合成。使用HA特異性抗血清進行的G418-抗性LV-CMV-HAJam-IRES-NEO-轉導的細胞群的蛋白溶胞產物的western分析證明了這些細胞中HA-標記的Jam-A的強力表達(圖7)。這進一步通過免疫螢光顯微法確證，免疫螢光顯微法揭示在轉導和選擇的細胞群中的絕大多數細胞中均可檢測到HA-Jam-A信號。這些細胞暴露於呼腸弧病毒T3D導致在表達HA-Jam的U118MG細胞中致細胞病變效應的徵象的快速形成，但在親代U118MG細胞中不形成(圖8)。這進一步通過病毒蛋白的代謝標記來確證。感染或模擬感染細胞用Redivue[35S]甲硫氨酸原混合物(Pro-mix)(200μCi/ml；Amersham，羅森達爾(Roosendaal)，荷蘭)在感染後的多個時間點時標記4小時。細胞用PBS洗滌一次，並在含有蛋白酶抑制劑混合物(完整小片(Completeminitablets)，羅氏診斷(RocheDiagnostics)，阿爾梅勒(Almere)，荷蘭)的Giordano溶胞緩衝液(50mMTris_HClpH7.4,250mMNaCl，0.1%Triton,5mMEDTA)中溶解。所有標記測定在24孔板中完成，每孔使用5μ1原混合物，並且溶胞緩衝液的體積為每孔ΙΟΟμΙ。加入樣品緩衝液後，將其50μ1加入至10%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上。將凝膠乾燥並暴露於射線照相膠片，並且遵照標準程序處理(圖9)。結果證明在911細胞和表達HA-Jam-A的Ull8MG細胞中存在病毒蛋白，但在未修飾的U118MG細胞中不存在。從這些數據我們得出結論，U118MG細胞抵抗呼腸弧病毒T3D感染，並且這僅僅是由於缺少可充當呼腸弧病毒T3D感染的初級受體的Jam-A蛋白而引起的。實施例3產生Sigma1的911細胞系的生成。作為下一步驟，我們生成了產生呼腸弧病毒T3D蛋白的細胞系。為此目的，以I-IOngρ24/2500個細胞的濃度將911細胞暴露於LV-CMV-S1HIS-IRES-NE0載體病毒。在選擇G418抗性細胞群，在此命名為911-S1HIS細胞後，從這些細胞生成蛋白溶胞產物，並使用以11500稀釋的α-5-His血清(QiagenBeneluxbv，荷蘭)通過western分析而進行分析，以檢測含HIS-標記物的Sigma1蛋白。結果繪製在圖10中。這些數據證明在G418選擇中存活的LV-CMV-S1HIS-IRES-NE0轉導的細胞中存在49kDa條帶，而在親代911細胞中不存在該條帶。從這些數據我們得出結論911細胞系含有顯著量的HIS標記的Sl蛋白。這意味著Sl過表達對細胞沒有毒性。實施例4在病毒衣殼中功能性地引入修飾的Sigma1蛋白隨後，我們用呼腸弧病毒T3D以約10的感染複數感染911-S1HIS細胞。出現致細胞病變效應後1天，收穫病毒，通過凍融釋放細胞結合的病毒，並使用1/100的產物感染911-S1HIS細胞的次級培養物(secondculture)。病毒在911-S1HIS上連續傳代3次。分離的病毒的等分試樣使用α-5-His血清通過western分析來分析。結果繪製在圖11中。抗HIS血清檢測到以預期的尺寸遷移的蛋白，這提示呼腸弧病毒能夠將HIS標記的Sigma1蛋白引入在其衣殼中。為了檢測在此位置中插入的胺基酸是否可與HIS-標記物功能性地相互作用，U118MG細胞被修飾以表達可與其細胞表面上的HIS-標記物相互作用的單鏈抗體。為此，使U118MG細胞暴露於慢病毒載體LV-CMV-scFvHIS-IRES-NEO。如從使用HA抗血清作為探針對細胞的蛋白溶胞產物進行的western分析中顯而易見地，G418抗性細胞群表達單鏈HIS受體(圖12)。在親代U118MG細胞中，缺少該信號。免疫螢光顯微法還揭示在培養的所有細胞中有均一的染色，證明在所有細胞中有相似量的蛋白。從這些數據我們得出結論，現在U118MG細胞在其表面上表達單鏈HIS受體。為了檢測單鏈HIS受體是否可被用作攜帶HIS標記的Sigma-I蛋白的呼腸弧病毒T3D的替代受體，使細胞系暴露於增加量的病毒儲液，並且作為對照，暴露於等量的親代野生型呼腸弧病毒T3D。表達HA標記的JAM-A的U118MG細胞對911來源的T3D呼腸弧病毒和911-SIHIS來源的呼腸弧病毒均敏感，而Ul18MG-scFvHIS細胞僅對911-SlHIS來源的呼腸弧病毒敏感，但對911來源的T3D呼腸弧病毒不敏感。在使用在911-SIHIS細胞系上繁殖的T3D病毒感染後三天顯微鏡檢查U118MG-scFV-HIS細胞時，致細胞病變效應變得很明顯。這些數據使用WST細胞存活力測定法進行量化(圖13)。綜合這些數據，證明scFv-HIS可用作Ul18MG細胞中的人工受體。這使Ul18MG細胞的感染能夠繼續進行而不依賴於正常的呼腸弧病毒T3D受體Jam-A。另外，驗證了HIS標記的Sigma-I蛋白在病毒衣殼中的存在，並且證明HIS-標記物暴露在病毒衣殼處，從而容許U118MG-scFV-HIS細胞的感染。實施例5在呼腸弧病毒中引入修飾的Sl基因組節段為了檢測呼腸弧病毒T3D是否獲得了在911-S1HIS細胞上繁殖期間引入的HIS標記的Sl基因組節段，使用從911-S1HIS細胞收穫的病毒來感染U118MG-SCFvHIS細胞。在出現明顯的致細胞病變效應的徵象時，通過輕輕地將細胞從皿上衝洗下來而使細胞與表面分離，並且通過研磨(triturating)細胞而將其懸浮在條件培養基中。通過凍融從細胞中釋放病毒。隨後，該批次呼腸弧病毒在臺式離心機中以2000rpm離心10分鐘而澄清。該批病毒再次用來感染UllSMG-scFvHIS細胞，並且感染後4天收穫細胞。該程序重複6次。該選擇方案概括在圖14中。在連續繁殖時，在用從911-S1HIS細胞收穫的呼腸弧病毒T3D初次感染的U118MG-ScFvHIS中致細胞病變效應的徵象變得比用從911細胞中分離的呼腸弧病毒T3D感染的細胞中更明顯。這提示病毒可以在U118MG-ScFvHIS細胞上繁殖。對用在911-S1HIS細胞上繁殖的呼腸弧病毒及其連續傳代的子代感染的U118MG-ScFvHIS細胞的蛋白溶胞產物的western分析，證明了溶胞產物中HIS標記的Sl蛋白的存在(圖15)。為了證明HIS標記的Sl基因組節段的存在，對從作為第7代的連續傳代的呼腸弧病毒T3D中分離的RNA進行逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(rtPCR)分析。在用連續傳代的病毒感染的U118MG-scFvHIS細胞中出現致細胞病變效應的徵象時，使用獲自Stratagene的絕對RNA小量製備試劑盒(AbsolutelyRNAMiniprepKit)從細胞中分離RNA。使用HisRev引物(根據說明書，每次反應2pmol)，在採用SuperscriptII(Invitrogen)是第一鏈合成中使用600ngRNA/細胞系。使用2μ1cDNA來進行使用HisRev和ReoSmi的引物組合的擴增反應以擴增Sl基因組節段的全編碼區。使用Taq聚合酶(Promega)來擴增，採用由下列循環組成的方案3分鐘95°C，(30s95°C-40s58°C-80s72°C)x30-10分鐘72°C-10分鐘4°C-結束。結果描繪在圖16中。HIS標記的Sl產物在U118MG-ScFvHIS中很容易檢測到，而在用未修飾的911細胞來源的呼腸弧病毒T3D感染的U118MG-ScFvHIS細胞中無明顯信號。根據生產廠商的說明書，將PCR產物克隆在質粒pCRII-TOPOanvitrogen)中。具有插入片段的克隆被單獨地擴增，並且從這些克隆中分離的質粒DNA分別使用M13反向和M123正向引物用於DNA序列分析。克隆的PCR產物的序列分析確認在Sigmal編碼區C末端的預期位置處存在HIS-標記物的密碼子。由四種不同的SlHIScDNA克隆編碼的sigma-1蛋白的胺基酸序列顯示在圖17中。親代序列(來自圖3)表示在最上面一行，並且命名為Sigmal-His(克隆的)。克隆RT5和RT6的胺基酸序列與親代克隆相同，但RT8和RTlO分別具有1個和2個胺基酸差別。儘管如此，如所預期地，在所有情況下HIS-標記物都連接到sigma1的羧基末端。從這些數據，我們得出結論在911S1HIS細胞上繁殖時，呼腸弧病毒T3D獲得了HIS標記物的密碼子。這最有可能是親代野生型親代Sl基因組節段和異源SlRNA之間的重配過程(reassortingprocess)的結果。然而，基於到目前為止獲得的數據，其他機制如重組，或複製期間的模板轉換(templateswitching)不能被排除在外。連續繁殖的病毒不能感染未修飾的U118MG細胞，從而證明轉導嚴格地依賴於細胞上的scFv-HIS蛋白，該蛋白的作用是替代受體。綜合我們的數據顯示通過在含有嵌入呼腸弧病毒Sl基因組節段的多腺苷酸化mRNA的細胞上繁殖呼腸弧病毒可相對容易地生成再靶向的呼腸弧病毒。在細胞中表達的mRNA是單鏈的，並含有Sl基因組節段的整個正鏈RNA。然而，儘管在5'端，異源SlmRNA在真正的Sl基因組節段的位置處或附近起始，但是3'端顯著地延長並含有IRES序列、NEO基因、B型肝炎病毒(HBV)來源的轉錄後調控元件(PRE)和人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)長末端重複序列的一部分。很顯然，Sl基因組節段的正鏈上存在3'延長不幹擾再靶向突變作用的獲得。參考文獻目錄E^，2007.http//www,oncolyticsbiotech.com/.Carlotti,F.,Bazuine,Μ.,Kekarainen,Τ.,Seppen,J.,Pognonec,P.,Maassen,J.Α.,Hoeben,R.C.,2004.Lentiviralvectorsefficientlytransducequiescentmature3T3-L1adipocytes(慢病毒載體有效地轉導靜止的成熟3T3-L1脂肪細胞).Mol.Ther.(分子治療學)9，209-217.Chappel1，J.D.，Gunn,V.L.，Wetzel,J.D.，Baer,G.S.，Dermody,T.S.，1997.Mutationsintype3reovirusthatdeterminebindingtosialicacidarecontainedinthefibroustaildomainofviralattachmentproteinsigmal.(決定與唾液酸結合的3型呼腸弧病毒中的突變包含在病毒附著蛋白sigmal的纖維狀尾部結構域中)J.Virol·(病毒學雜誌)71,1834-1841.19Chappell，J.D.,Prota,Α.Ε.,Dermody，T.S.,Stehle,Τ.,2002a.Crystalstructureofreoνirusattachmentproteinsigma1revealsevolutionaryrelationshiptoadenovirusfiber(呼腸弧病毒附著蛋白sigmal的晶體結構揭示了與腺病毒纖維的進化關係).EMBOJ(歐洲分子生物學組織雜誌).21，1-11.Chappell，J.D.，Prota,Α.E.，Dermody，T.S.，Stehle，T.，2002b.Crystalstructureofreoνirusattachmentproteinsigmalrevealsevolutionaryrelationshiptoadenovirusfiber(呼腸弧病毒附著蛋白sigmal的晶體結構揭示了與腺病毒纖維的進化關係).EMBOJ(歐洲分子生物學組織雜誌).21，1-11.Coffey,Μ.C，Strong，J.Ε.，Forsyth,P.Α.，Lee,P.W.，1998.ReovirustherapyoftumorswithactivatedRaspathway(呼腸弧病毒治療具有激活的Ras通路的腫瘤).Science(科學)282，1332-1334.Douglas，J.Τ.，Miller，C.R.，Kim,Μ.，Dmitriev，I.，Mikheeva，G.，Krasnykh,V.，Curiel,D.Τ.,1999.Asystemforthepropagationofadenoviralvectorswithgeneticallymodifiedreceptorspecificities(用於繁殖具有遺傳修飾的受體特異性的腺病毒載體的系統).Nat.Biotechnol(自然生物技術).17,470-475.DuBridge,R.B.，Tang,P.，Hsia,H.C，Leong,P.M.，Miller,J.H.，Calos,Μ.P.，1987.AnalysisofmutationinhumancellsbyusinganEpstein-Barrvirusshuttlesystem(通過使用EB病毒穿梭系統分析人細胞中的突變).Mol.CellBiol.(分子細胞生物學)7，379-387.Duncan，Μ.R.，Stanish，S.Μ.，Cox,D.C，1978.Differentialsensitivityofnormalandtransformedhumancellstoreovirusinfection(正常禾口轉化的人細胞對呼腸弧病毒感染的差別敏感性).J.Virol.(病毒學雜誌)28，444-449.Fallaux，F.J.，Bout，Α.，van,d.V.，I，vandenWollenberg,D.J.，Hehir，K.M.，Keegan,J.，Auger，C，Cramer，S.J.，vanOrmondt,H.，vanderEb,A.J.，Valerio，D.，Hoeben，R.C，1998.Newhelpercellsandmatchedearlyregionl~deletedadenovirusvectorspreventgenerationofreplication-competentadenoviruses(f白勺_|]_Ifi禾口IZS白勺@&￥期區-1的腺病毒載體防止生成可複製的腺病毒).Hum.GeneTher.(人類基因治療)9，1909-1917.Fallaux,F.J.,Kranenburg,0.,Cramer,S.J.,Houweling,Α.,vanOrmondt,H.,Hoeben,R.C.,vanderEb,Α.J.,1996.Characterizationof911:anewhelpercelllineforthetitrationandpropagationofearlyregion1-deletedadenoviralvectors(表徵911一種用於滴定和繁殖缺失早期區1的腺病毒載體的新型輔助細胞系)·Hum.GeneTher.(人類基因治療)7，215-222.Hashiro,G.，Loh,P.C,Yau,J.Τ.,1977.Thepreferentialcytotoxicityofreovirusforcertaintransformedcelllines(呼腸弧病毒對某些轉化細胞系的優先細胞毒性).Arch.Virol.(病毒學文獻)54，307-315.Hirasawa,K.,Nishikawa,S.G.,Norman,K.L.,Coffey,Μ.C.,Thompson,B.G.,Yoon,C.S.,ffaisman,D.Μ.,Lee,P.W.,2003.Systemicreovirustherapyofmetastaticcancerinimmune-competentmice(在有免疫能力的小鼠中轉移癌的全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多種病毒組分是結構組分和/或非結構組分。7.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述呼腸弧病毒基因組被修飾從而包含一條或多條異源核酸序列。8.如權利要求7所述的方法，其中所述異源核酸序列編碼誘導細胞死亡或凋亡的一種或多種化合物或可抑制或阻礙一個或多個細胞過程的一種或多種化合物。9.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述待引入至細胞中的核酸包含在RNA聚合酶II依賴性轉錄盒內。10.如權利要求9所述的方法，其中所述RNA聚合酶II依賴性轉錄盒是慢病毒載體。11.一種修飾屬於呼腸弧病毒科的病毒的細胞向性的方法，所述方法包括以下的步驟(d)將編碼呼腸弧病毒的修飾組分的核酸引入至細胞中；(e)用呼腸弧病毒感染所述細胞；以及(f)在誘導產生具有修飾的細胞向性的修飾的呼腸弧病毒的條件下保持所述細胞；其中所述具有修飾的向性的修飾的呼腸弧病毒，相對於步驟(b)中使用的呼腸弧病毒，包含所述呼腸弧病毒的修飾組分。12.—種修飾呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)的Sigma-I(Si)衣殼蛋白的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將包含編碼修飾的T3DSl蛋白的cDNA的慢病毒載體引入至細胞中；(d)用T3D病毒感染所述細胞；以及(e)在誘導產生具有修飾的Sl蛋白的修飾T3D病毒的條件下保持所述細胞；其中所述具有修飾的Sl衣殼蛋白的修飾的T3D病毒，相對於步驟(b)中使用的T3D病毒，還包含編碼所述修飾的Sl衣殼蛋白的修飾的基因組。13.一種由權利要求1-12所述的方法產生的屬於呼腸弧病毒科家族的修飾病毒。14.修飾的呼腸弧病毒3型，Dearing株(T3D)，所述病毒包含修飾的Sl衣殼蛋白，所述修飾的Sl衣殼蛋白在其羧基末端處包含至少一個組氨酸殘基。15.一種繁殖修飾的呼腸弧病毒的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將根據權利要求13或14所述的呼腸弧病毒或根據權利要求1-12所述的任意一種方法修飾的呼腸弧病毒與包含能夠與所述修飾的呼腸弧病毒結合或相互作用的結構部分的細胞在允許所述修飾的呼腸弧病毒感染所述細胞的條件下進行接觸；和(b)在誘導產生修飾的呼腸弧病毒的條件下保持所述細胞。16.如權利要求15所述的方法，其中所述修飾的呼腸弧病毒是T3D呼腸弧病毒，所述T3D呼腸弧病毒包含如下修飾的Sl衣殼蛋白，即所述修飾的Sl衣殼蛋白在其羧基末端處包含至少一個組氨酸殘基，並且此外其中所述細胞的結構部分能夠結合所述修飾的Sl衣殼蛋白的至少一個組氨酸殘基。17.如權利要求16所述的方法，其中所述修飾的呼腸弧病毒進一步包括對衣殼蛋白的一種或多種附加的修飾作用。18.如權利要求17所述的方法，其中所述附加的修飾包括對呼腸弧病毒T3D的Sl蛋白的胺基酸Asn369至Glu384的修飾作用。19.通過權利要求15-18所述的方法繁殖的病毒在治療疾病如癌症中的應用。20.一種分離修飾的呼腸弧病毒粒子的方法，所述方法包括將在所述Sl蛋白的羧基末端處具有至少一個組氨酸殘基的修飾的呼腸弧病毒與組氨酸結合結構部分在允許所述至少一個組氨酸殘基和所述組氨酸結合結構部分之間的結合的條件下進行接觸的步驟。21.由本文所述的任意一種方法產生的修飾的呼腸弧病毒在製備用於預防由呼腸弧病毒科的成員引起或促進的疾病的疫苗中的應用。22.由本文所述的任意一種方法產生的修飾的呼腸弧病毒在製造用於治療細胞增殖和分化病症的藥物中的應用。全文摘要本發明提供了一種用於屬於呼腸弧病毒科的病毒(即，呼腸弧病毒)的反向遺傳系統，其各種應用，遺傳修飾的呼腸弧病毒，呼腸弧病毒選擇/生產和繁殖系統、藥物和疫苗。文檔編號C12N7/02GK101918434SQ200880120260公開日2010年12月15日申請日期2008年10月16日優先權日2007年10月20日發明者黛安娜·約翰娜·瑪麗亞·范登沃倫堡,羅伯特·科內利斯·厄邦申請人:萊頓大學醫學中心附屬萊頓教學醫院