一種油桐殼生產生物丁醇的方法

2023-04-28 23:08:21

專利名稱：一種油桐殼生產生物丁醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種油桐殼生產生物丁醇的方法。
背景技術：
油桐(Vernicia fordii Hemsley)屬於大戟科油桐屬，為中亞熱帶落葉喬木,是原產我國且栽培利用悠久的重要工業油料樹種。在湖南、湖北、貴州、重慶、四川、廣西、廣東、雲南、陝西、河南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建、臺灣等地區均有栽培分布，其中以湖南、重慶、貴州、湖北的毗鄰地區為中心產區。油桐的主要產品是桐油，為最佳幹性油之一，在工業上具有廣泛用途。油桐殼是油桐果加工桐油的副產物，佔油桐果鮮重的40-55%。長期以來，油桐殼大多被人們丟棄浪費，被丟棄的油桐殼在降解過程中產生的異味氣體汙染空氣，產生的液體和固體汙染水源。2011年我國原油進口依存度高達55. 3%，預計到2015我國原油進口依存度將超過65.0%。對化石能源，特別是石油資源的高依賴程度正制約著我國經濟的可持續發展，影響著國家的戰略安全。隨著石油資源的耗竭和溫室效應等環境問題的日益突出，高效利用可再生原料生產能源和化學品已成為全球關注的重點之一。醇類是一類重要的平臺化學品，其中大部分醇可以通過微生物發酵轉化而得，因此，醇類被認為是極具發展潛力的生物燃料和生物基化學品。丁醇是一種重要的平臺化學品，主要用於製造增塑劑或用作溶齊U、萃取劑等。近年來，研究人員發現丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，其含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會腐蝕管道，不易吸水，便於管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。所以，丁醇已成為被世界各國企業和研究機構強烈關注的一種極具潛力的新型生物燃料[Durre, P.，Biobutanol: an attractive biofuel. Biotechnol.J. 2007，2，(12)，1525-34. ]。丁醇燃料的使用可以有效地減少化石燃料的消耗和溫室氣體的排放。目前，丁醇主要通過化學合成法生產，其原料來源於石化產品。利用微生物發酵生產丁醇在很多方面有化學合成法不可比擬的優點，微生物發酵為丁醇的工業化生產開闢了新的道路，有名的ABE發酵法(丙酮-丁醇-乙醇)曾經是世界上第二大生物發酵工程。ABE發酵法則是以糧食為原料，經發酵獲得丙酮、丁醇、乙醇(質量比3:6:1)，再經精餾後分別製得丙酮、丁醇和乙醇產品。近年來隨著石油價格的不斷上漲，丁醇發酵工業已迎來復甦產業的大好時機。由於第一代生物能源的發展是基於糧食為原料的，這會帶來生物能源與糧爭地、與人爭糧的問題。因此，目前迫切需要開發利用其它原料來生產生物能源的技術，即第二代生物能源技術。第二代生物能源技術的特點是利用 非糧作物即纖維素類等生物質來生產大宗的能源產品(如生物乙醇、生物丁醇等)。目前，已經有國內外研究者報導了利用各種生物質來生產丁醇的嘗試，報導的生物質大多是農業廢棄物，如大、小麥秸杆、玉米秸杆、玉米皮、玉米芯等。然而，利用林業廢棄物來生產生物丁醇的報導非常少見。

發明內容
本發明的目的在於提高一種油桐殼生產生物丁醇的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種油桐殼生產生物丁醇的方法，包括以下步驟
(1)油桐殼收集和預處理將油桐殼收集後，曬乾或烘乾，經粉碎機粉碎後，過>100目篩，得過篩物油桐殼粉末；
(2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質量稀硫酸體積=1:5-9(優選1:6)的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質量濃度為1-5%的稀硫酸(優選質量濃度為2%的稀硫酸)，在120-180°C水解1-3小時，得油桐殼水解液，控制油桐殼水解液中總糖濃度為35-45g/L ；
(3)水解液發酵培養基的配製將油桐殼水解液冷卻至室溫，過濾去除固形物，配製成發酵培養基；
(4)油桐殼水解液發酵將步驟(3)中配製好的培養基轉入發酵罐中，然後接種預先培養好的菌種，菌種的接種量為發酵水解液培養基體積的5%-10%，在35-40°C厭氧發酵72-120 小時；
發酵所用菌種可為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，購自英國食品工業與海洋細菌菌種保藏中心)，或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等體積混合物。進一步，步驟(3)，所述發酵培養基的配製向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為3. 0-5. Og/L (優選4. Og/L),加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 75-0. 95g/L (優選0. 85g/L)，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 75-0. 95g/L (優選0. 85g/L)，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 20-0. 30g/L (優選0. 25g/L)，加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 01-0. 03g/L (優選0. 02g/L)，加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 01-0. 03g/L (優選 0. 02g/L)，用氨水調節 pH 值為 6. 5-7. 0，在 110_120°C滅菌 15-25 分鐘。研究表明，梭菌屬中丙酮丁醇梭菌(CZo1S tridium ace tobutylicum)、拜氏梭舊(Clostridium bei jerinckii)能發酵生產丁醇S. ; Shaheen, R. ; Jones,R T.，Emended descriptions of Clostridium ace tobu tyli cum and Cl os tri di umbei jerinckii, and descriptions of Cl os tri di um saccharoperbu tylace toni cumsp. nov. and Cl os tri di um saccharobutyl icum sp. nov [J]. In t. J. Sys t.EvoL Microbiol. 2001，51， (Pt 6)，2095-103. T7。丙酮丁醇梭舊(Clostridiumacetobutylicum)是低GC含量的，能形成孢子的,一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌,它能以各種各樣的糖(如葡糖糖、半乳糖、纖維二糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖)為底物進行發酵產酸(乙酸和丁酸)和溶劑(丙酮、丁醇和乙醇)\_Ezeji, T. ; Qureshi, N. ; Blaschek,H. P.，Butanol production from agricultural residues: Impact of degradationproducts on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation.BiotechnoL Bioeng. 2007，97， (6)，1460-1469.];而拜氏梭 KClostridiumbeijerinckii)的底物譜和pH適宜範圍更寬，在發酵上比丙酮丁醇梭菌
況應」更具有工業應用潛力 \_Ezeji，T. C. ; Qureshi, N. ; Blaschek, KP.，Butanol fermentation research: upstream and downstream manipulations. TheChemical Record 2004，4，(5), 305-314.]。對本發明所得油桐殼水解液中的糖類(木糖、葡萄糖和阿拉伯糖)和發酵後的代謝產物(乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等)使用高效液相色譜(High performance LiquidChromatography, HPLC)分離鑑定,採用外標法進行定量分析。具體方法如下取出發酵過程中的樣品，進行離心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES (SLGP033RB)0. 22 iim針頭式過濾器過濾；過濾後的上清液全自動進樣，進入Agilentl200 HPLC(AgilentTechnologies公司)系統,用0. 05mM稀H2SO4作為流動相,流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H離子交換柱(7.8X300 mm，Bio-Rad公司)，上樣量5 y L，柱溫控制在15°C,在30°C下使用示差折光檢測器(Refractive index (RI) detector)進行信號檢測。本發明之油桐殼生產生物丁醇的方法，為丁醇微生物發酵提供一條新的途徑，不但可解決我國能源短缺的問題，還可避免因傳統丁醇發酵生產所帶來的與人爭糧的問題。此外，隨著桐油在國民經濟中的用途日益廣泛，產量的不斷增長，每年將有大量的副產物油桐殼產出。利用本發明，可充分開發和利用這些油桐殼資源，在提高油桐副產物利用率的同時，減少資源浪費和環境汙染。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。實施例I
本實施例包括以下步驟
(1)油桐殼的收集和預處理將油桐殼收集後，曬乾，經粉碎機粉碎後，過100目篩，稱取過篩油桐殼粉末I. Okg ；
(2)油桐殼的水解向油桐殼粉末中加入6L質量濃度為2%的稀硫酸，混勻後裝入帶有冷卻裝置的高壓反應釜中，在160°C水解I小時，得油桐殼水解液；經檢測，油桐殼水解液中總糖含量為40. 6g/L ；
(3)水解液發酵培養基的配製待步驟(2)中油桐殼水解液冷卻至室溫後，過濾去除固形物，再向水解液中加入乙酸鈉直至水解液中乙酸鈉含量為4. 0g/L，加入磷酸二氫鉀至水解液中磷酸二氫鉀含量為0. 85g/L，加入磷酸氫二鉀直至水解液中磷酸氫二鉀含量為0. 85g/L，加入硫酸鎂直至水解液中硫酸鎂含量為0. 25g/L，加入硫酸錳直至水解液中硫酸錳含量為0. 02g/L，加入硫酸鐵直至水解液中硫酸鐵含量為0. 02g/L，用氨水調節pH值為
6.8，在115°C滅菌20分鐘，製成發酵培養基；
(4)油桐殼水解液發酵將步驟(3)中配製好的培養基轉入發酵罐中，無菌操作接種預先培養好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)，菌種的接種量為發酵水解液培養基體積的5%，在37°C厭氧發酵120小時，即成。本實施例所得發酵產物中溶劑(丁醇、乙醇和丙酮)的含量測定取出發酵過程中的樣品，進行離心取上清液；上清液用Millipore Mi llex-GP PES (SLGP033RB) 0. 22 u m針頭式過濾器過濾；過濾後的上清液全自動進樣，進入Agilent 1200 HPLC (AgilentTechnologies公司)系統，用0. 05mM稀H2SO4作為流動相，流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H離子交換柱(7. 8 X 300mm，Bio-Rad公司)，上樣量5 y L，柱溫控制在15°C，在30°C使用示差折光檢測器(Refractive index (RI) detector)進行信號檢測,採用外標法進行定量分析。發酵結果經120小時發酵後，產生丁醇7. 6g/L，乙醇I. 3g/L，丙酮3. 2g/L，總溶劑12. lg/L ;其中丁醇的比例達到62. 8%。實施例2 本實施例與實施例I的區別在於步驟(4),所用發酵菌種為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052，購自英國食品工業與海洋細菌菌種保藏中心)。發酵結果經120小時發酵後，產生丁醇8. 3 g/L，乙醇I. lg/L,丙酮2. 9g/L，總溶劑12. 3g/L ;其中丁醇的比例達到67. 5%。實施例3
本實施例與實施例I的區別在於步驟(4)，所用發酵菌種為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,購自英國食品工業與海洋細菌菌種保藏中心)等體積混合物。發酵結果經120小時發酵後，產生丁醇9. 8g/L，乙醇I. lg/L，丙酮3.4g/L，總溶劑14. 3g/L ;其中丁醇的比例達到68. 5%。
權利要求
1.一種油桐殼生產生物丁醇的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)油桐殼收集和預處理將油桐殼收集後，曬乾或烘乾，經粉碎機粉碎後，過>100目篩，得過篩物油桐殼粉末； (2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質量稀硫酸體積=1:5-9的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質量濃度為1-5%的稀硫酸，120-180°C水解1-3小時，得油桐殼水解液，控制油桐殼水解液中總糖濃度為35-45g/L ； (3)水解液發酵培養基的配製將油桐殼水解液冷卻至室溫，過濾，去除固形物，配製成發酵培養基； (4)油桐殼水解液發酵將步驟(3)中配製好的培養基轉入發酵罐中，然後接種預先培養好的菌種，菌種的接種量為發酵水解液培養基體積的5%-10%，在35-40°C厭氧發酵72-120 小時； 發酵所用菌種為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii NCIMB 8052),或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等體積混合物。
2.根據權利要求I所述的油桐殼生產生物丁醇的方法，其特徵在於步驟(3)，所述發酵培養基的配製向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為3. 5-4. 5g/L，加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 75-0. 95g/L，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 75-0. 95 g/L，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 20-0. 30g/L,加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 01-0. 03g/L,加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 01-0. 03g/L，用氨水調節pH值為6. 5-7. 0，在 110-120°C滅菌 15-25 分鐘。
3.根據權利要求I或2所述的油桐殼生產生物丁醇的方法，其特徵在於所述發酵培養基的配製向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為4. Og/L，加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 85g/L，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 85g/L，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 25g/L，加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 02g/L，加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 02g/L，用氨水調節pH值為6. 8，在115°C滅菌20分鐘。
全文摘要
一種油桐殼生產生物丁醇的方法，包括以下步驟(1)油桐殼收集和預處理；(2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質量:稀硫酸體積=1:5-9的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質量濃度為1-5%的稀硫酸，在120-180℃水解1-3小時，得桐殼水解液，控制水解液中總糖濃度為35-45g/L；(3)水解液發酵培養基的配製；(4)油桐殼水解液發酵將步驟(3)中配製好的培養基轉入發酵罐中，然後接種預先培養好的菌種，菌種的接種量為發酵水解液培養基體積的5%-10%，在35-40℃厭氧發酵72-120小時，即成。利用本發明，可提高油桐殼的利用率，減少資源浪費和環境汙染。
文檔編號C12R1/145GK102618586SQ201210077110
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者毛紹名, 章懷雲 申請人:中南林業科技大學