無需核酸標記的基因晶片及其應用的製作方法

2023-04-29 17:57:41 2

專利名稱：無需核酸標記的基因晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因晶片，尤其涉及一種無需核酸標記的基因晶片；此外，本發明還涉及應用該基因晶片進行檢測的方法。
背景技術：
基因晶片是人類基因組計劃帶來的最具應用價值的科研成果，它融合了生命科學、化學、微電子技術、計算機科學、統計學和生命信息學等多種學科的最新技術。隨著微加工技術的發展，高密度寡核苷酸晶片最高密度可達上百萬個探針，因此基因晶片通量水平並不受晶片技術本身制約，而是受樣本的處理和基因晶片設計方法的限制。在人類基因組，常見的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點超過1000萬個，佔總SNP位點的90％(The International HapMap Consortium.The International HapMap Project.Nature.2003；426789-96)。雖然單倍型(haplotype)可經由少數幾個標籤(tag)SNPs來測定，但對個體間的常見變異進行基因定位大約需要幾十萬個標籤SNPs，其數目隨不同的群體而有所不同(Gabriel SB，Schaffner SF，Nguyen H，et al.The structure of haplotype blocks in the humangenome.Science.2002；2962225-9；Stephens JC，Schneider JA，Tanguay DA，et al.Haplotype variation and linkage disequilibrium in 313 human genes.Science.2001；293489-93)。因此通過連鎖不平衡(linkage disequilibrium)定位致病變異，即使最保守估計，全面關聯研究(association study)所需的SNP遺傳標記的數量約在幾十萬個。儘管Affymetrix公司的SNP晶片單引物擴增技術由於受酶切位點所限，不能檢測位於較長和較短的限制性酶切片段中的SNPs，但該技術單管反應的多重水平可達1～25萬(Matsuzaki H，Loi H，Dong S，et al.Parallelgenotyping of over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-densityoligonucleotide array.Genome Res.2004；14414-25；Matsuzaki H，Dong S，LoiH，et al.Genotyping over 100，000SNPs on a pair of oligonucleotide arrays.Nat Methods.2004；1109-11)，因而SNP數量可在一定程度上彌補其信息量不足的缺陷，是當前唯一能基本達到全基因組關聯研究的SNP分型技術。然而，單引物擴87yyu增技術不能特意地分析所選擇的SNPs，不適用於定製晶片，難以應用於臨床檢測診斷。這也反應在其與羅氏公司合作開發的AmpliChip CYP450，該晶片僅含CYP2D6和CYP2C19兩個基因一些常見的基因型，CYP3A4等其它重要的藥物代謝酶基因均未包含在內，並採用多重PCR技術擴增目的DNA片段(Chou WH，Yan FX，Robbins-WeilertDK，et al.Compari son of two CYP2D6genotyping methods and assessment ofgenotype-phenotype relationships.Clin Chem.2003；49542-51)。其它高通量的擴增技術有GoldenGate、分子倒置探針(molecular inversion probes)和多重PCR等，單管反應的多重水平約在2000左右，但由於受靶DNA對引物的競爭和引物之間的反應等問題，這些技術的多重水平的提升空間顯然非常有限，DNA處理成為了SNP晶片的瓶頸所在。高通量SNP晶片在臨床診斷中的應用，仍有賴於DNA處理、晶片設計等方面的發展。
直接用基因組DNA進行SNP分型顯然可以避開DNA擴增這一問題，並能同時對幾百萬的SNPs進行分型。低等生物的基因組複雜性較低，已成功地利用晶片直接對基因組DNA進行了多態分析，這些生物包括酵母(基因組DNA約為12Mb)(Winzeler EA，Richards DR，Conway AR，et al.Direct allelic variation scanning of the yeastgenome.Science.1998；2811194-7)和擬南芥(基因組DNA約為120Mb)(BorevitzJO，LiangD，PlouffeD，etal.Large-scale identification of single featurepolymorphisms in complex genomes.Genome Res.2003；13513-23)。然而，人類基因組DNA雖已成功地應用於cDNA、BAC和寡核苷酸晶片比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)晶片(Ishkanian AS，Malloff CA，Watson SK，et al.A tiling resolution DNA microarray with complete coverageof the human genome.Nat Genet.2004；36299-303)，但由於人類基因組DNA的高度複雜性，直接進行SNP分析的難度顯然要高於低等生物，從約30億鹼基對序列中鑑別一個SNP仍是一項艱巨的挑戰工作。通過近幾年的研究，已有幾種技術可以對人類基因組DNA進行SNP分型，包括膠體金檢測技術、侵入切割(invasive cleavage)、侵入切割結合滾環擴增(rolling circle amplification)和等位基因特異性引物延伸法(allele-specific primer extension)結合信號級聯放大等技術，但這些技術普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作複雜或低多重水平等缺點，它們在疾病基因組學和藥物基因組學等領域和臨床診斷方面的應用，尚有待於進一步的發展和完善。另一方面，人類基因組約有2-2.5萬個基因，涵蓋這些人類基因組所有的基因和表達序列標籤對於目前的表達譜晶片技術雖然簡單，但卻往往無法檢測出表達水平低下的基因，即使應用RNA線性擴增技術也無法解決。提高探針長度可在一定程度上提高檢出率，然而探針長度增加的同時，探針局部序列的特異性也大為降低，從而造成假陽性率大為增高。低表達基因檢出率低下的問題，是當前表達譜晶片急需解決的問題之一。
鑑於核酸擴增技術不足以解決基因表達譜和SNP晶片存在的問題，如何放大螢光信號將是提高晶片檢測能力的關鍵所在。級聯放大由於放大倍數有限，顯然不如侵入切割，這也反應在基於這兩種技術的基因組DNA直接進行SNP分型所用的DNA量(Gunderson KL，Steemers FJ，Lee G，et al.A genome-wide scalable SNPgenotyping assay using microarray technology.Nat Genet.2005；37549-54)。侵入切割對靶DNA序列的檢測是通過螢光共振能量轉移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)來實現。所謂的FRET是供體螢光基團受激發光照射後將能量非反射性轉移到鄰近的另一受體螢光基團或淬滅基團，使後者以其自身特有的發射光波長將能量釋放出去或轉變成熱能散發出來，其轉遞效率與兩螢光是否處於最大的發射-吸收光譜範圍內和兩者間的距離有關(Ozaki H，McLaughlin LW.The estimationof distances between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescenceresonance energy transfer.Nucleic Acids Res.1992；205205-14)。侵入切割是依據副翼核酸內切酶(flap endonucleases，FEN)的酶切特性來設計一條侵入探針和兩條SNP等位基因特異性探針，將多態性位點置於侵入探針和等位基因特異性探針之間的重疊處(Olivier M.The Invader assay for SNP genotyping.Mutat Res.2005；573103-10)。這樣等位基因特異性探針的5』端就如同在侵入探針的侵入下而呈翼狀探出，進而被FEN切下，導致5』端的螢光基團和內部的淬滅基團分離，從而產生螢光信號。一旦雜交的等位基因特異性探針被FEN切割後，殘留的探針片段脫落離開後，新的未切割的等位基因特異性探針又可結合到同一位點上，從而達到信號放大的目的。這種設計在90分鐘內，每個靶DNA序列的切割率大約在3000個探針分子(Lyamichev V，Mast AL，Hall JG，et al.Polymorphism identification andquantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotideprobes.Nat Biotechnol.1999；17292-6)，高效的信號放大作用使得基因組DNA不經擴增可直接進行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，並且探針設計較為複雜，其在SNP晶片中的最終應用尚有待於進一步發展和完善。
循環探針技術(cycling probe technology，CPT)是另一種對靶DNA信號進行放大的技術(Duck P，Alvarado-Urbina G，Burdick B，et al.Probe ampl ifier system basedon chimeric cycling oligonucleotides.Biotechniques.1990；9142-8)。CPT探針為一含DNA-RNA-DNA的嵌合體，長約25-30個鹼基，內含4-6個連續的嘌呤核苷酸。其原理是在等溫反應中，探針與單鏈靶DNA序列雜交後，在核糖核酸酶H(RNase H)的作用下，DNA-RNA-DNA探針中的RNA部分被特異性切割。RNase H是一種核糖核酸內切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈，該酶不能消化單鏈RNA、單鏈或雙鏈DNA。由於酶切後的探針片段的退火溫度遠低於反應溫度，切割後的CPT探針的兩端DNA部分也隨之從靶DNA序列上脫落下來，使得靶DNA序列又可以與完整的探針結合，從而提高了靶DNA序列的使用率。因此，每條靶DNA序列能與許多條完整探針雜交結合，從而產生很多切割的探針片段，其量隨著時間而堆積，呈線性擴增。通過結合凝膠電泳或免疫學檢測分析，CPT已被成功地應用於細菌及耐藥檢測。由於CPT具有線性擴增的特性，在探針的兩端DNA序列分別標記上螢光基團和淬滅基團，就可對螢光信號進行放大，達到實時定量檢測的目的。並且RNase H對DNA-RNA-DNA探針的切割存在著序列依賴性，只有RNA部分與靶DNA序列完全匹配的探針才能被切割，因此CPT也可用於SNP檢測。
與侵入切割一樣，CPT最大的特點就是不需要這種鏈式的擴增反應，它們是對DNA或者RNA的信號進行擴增。並且由於不需要鏈式擴增過程，整個反應過程只要控制在探針的退火溫度，不需要像PCR那樣反覆升溫、降溫，因此可以節省很多時間。並且CPT與PCR不同，它們不是放大的靶DNA序列被檢測，因此可減少由於PCR自身汙染造成的假陽性。只有當特異的DNA存在時，這種方法才能使信號分析累積，並可用多種儀器檢測。相比於侵入切割，CPT僅設計一條序列特異性探針或兩條等位基因特異性探針，設計較為簡單，所能檢測的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切後的探針片段中能與靶DNA序列互補的序列長度僅比完整的探針少一個鹼基，探針片段和完整的探針與靶DNA序列的退火與分離的動力學基本一致，兩者與靶DNA序列的結合存在著競爭。而CPT探針與靶DNA序列結合後，是被RNase H從中間部分切開，酶切後的探針片段的退火溫度遠低於反應溫度，脫落的探針片段不太可能再結合到靶DNA序列上，這使得CPT的信號放大效應遠高於侵入切割。因此，若將CPT應用於基因晶片中，產生的信噪比將明顯優於侵入切割，能大幅提高低表達基因的檢出率，並降低基因組DNA直接進行SNP分型的難度，更加適用於高通量、大規模的核酸檢測。
當前SNP晶片和表達譜晶片的技術已較為完善，但遠不能滿足生物醫學研究和臨床檢測診斷所需。在不影響準確率的情況下，如何提高表達水平低下的基因的表達譜晶片檢出率，如何將基因組DNA以最少的量直接應用於SNP晶片檢測，一直是當今基因晶片技術的難點所在。雖然核酸擴增或級聯放大能在一定程度上提高螢光信號，但這些技術不能根本性解決這些問題，並且操作相對較為複雜。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種無需核酸標記的基因晶片，該晶片改變傳統的每個靶DNA序列只與一條探針雜交的策略，通過將基因晶片技術與CPT結合，從增加每條靶DNA序列所能雜交的探針數目來提高每條靶DNA序列的使用率，以有效放大螢光信號。
本發明要解決的技術問題之二是提供一種應用上述基因晶片進行檢測的方法。
本發明要解決的技術問題之三是提供上述基因晶片在臨床檢測診斷中的應用。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種無需核酸標記的基因晶片，它包括固定在固相載體上的DNA-RNA-DNA探針。
本發明中所述固相基質可選用領域周知的基質，只要所述基質與所述反應物相容，不會影響檢測結果就可以。優選的，本發明所述固相基質選材為玻片、矽片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
所述探針兩端的DNA序列分別標記上螢光基團和淬滅基團，且在標記上螢光基團的DNA序列端通過連接分子固定探針於固相載體上。
所述探針的序列與靶DNA序列互補，優選所述RNA序列與靶DNA序列完全互補，該RNA序列不與探針的DNA序列互補。
所述探針的退火溫度為37～75℃，所述探針兩端的DNA序列的退火溫度比探針的退火溫度至少低10℃。
所述探針序列可包含1～10個錯配鹼基，較佳地，可包含1～5個錯配鹼基，更佳地，可包含1～2個錯配鹼基。
本發明基因晶片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針和固定化對照探針。
所述探針可通過連接臂固定於固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助於雜交反應的進行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28e66；USA Patent No.5556752]。連接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括15～30個功能基團長度。連接臂可以選用適當形式的功能基團，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
所述探針或連接臂通過連接分子固定於固相載體上。探針固定到載體上可以通過C-C鍵實現，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用矽氧烷鍵(玻璃或二氧化矽作支持物時使用)。矽氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲矽烷基或三烷氧基甲矽烷基等基團反應完成。氨基烷基矽烷、輕基烷基矽烷、2一輕乙基一氨丙基三乙氧基矽烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基矽烷或輕丙基三乙氧基矽烷都是很有用的表面吸附基團。
所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5』-NH2修飾、5』-SH修飾、5』-Poly T(A、C或G)修飾、5』-生物素修飾、3』-NH2修飾、3』-SH修飾、3』-Poly T(A、C或G)修飾和3』-生物素修飾等。
在本發明的另一方面，提供了一種應用權利要求1所述的基因晶片進行檢測的方法，包括如下步驟1)抽提待測樣品核酸；2)選取權利要求1所述的基因晶片；3)在適於與所選基因晶片進行雜交的條件下，加入樣品核酸和含RNase H酶的雜交液，並使其反應足夠時間；4)洗滌後檢測雜交反應的結果。
本發明中的RNase H酶包括耐高溫和不耐高溫RNase H酶，耐高溫RNase H酶在變性前後均可加入，而不耐高溫RNase H酶在變性冷卻後加入。
所述的雜交溫度為25℃～72℃，所述雜交時間為5分鐘～18小時。可以改變雜交條件以提高或降低雜交的嚴謹程度、雜交特異性。
所述雜交結果在檢測前的洗滌可使用任何適當的洗滌液，該洗滌液可含有0～3％(w/w)的表面活性劑，洗滌可持續適當的時間，如1～30分鐘。可以用室溫的洗滌液進行洗滌，或預熱後洗滌，如42℃。可用不同的洗滌液先後進行洗滌。
在本發明的另一方面，還提供了本發明的基因晶片在臨床檢測診斷中的應用。
本發明的基因晶片具有高效的信號放大作用，使核酸樣本不需任何螢光標記即可用於晶片雜交檢測，使基因晶片的檢測能力達到新的高度，不僅降低基因組DNA直接進行SNP等方面的晶片檢測難度，而且大幅提高表達譜晶片中表達水平低下的基因的檢出率，此外，由於不用進行繁瑣的核酸處理，操作更簡單，通量水平更高，費用也更低廉。


圖1是本發明的晶片雜交與信號放大的原理圖；圖2是本發明實施例2的晶片雜交結果圖；圖3是本發明實施例4的晶片雜交結果圖；圖4是本發明實施例5的晶片雜交結果圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1探針設計和基因晶片的製備1.探針設計探針的設計標準如下1)所選擇的基因或SNP位點側翼的序列經Blast，排除序列特異性差的基因序列或SNPs，以免造成非特異性雜交；2)SNP位點處於RNA序列中，並位於探針的中間部分；3)探針退火溫度48-60℃之間，兩端DNA部分的退火溫度比整條探針至少低15℃，使酶切後的探針片段與靶DNA序列分離；4)探針自身互補序列不超過3個鹼基對，並且探針之間不得形成二聚體，特別是RNA序列，以免產生高螢光背景；5)進行SNP Blast，確保探針序列在目的SNP位點外，無其他多態位點，以免影響雜交效率。
2.晶片的製備(1)探針溶解探針合成，先在探針的5』端加上一段連接臂，再將每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為10mM的探針與濃度為200mM的PBS溶液於384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20℃保存，以備點樣使用。
(2)點樣將預先設計併合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、矽片等材質的固相載體片基上，同時設立陽性和陰性對照。片基採用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在溼度65-75％(以FullMoon片基為準)，溫度為25℃的條件下點樣，點樣的格式為1×3，每個矩陣為8×18，點樣完畢後，放置半小時後，將晶片取出，室溫乾燥保存。
實施例21.目的基因擴增(1)引物序列引物1F 5』-gtcgcaacctggtgcctataa-3』(SEQ ID NO1)；引物1R 5』-tgctataagccagctgagagattt-3』(SEQ ID NO2)；引物2F 5』-aagccaaggctatgacattct-3』(SEQ ID NO3)；引物2R 5』-aattcccggagaacttgtgct-3』(SEQ ID NO4)。
(2)探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為RNA序列rs13431727-A5』-NH2-C18-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3』(SEQ ID NO5)；rs13431727-T5』-NH2-C18-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3』(SEQ ID NO6)；rs13431727-C5』-NH2--C18-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3』(SEQ ID NO7)；rs1146808-A5』-NH2-C18-ggaaatgt(Cy3)(TATC)a(ECLIPSE)aattatctg-3』(SEQ ID NO8)；rs1146808-C5』-NH2--C18-ggaaatgt(Cy3)(TCTC)a(ECLIPSE)aattatct-3』(SEQ ID NO9)；rs1146808-C5』-NH2--C18-ggaaatgt(Cy3)(TGTC)a(ECLIPSE)aattatct-3』(SEQ ID NO10)。
用SEQ ID NO1～4所示序列的引物進行PCR擴增，在60μl反應體系進行，反應體系是0.3mM dNTP、10mM Tri s-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上遊和下遊引物的濃度0.16μM、基因組DNA 60ng，Taq酶1.2U(Takara)。應用Touch-down PCR反應程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，MattickJS.』Touchdown』PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，194008]94℃變性5mins；94℃變性40s，64℃退火1min，每個循環降低0.5℃，72℃延伸30s，共10個循環；然後94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸30s，共30個循環；最後72℃延伸5mins。
2.PCR產物單鏈化處理取上述PCR產物5μl，進行擴增，反應體系含0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、下遊引物的濃度0.16μM和Taq酶0.6U(Takara)。PCR循環參數94℃變性5min；然後94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，共35個循環。
PCR產物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化1)加入5倍PCR產物體積的緩衝液PB，混勻，無需去除石蠟油或煤油。
2)將QIAquick離心柱放置於試劑盒提供的2ml收集管子中。
3)將樣本加入QIAquick離心柱中，離心30-60s，以結合DNA。
4)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中。
5)將0.75ml緩衝液PE加入到QIAquick離心柱中進行洗滌，離心30-60s。
6)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中，離心1min。
7)將QIAquick離心柱放置於高壓滅菌的1.5ml的離心管子中。
8)在QIAquick膜中央加入50μl緩衝液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脫DNA，離心1min。另外，為了提高DNA的濃度，也可在QIAquick膜中央加入30μl洗脫緩衝液，靜置1min，然後離心。
3.雜交和洗滌PCR產物95℃變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於雜交。雜交體系275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，15U RNase H，200ng純化PCR產物。60℃溫浴240分鐘。晶片雜交與信號放大的原理如圖1所示。然後用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH2O洗滌15秒。
洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的雜交結果如圖2所示，再用6enePix Pro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷目的序列。
實施例31.不對稱PCR利用實施例2的引物和探針序列進行不對稱PCR擴增，在60μl反應體系進行，反應體系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上遊引物的濃度0.16μM、上遊引物的濃度0.008μM、基因組DNA 60ng，Taq酶0.6U(Takara)。應用Touch-down PCR反應程序[Don RH，Cox PT，WainwrightBJ，Baker K，Mattick JS.』Touchdown』PCR to circumvent spurious priming duringgene amplification.Nucleic Acids Res.1991，194008]94℃變性5min；94℃變性40s，64℃退火1min，每個循環降低0.5℃，72℃延伸50s，共10個循環；然後94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸40s，共30個循環；最後72℃延伸5min。PCR產物用QIAquick PCR PurificationKit(Qiagen，Cat.No.28106)純化，操作按實施例2所述的步驟。
2.雜交和洗滌PCR產物95℃變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於雜交。雜交體系275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，15U RNase H，200ng純化PCR產物。60℃溫浴240分鐘。然後用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH2O洗滌15秒。
洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的雜交結果圖，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷目的序列。
實施例41.總RNA抽提(TRIzol法)(1)100mg甲狀腺組織可以加入1ml Trizol，用液氮研磨或採用電動勻漿器充分打碎組織塊。
(2)加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。
(3)4℃，12,000rpm離心15分鐘後小心將上清液轉入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。
(4)4℃，12000rpm離心10分鐘後，去上清，向沉澱中加入2/5體積的70％乙醇，4℃，12000rpm離心洗滌沉澱15分鐘。
(5)去上清，沉澱室溫晾乾後加入適量無RNA酶的水充分溶解沉澱，測定A260和A280值。
2.cDNA探針的製備(1)從-70冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然後在0.2ml PCR管中配製反應溶液。
總RNA 5μg隨機引物6聚體(5μg/μl) 1μl10mM dNTP mix 1μl無核酸酶的水 Xμl(補充水至12μl)總體積12μl(2)70℃預變性10min，立即置於冰上冷卻2min，隨後在PCR管中配製cDNA第一鏈合成反應體系5×first-strand buffer4μl0.1M DTT 2μlRNA抑制劑 1μl總體積19μl42℃保溫2min後加入1μl Superscript II(200U/μl)(Invitrogen，USA)。
(3)42℃保溫2小時，70℃變性10min。
3.雜交和洗滌探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為RNA序列rs13431727-A5』-NH2-C18-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3』(SEQ ID NO5)；rs13431727-T5』-NH2-C18-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3』(SEQ ID NO6)；rs13431727-C5』-NH2--C18-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3』(SEQ ID NO7)；
cDNA於95℃變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於雜交。雜交體系275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3 @ 25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，20U RNase H，15μg cDNA。60℃溫浴360分鐘。然後用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH2O洗滌15秒。
洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的雜交結果如圖3所示，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷目的序列。
實施例5DNA直接雜交探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為RNA序列bla2 5』-NH2-C18-cttgtcga(Cy3)(TTCTT)C(ECLIPSE)ttgggat(SEQ ID NO11)blaZ 5』-NH2-C18-gccaagag(Cy3)(GTAAT)G(ECLIPSE)aaggaa(SEQ ID NO12)EH10 5』-NH2-C18-ccatctcg(Cy3)(AAAAA)A(ECLIPSE)cggtgaa(SEQ ID NO13)EH1 5』-NH2-C18-tcagtaccta(Cy3)(AAAGA)T(ECLIPSE)attcagct(SEQ ID NO14)抽提的DNA用DNase I進行片段化，反應體系包括 37℃溫浴5min，然後95℃15min。
片段化產物95℃變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於雜交。
雜交體系275mM KCl，50mM Tris-HCl(pH 8.3@25℃)，3mM MgCl2，10mM DTT，0.05％SDS，10U RNase H。50℃溫浴120分鐘。然後用含0.5×SSC和0.1％SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH2O洗滌15秒。
洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的雜交結果如圖4所示，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷目的序列。
序列表110上海生物晶片有限公司120無需核酸標記的基因晶片及其應用130NP-1070716014170PatentIn version 3.3210121121212DNA213人工序列220
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221modified_base222(16)..(16)40014tcagtaccta aaagatattc agct 2權利要求
1.一種無需核酸標記的基因晶片，其特徵在於，它包括固定在固相載體上的DNA-RNA-DNA探針。
2.如權利要求1所述的基因晶片，其特徵在於，所述探針兩端的DNA序列分別標記上螢光基團和淬滅基團，且在標記上螢光基團的DNA序列端通過連接分子固定探針於固相載體上。
3.如權利要求1所述的基因晶片，其特徵在於，所述探針的退火溫度為37～75℃，所述探針兩端的DNA序列的退火溫度比探針的退火溫度至少低10℃。
4.如權利要求1所述的基因晶片，其特徵在於，所述的固相載體選材為玻片、矽片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
5.一種應用權利要求1所述的基因晶片進行檢測的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)抽提待測樣品核酸；2)選取權利要求1所述的基因晶片；3)在適於與所選基因晶片進行雜交的條件下，加入樣品核酸和含RNase H酶的雜交液，並使其反應足夠時間；4)洗滌後檢測雜交反應的結果。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟1)所述的待測樣品核酸為單鏈或雙鏈的DNA或RNA。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的樣品核酸為單鏈或雙鏈的DNA，優選單鏈DNA。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的步驟3)中雜交溫度為25℃～72℃，雜交時間為5分鐘～18小時。
9.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的RNase H酶包括耐高溫和不耐高溫RNase H酶。
10.權利要求1所述的基因晶片在臨床檢測診斷中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種無需核酸標記的基因晶片，它包括固定在固相載體上的DNA－RNA－DNA探針。本發明還公開了應用上述基因晶片進行檢測的方法以及該晶片在臨床檢測診斷中的應用。本發明的基因晶片具有高效的信號放大作用，不僅使基因組DNA易於直接進行晶片檢測，而且大幅提高低表達基因的檢出率。
文檔編號C12Q1/68GK1928118SQ20061002966
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月2日 優先權日2006年8月2日
發明者盛海輝, 肖華勝 申請人:上海生物晶片有限公司