一種去除TAQDNA聚合酶中核酸汙染的方法與流程

2023-04-29 13:31:46

本發明涉及生物化學
技術領域：
，尤其涉及一種去除taqdna聚合酶中核酸汙染的方法。
背景技術：
：基於pcr的非常的敏感性，微量的核酸汙染可能會導致不希望的假陽性結果。一些基於原核生物持家基因，如16s，的檢測方法，微量的核酸汙染會造成非常大的問題，造成大量的假陽性結果，無法正確地檢測病原體。這種核酸汙染可能來自pcr所用的水，dntps，引物，pcr緩衝液，pcr反應管和taqdna聚合酶，前5種核酸汙染可以用工程控制(engineeringcontrols)避免或消除，taqdna聚合酶中的核酸汙染是主要的問題。通常需要除去或基本上消除來自taqdna聚合酶中的dna或rna。這些診斷所用試劑蛋白酶絕大部分是用原核細胞表達純化的，有些產品沒有採取消除核酸汙染方法，或沒有有效的完全消除汙染的dna的方法。目前市場上常用的多種公司dna聚合酶，都或多或少含有細菌dna汙染。從rna樣品除去dna的常用方法是用i型脫氧核糖核酸酶(dnase)處理rna樣品，然後通過加熱失活或結合樹脂的步驟除去dnasei，但該方法不能很好地消除taqdna聚合酶中dna。廣譜核酸酶binuclease可將核酸水解為3-5bp的寡聚核苷酸，再經過色譜層析等方法消除汙染的核酸，然而binuclease是耐熱酶，微量的殘存的binuclease會水解pcr系統中的引物和模板，降低pcr的敏感性甚至造成假陰性結果。雖然在taqdna聚合酶純化過程中採用了一定的消除核酸的方法和步驟，比如添加dnase和rnase消化dna和rna，但這並不能完全消化核酸，主要目的是減少蛋白樣本的粘稠度，以便於以後的蛋白純化步驟。初步純化taqdna聚合酶後，可以用聚乙烯亞胺(pei)沉澱，水/有機兩相體系沉澱法去除一部分大腸桿菌dna，但也不能完全去除汙染的核酸。多年來，已經發展了很多種進一步去除taqdna聚合酶中汙染的細菌dna方法，例如物理射線處理，化學物質處理，物理射線結合化學物質處理，生物酶處理(核酸內切酶dnasei,核酸外切酶iii以及限制內切酶)，及多種步驟及物質聯合處理。這些方法已經過單獨測試過，也有不一致的結果報導，此外，大多數淨化程序導致taq聚合酶性能下降。有些方法，如核酸內切酶dnasei處理只能水解dna，無法處理rna。最重要的是，這些處理對於消除非常低分子量的dna片段(短於200bp)效果不佳。廣譜核酸酶binuclease作用於所有形式的核酸，包括雙鏈dna、dna：rna雜交分子、單鏈dna、單鏈rna等等，將之降解為小於等於4個核苷酸長的寡核苷酸鏈，再經過色譜層析等方法很容易消除汙染的核酸。然而binuclease是耐熱酶，微量的殘存的binuclease會水解pcr系統中的引物和模板，降低pcr的敏感性甚至造成假陰性結果。技術實現要素：本發明為解決現有技術中的上述問題提出的一種去除taqdna聚合酶中核酸汙染的方法，通過binuclease水解taqdna聚合酶中汙染的核酸，並通過本發明的特定方法完全除去binuclease，從而達到完全消除taqdna聚合酶樣本汙染的核酸。為了實現上述技術目的，本發明所採取的技術措施為：一種去除taqdna聚合酶中核酸汙染的方法，包括如下步驟：taqdna聚合酶與廣譜核酸酶binuclease直接孵育處理，用鎳樹脂結合taqdna聚合酶，洗滌鎳樹脂，去除廣譜核酸酶binuclease及其水解產物。同時，上述的方法還可以替換為：taqdna聚合酶先結合到鎳樹脂，再用適量的廣譜核酸酶binuclease注入鎳樹脂，孵育處理，洗滌鎳樹脂，去除廣譜核酸酶binuclease及其水解產物。優選地，所述鎳樹脂使用其他的二價金屬(例如ni，co，cu，fe)瓊脂糖樹脂或磁珠替代。優選地，本發明答方法還進一步包括固定初步生產的taqdna聚合酶量，用不同梯度單位的廣譜核酸酶binuclease直接孵育處理，確定最佳廣譜核酸酶binuclease用量的步驟。優選地，使用分子篩法去除廣譜核酸酶binuclease及其水解產物。優選地，使用離子交換法去除廣譜核酸酶binuclease及其水解產物。進一步地，本發明的方法還可以優化為偶聯廣譜核酸酶binuclease於固相介質，用taqdna聚合酶直接孵育處理，離心沉澱或通過含有網篩的濾過空柱分離廣譜核酸酶binuclease。進一步地，本發明的方法還可以優化為偶聯廣譜核酸酶binuclease於固相介質柱，再用適量的taqdna聚合酶注入偶聯柱，孵育處理，洗脫出處理好的taqdna聚合酶。另一方面，本發明還提供根據上述的方法製備獲得的taqdna聚合酶。本發明採用上述技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果：本專利通過binuclease水解taqdna聚合酶中汙染的核酸，並用不同的方法完全除去binuclease，在達到完全消除taqdna聚合酶樣本汙染的核酸的同時，解決了微量殘存binuclease降低pcr敏感性或造成假陰性結果的問題。附圖說明圖1為實施例一中市場上常見的dna聚合酶不同程度的大腸桿菌核酸汙染情況的測試結果，具體條帶說明見實施例一；圖2為實施例三中廣譜核酸酶binuclease和dnasei直接與taqdna聚合酶孵育結果；其中，(1，4)條帶為未經過任何處理的taqdna聚合酶；taqdna聚合酶與dnasei37度直接孵育30分鐘後，再經過75度滅活10分鐘，結果為(2，5)條帶；taqdna聚合酶與廣譜核酸酶binuclease37度直接孵育30分鐘後，75度10分鐘滅活處理的結果見(3，6)條帶；圖3為實施例四中廣譜核酸酶binuclease與taqdna聚合酶孵育，並去除廣譜核酸酶binuclease後的對比測定結果；其中，(1，4)條帶為未經過任何處理的taqdna聚合酶；taqdna聚合酶與dnasei37度直接孵育30分鐘後，再經過75度滅活10分鐘的結果見(2，5)條帶；taqdna聚合酶與廣譜核酸酶binuclease37度直接孵育30分鐘後，75度10分鐘滅活，去除廣譜核酸酶binuclease結果見(3，6)。具體實施方式下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發明，但是下述實施例並不限制本發明範圍。實施例一市場上常見的dna聚合酶大腸桿菌核酸汙染情況絕大部分市場上的taqdna聚合酶是用大腸桿菌表達純化的，雖然在純化過程中採用了一定的消除核酸的方法和步驟，但因方法的局限性，基本上或多或少含有細菌dna汙染。我們以大腸桿菌的16s當做pcr模板，檢測了市場上常用的多種公司dna聚合酶，都含有不同程度的大腸桿菌的dna汙染。如圖1所示，無論pcr系統中添加還是未添加大腸桿菌dna，用大腸桿菌16s的引物都可以擴增出目標基因。圖1中1-7pcr中未添加大腸桿菌dna，圖1中8-14pcr中添加有大腸桿菌dna。圖1中(1，8)是上海默禮生物醫藥科技有限公司初步生產的taqdna聚合酶，(2，9)是qiagen公司的taqdnapolymerase(批次10910609)，(3，10)是promega公司的gotaqhotstartgreenmastermix(批次0000155474)，(4，11)是biorad公司的2xiqtmgreensupermix(批次750000145)，(5，12)是neb公司的high-fidelity2xmastermix(批次0101506)，(6，13)是neb公司的taq2xmastermix(批次0181303)，(7，14)是abi公司的universalpcrmastermix(批次m12982)。實施例二初步純化taqdna聚合酶含有taqdna聚合酶基因表達型大腸桿菌細胞中經iptg誘導12小時後，通過離心收穫細胞，並在每升原始培養體積加入50ml緩衝液a(50mmtris-hcl，ph7.9；50mm葡萄糖，1mmedta，1mmpmsf)懸浮。通過離心再次獲得細胞沉澱，並重懸浮於50ml緩衝液a中。在液氮中冷凍並在37度下解凍兩次後，加入1ml溶菌酶(100mg/ml)，將混合物在室溫下保持30分鐘。加入等體積的裂解緩衝液(10mmtris-hcl，ph7.9；50mmkcl，1mmedta，1mmdtt，1mmpmsf，0.5％tween20,0.5％nonidetp40)。將裂解混合物在75℃下孵育30分鐘，並在4℃下以16,000×g離心10分鐘以除去細胞碎片，加入1％的消化溶液(10mmtris-hcl，ph7.5；15mmnacl，2mmcacl2，10mmmgcl2，50％甘油，0.5mg/mldna酶i，10mg/ml核糖核酸酶a)以除去絕大部分dna和rna。30分鐘後，將混合物在75℃水浴中再次處理30分鐘以使dna酶i變性，並在4℃以16,000×g離心10分鐘。將上清液轉移至其他離心塑料瓶中，並加入乙醇至終濃度為55％，並在4℃下以16,000×g離心15分鐘以回收taqdna聚合酶。將沉澱溶於25ml儲存緩衝液(50mmtris-hcl，ph7.9；50mmkcl，0.1mmedta，1mmdtt，0.5mmpmsf，50％甘油)中，然後儲存在-20℃。實施例三核酸酶直接與taqdna聚合酶孵育用大腸桿菌16s基因的引物(表1)，未添加任何dna模板的條件下，用初步純化的taqdna聚合酶及市場上常見到的dna聚合酶直接做pcr，可以擴增出16s基因200bp片段，這說明初步純化的taqdna聚合酶及市場上常見到的dna聚合酶含有大腸桿菌dna汙染(圖1)。初步純化的taqdna聚合酶緩衝保存液轉換成1x核酸酶反應液(10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2，0.5mmcacl2，ph7.625℃)後，在100u的taqdna聚合酶中，約20微升，加入1微升(2u)abiturbotmdnase或2u廣譜核酸酶binuclease，37度直接孵育30分鐘後，再經過75度滅活10分鐘處理。孵育處理後的taqdna聚合酶1微升，未添加任何dna模板或添加大腸桿菌gdna的條件下，用大腸桿菌16s基因的引物，擴增200bp大腸桿菌16s基因片段。未添加任何dna模板條件下，未加核酸酶處理的與turbotmdnase處理的taqdna聚合酶都可以擴增出200bp大腸桿菌16s基因片段(圖2)。多次處理和加大turbotmdnase用量處理都得到同樣的結果。turbotmdnase不能很好地去除taqdna聚合酶中汙染的大腸桿菌gdna。無論未添加任何dna模板還是添加大腸桿菌gdna條件下，binuclease處理都不能擴增出200bp大腸桿菌16s基因片段(圖2)，binuclease沒有完全加熱滅活，殘留的binuclease會降解引物和加入的大腸桿菌gdna，從而可能引起不能擴增出200bp大腸桿菌16s基因片段的結果。表1：檢測大腸桿菌16s基因的引物。pcr產物大小是200bpe.coli16s353fgcagcagtggggaatattgce.coli16s552rcgcttgcaccctccgtatta實施例四：用鎳樹脂結合分離taqdna聚合酶法部分taqdna聚合酶的c端含有6個組氨酸標籤，可以結合鎳樹脂。1毫克taqdna聚合酶(1mg/ml)緩衝保存液轉換成1x核酸酶反應液(10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2，0.5mmcacl2，ph7.625℃)後，分別用不同單位的廣譜核酸酶binuclease(20u，40u，80u，160u，320u，640u)37度直接孵育30分鐘處理，具體處理方案見實施例三。分別加入50毫升鎳樹脂結合緩衝液(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)，再加入50微升的鎳樹脂，4度結合2小時，1000g離心沉澱鎳樹脂，用50毫升鎳樹脂結合緩衝液反覆離心洗滌4次，以充分除去殘留的廣譜核酸酶binuclease。再用1毫升鎳樹脂洗脫緩衝液(50mmnah2po4，300mmnacl，500mm咪唑ph8.0)洗脫出處理好的taqdna聚合酶。轉換成taqdna聚合酶儲存緩衝液後，然後儲存在-20℃。用0.5微升(約2.5u)處理好的taqdna聚合酶，以大腸桿菌16s基因的引物，擴增未添加任何dna模板和添加大腸桿菌gdna的pcr體系。適合的廣譜核酸酶binuclease用量應該是不能擴增未添加任何dna模板(除去了大腸桿菌dna)，但擴增可以添加大腸桿菌gdna。因為不同批次生產taqdna聚合酶中所含大腸桿菌gdna量的不同，每一批次的初步生產的taqdna聚合酶都需要用不同量的廣譜核酸酶binuclease小量測試，找到最佳廣譜核酸酶binuclease用量，然後放大該方法大批量去除初步生產的taqdna聚合酶中大腸桿菌gdna汙染(圖3)。本實施例也可以用如下的方法。1毫克taqdna聚合酶(1mg/ml)先結合到鎳樹脂柱或鎳樹脂懸浮後，再用1x核酸酶反應液(10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2，0.5mmcacl2，ph7.625℃)反覆衝洗幾次後，用含有不同單位的廣譜核酸酶binuclease(20u，40u，80u，160u，320u，640u)1x核酸酶反應液注入鎳樹脂柱或鎳樹脂懸浮，37度孵育30分鐘處理。用鎳樹脂結合緩衝液反覆離心洗滌4次，以充分除去殘留的廣譜核酸酶binuclease。再用鎳樹脂洗脫緩衝液(50mmnah2po4，300mmnacl，500mm咪唑ph8.0)洗脫出處理好的taqdna聚合酶。轉換成taqdna聚合酶儲存緩衝液後，然後儲存在-20℃。用0.5微升(約2.5u)處理好的taqdna聚合酶，以大腸桿菌16s基因的引物，按實施例二法檢測並確定最佳廣譜核酸酶binuclease用量。然後放大該方法大批量去除初步生產的taqdna聚合酶中大腸桿菌gdna汙染。本實施例所用到的鎳樹脂作為實例金屬，也可以用其他的二價金屬(例如ni，co，cu，fe)瓊脂糖樹脂或磁珠。實施例五：用分子篩或離子交換法去除廣譜核酸酶binuclease廣譜核酸酶binuclease的分子量大約30kda，而taqdna聚合酶分子量大約95kda，因此可以用適當的分子篩分離除去廣譜核酸酶binuclease。按實施例四方法，固定初步生產的taqdna聚合酶量，用不同單位的廣譜核酸酶binuclease處理，確定最佳廣譜核酸酶binuclease用量，然後放大該方法大批量去除初步生產的taqdna聚合酶中大腸桿菌gdna汙染。用不含甘油的taqdna聚合酶儲存緩衝液2x(100mmtris-hcl，ph7.9；100mmkcl，0.2mmedta，2mmdtt，1.0mmpmsf)預平衡superdex75或superdex200分子篩柱後，廣譜核酸酶binuclease處理後的taqdna聚合酶直接上樣分離除去binuclease。分子篩純化後的taqdna聚合酶，加等量的100％甘油，儲存在-20℃。最好採用superdex200，不僅可以分離除去binuclease，還可以分離分子量大於taqdna聚合酶的雜質。廣譜核酸酶binuclease的等電點是7.50，而本實施例中使用的上海默禮生物醫藥科技有限公司的taqdna聚合酶的等電點是6.08，在ph7.0緩衝液中時，廣譜核酸酶binuclease帶正電荷，而taqdna聚合酶卻帶負電荷，因此可以根據電荷的差異用離子交換法去除廣譜核酸酶binuclease。按實施例四方法，固定初步生產的taqdna聚合酶量，用不同單位的廣譜核酸酶binuclease處理，確定最佳廣譜核酸酶binuclease用量，然後放大該方法大批量去除初步生產的taqdna聚合酶中大腸桿菌gdna汙染。用100倍離子交換結合液(10mmtris-hcl，ph7.025℃)稀釋後，調ph至7.0。用離子交換結合液預平衡陰離子交換柱(如hiscreenqhp)，稀釋並調ph至7.0的taqdna聚合酶會結合到陰離子交換柱，而廣譜核酸酶binuclease因帶正電荷不能結合陰離子交換柱，直接流出陰離子交換柱。多次用離子交換結合液衝洗陰離子交換柱後，用離子交換洗脫液(10mmtris-hcl，1mnaci,ph7.025℃)梯度洗脫出處理好的taqdna聚合酶。用陰離子交換柱不僅可以除去廣譜核酸酶binuclease，還可以除去taqdna聚合酶中的其他一些雜質。也可以用陽離子交換柱(如hiscreensphp)除去廣譜核酸酶binuclease，因為taqdna聚合酶帶負電荷，不能結合陽離子交換柱，會直接從陽離子交換柱中流出，而廣譜核酸酶binuclease卻會結合陽離子交換柱。最佳方案是先通過陽離子交換柱，讓廣譜核酸酶binuclease結合陽離子交換柱上，再直接通過陰離子交換柱，讓taqdna聚合酶會結合到陰離子交換柱，讓遺漏的廣譜核酸酶binuclease直接流出，多次用離子交換結合液衝洗陰離子交換柱後，用離子交換洗脫液(10mmtris-hcl，1mnaci,ph7.025℃)梯度洗脫出處理好的taqdna聚合酶。這種組合即有效除去廣譜核酸酶binuclease，還可以除去taqdna聚合酶中的其他一些雜質。實施例六：偶聯廣譜核酸酶binuclease於固相介質法蛋白酶分子的一些功能團(如胺基-nh2)可以與固相支持物(活化的瓊脂糖樹脂珠，活化的珠狀丙烯醯胺和活化的磁珠等)表面反應基團之間化學共價鍵連接，這種連接鍵很牢固，因此在使用酶的過程中不會發生酶脫落，穩定性較好。市場上有多種成熟產品銷售。以nhs-活化瓊脂糖為例，將10ku廣譜核酸酶binuclease粉末溶入偶聯/洗滌緩衝液(0.1m磷酸鈉，0.15mnacl，ph7.2)中，加入到活化的幹樹脂中，並將反應混合物攪拌1小時，反應可以延長至2小時室溫或4℃過夜。在1000×g下離心1分鐘，去上清，添加耦合/洗滌緩衝液(樹脂的兩倍體積)，再在1000×g下離心1分鐘，去上清，重複此步驟一次。加入淬火緩衝液(1m乙醇胺或1mtris，ph7.4，樹脂體積的兩倍)，在室溫下混合15-20分鐘。用耦合/洗滌緩衝液(樹脂的兩倍體積)在1000×g下離心洗滌2次，用含0.05％疊氮化鈉或其他防腐劑的pbs儲存在4℃備用。取同等份的廣譜核酸酶binuclease耦合樹脂，用1x核酸酶反應液(10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2，0.5mmcacl2，ph7.625℃)反覆離心洗滌2次後，分別加入不同量的初步生產的taqdna聚合酶，37度直接孵育30分鐘處理，離心沉澱或通過含有網篩的濾過空柱分離廣譜核酸酶binuclease耦合樹脂與處理好的taqdna聚合酶。以大腸桿菌16s基因的引物，擴增未添加任何dna模板和添加大腸桿菌gdna的pcr體系。因為廣譜核酸酶binuclease耦合樹脂的量是一定的，適合量的初步生產的taqdna聚合酶應該是不能擴增未添加任何dna模板(除去了大腸桿菌dna)，但可以擴增添加大腸桿菌gdna。一旦最佳條件及用量確定後，放大比例，用於大量生產無核酸汙染的taqdna聚合酶。實施例五中，偶聯方法不僅僅局限於活法的固相介質粉中，也可以偶聯廣譜核酸酶binuclease於預裝活法的固相介質柱中，然後按上述方法確定最佳初步生產的taqdna聚合酶用量，然後放大該方法大批量去除初步生產的taqdna聚合酶中大腸桿菌gdna汙染。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。當前第1頁12