酶催化製備阿糖胞苷酯的方法
2023-04-29 16:50:41 2
專利名稱：酶催化製備阿糖胞苷酯的方法
技術領域：
本發明屬於生物催化與生物合成、生物醫藥以及材料領域，涉及一種在非水介質中酶催化製備阿糖胞苷酯的方法。
背景技術：
阿糖胞苷是一類非天然核苷，屬於脫氧胞嘧啶核苷類似物，具有很高的抗白血病活性，是臨床上用於治療急性骨髓性白血病最有效的化療藥物之一。阿糖胞苷酯類衍生物是阿糖胞苷的前藥之一，其通過醯化阿糖胞苷糖基部分的羥基而得。藥理學試驗結果表明，阿糖胞苷羧酸酯類衍生物比阿糖胞苷本身更適合於系統或者局部惡性腫瘤治療，尤其對於網狀內皮系統和中樞神經系統中的惡性腫瘤，療效更顯著。此外阿糖胞苷羧酸酯類衍生物在治療實體腫瘤中也表現出良好的活性，因此，其作為新型抗腫瘤藥物已引起了人們的廣泛關注。
目前阿糖胞苷羧酸酯類衍生物均採用化學法合成。其主要問題是糖環上羥基眾多，且反應活性相似，採用一般化學方法直接酯化時，區域選擇性很低，易產生大量的副產物，產物分離困難；為合成確定位置的醯化產物，需要對糖環特定羥基進行保護和去保護等操作，反應步驟多、工藝複雜；採用鹼性催化劑，易產生含鹼廢液，對環境造成嚴重汙染。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術工藝存在的問題，提供一種非水介質中酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其選擇性高，產物結構易控，反應副產物少，產物阿糖胞苷酯純度高，從而克服傳統化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產物純度低的缺點；本發明的非水介質中酶催化製備阿糖胞苷酯的方法是採用非水介質，以羧酸酯或者酸酐為醯基供體，利用酶催化阿糖胞苷進行醯化反應，合成得到阿糖胞苷酯。
本發明的方法更詳細地包括如下步驟(1)在反應器中依次加入阿糖胞苷、非水介質、羧酸酯或者酸酐；(2)按酶用量為100～4000U/克阿糖胞苷的比例加入酶，在溫度為25～60℃、振蕩速度為100～250rpm/min、反應1～48小時，分離得到阿糖胞苷酯。
所述非水介質包括有機溶劑體系或離子液含量為0～40％質量的有機溶劑和離子液混和體系，用量為0.5～10L/克阿糖胞苷；所述羧酸酯或者酸酐與阿糖胞苷的摩爾比為1.1∶1～2.0×103∶1。
所述酶是脂肪酶、蛋白酶或酯酶。
脂肪酶來源於Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucormiehei、Burkholderia acepacia、Pseudomonas fluorescens、Aspergillus niger、Mucor miehei、Porcine pancreas、或Human pancreas；蛋白酶來源於Aspergillusmelleus、Bacillus subilis、Bacillus lichemiformis；酯酶來源於Porcine liver。
5、根據權利要求3所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述羧酸酯中脂肪酸酯的碳鏈長度為C2～C24，含有0～6個雙鍵；芳香酯含有1個或1個以上苯環；酸酐的脂肪酸碳鏈長度為C3～C18。
所述有機溶劑包括烷烴類、醇類、酯類、醚類、酮類、含氮化合物溶劑中的一種或一種以上。
所述烴類指飽和烴、不飽和烴、芳烴類中的一種或一種以上；醇類指一元醇、多元醇中的一種或一種以上；醚類指脂肪族醚、芳醚、二噁烷、四氫呋喃中的一種或一種以上；酮類指脂肪族酮、芳酮中的一種或一種以上、含氮化合物溶劑指腈類、胺類、吡啶中的一種或一種以上。
第(2)步中，採用如下方法分離阿糖胞苷酯反應混合物經過濾除酶後，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後以甲醇、乙醇有機溶劑和乙酸乙酯重結晶或者經矽膠柱色譜分離純化，即得阿糖胞苷酯。
本發明與現有的技術相比具有如下的優點1.採用高效的生物催化劑酶來催化阿糖胞苷酯合成，酶催化反應具有高度選擇性，產物結構易控，反應副產物少，產物阿糖胞苷酯純度高，由於克服了傳統化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產物純度低的缺點；2.無須基團保護和去保護，反應過程簡單易控，產物易分離；3.反應條件溫和、環境友好。
具體實施例方式
實施例1將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、0.194g(2.26×10-3mol)乙酸乙烯酯、10L吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入200U來源於Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於30℃、100rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇重結晶，即得0.527g(90％)阿糖胞苷5』-乙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例2將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、918g(4.10mol)月桂酸乙烯酯、50mL吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源於Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於40℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應12h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙酸乙酯和甲醇溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以乙酸乙酯重結晶，即得0.77g(88％)阿糖胞苷5』-月桂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例3將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、197g(5.16×10-1mol)二十四碳酸甲酯、150mL N，N-二甲基甲醯胺的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入4000U來源於Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙酸乙酯和甲醇的混合液溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以乙酸乙酯重結晶，即得1.07g(88％)阿糖胞苷5』-二十四碳酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例4將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、44.3g(5.16×10-1mol)丙烯酸乙烯酯、5L吡啶和己烷的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入200U來源於Human pancreas的脂肪酶(250,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙酸乙酯溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以乙醇重結晶，即得0.528g(90％)阿糖胞苷5』-丙烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例5將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、1402g(4.10mol)4，7，10，，13，16，19-二十二烯酸甲酯、150mL吡啶和異丙醚的混合溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入4000U來源於Human pancreas的脂肪酶(250,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇重結晶，即得0.98g(87％)阿糖胞苷5』-二十二烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例6將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、282g(5.16×10-1mol)油酸酐、1L N，N-二甲基甲醯胺的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源於Mucor miehe的脂肪酶(1,000U/g)，常壓下置於60℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5』-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例7將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、29.4g(2.26×10-1mol)丙酸酐、150mL N，N-二甲基甲醯胺和辛烷的混和溶劑的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入4000U來源於Burkholderia acepaciai的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應4h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙酸乙酯和甲醇的混合液溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以乙酸乙酯重結晶，即得0.55g(90％)阿糖胞苷5』-丙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例8將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、33.4g(2.26×10-1mol)苯甲酸乙烯酯、150mL吡啶和乙睛的混和溶劑的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入1000U來源於Burkholderia acepaciai的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.643g(90％)阿糖胞苷5』-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例9將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、33.4g(2.26×10-1mol)苯甲酸乙烯酯、90mL吡啶和60mL離子液的混和溶液的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入600U來源於Thermomyces lanuginosus的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置於25℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應36h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.643g(90％)阿糖胞苷5』-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例10將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、145g(4.10×10-1mol)萘乙酸酐、120mL乙睛和30mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入1000U來源於Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置於60℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應4h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.761g(90％)阿糖胞苷5』-萘乙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例11將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、26.3g(2.05×10-1mol)戊酸乙烯酯、150mL四氫呋喃的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入300U來源於Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置於30℃、100rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.606g(90％)阿糖胞苷5』-戊酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例12將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、636g(2.05mol)硬脂酸乙烯酯、150mL吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入4000U來源於Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置於60℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，得0.924g(88％)阿糖胞苷5』-硬脂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例13將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、5.99g(2.05×10-2mol)的6，9，12-十八烯酸甲酯、90mL四氫呋喃和60mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入200U來源於Aspergillus melleus的蛋白酶(1，500U/g)，常壓下置於55℃、200rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.915g(88％)阿糖胞苷5』-十八烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例14將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、1.23g(2.26×10-3mol)油酸酐、105mL N，N-二甲基甲醯胺和45mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源於Porcine liver的酯酶(15,000U/g)，常壓下置於60℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5』-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例15將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、282g(5.16×10-1mol)油酸酐、105mL N，N-二甲基甲醯胺和45mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源於Porcine liver的酯酶(15,000U/g)，常壓下置於60℃、250rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5』-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例16將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、665g(4.10mol)肉桂酸甲酯、150mL N，N-二甲基甲醯胺和辛烷的混合溶劑的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源於Aspergillus melleus的蛋白酶(1,500U/g)，常壓下置於35℃、150rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.675g(88％)阿糖胞苷5』-肉桂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例17將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、334g(2.26×10-3mol)苯甲酸乙烯酯、150mL吡啶和叔丁醇的混合溶劑的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源於Aspergillus melleus的蛋白酶(1,500U/g)，常壓下置於35℃、150rpm的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應48h後，反應混合物經過濾除酶，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經過矽膠柱色譜分離純化，最後以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.714(90％)阿糖胞苷5』-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
權利要求
1.一種酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於採用非水介質，以羧酸酯或者酸酐為醯基供體，利用酶催化阿糖胞苷進行醯化反應，合成得到阿糖胞苷酯。
2.根據權利要求1所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)在反應器中依次加入阿糖胞苷、非水介質、羧酸酯或者酸酐；(2)按酶用量為100～4000U/克阿糖胞苷的比例加入酶，在溫度為25～60℃、振蕩速度為100～250rpm/min、條件下反應1～48小時，分離得到阿糖胞苷酯；所述非水介質包括有機溶劑體系或離子液含量為0～40％質量的有機溶劑和離子液混和體系，用量為0.5～10L/克阿糖胞苷；所述羧酸酯或者酸酐與阿糖胞苷的摩爾比為1.1∶1～2.0×103∶1。
3.根據權利要求1或2所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述酶是脂肪酶、蛋白酶或酯酶。
4.根據權利要求3所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述脂肪酶來源於Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucormiehei、Burkholderia acepacia、Pseudomonas fluorescens、Aspergillus niger、Mucor miehei、Porcine pancreas、或Human pancreas；蛋白酶來源於Aspergillusmelleus、Bacillus subilis、Bacillus lichemiformis；酯酶來源於Porcine liver。
5.根據權利要求3所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述羧酸酯中脂肪酸酯的碳鏈長度為C2～C24，含有0～6個雙鍵；芳香酯含有1個或1個以上苯環；酸酐的脂肪酸碳鏈長度為C3～C18。
6.根據權利要求3所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述有機溶劑包括烷烴類、醇類、酯類、醚類、酮類、含氮化合物溶劑中的一種或一種以上。
7.根據權利要求6所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於所述烴類指飽和烴、不飽和烴、芳烴類中的一種或一種以上；醇類指一元醇、多元醇中的一種或一種以上；醚類指脂肪族醚、芳醚、二噁烷、四氫呋喃中的一種或一種以上；酮類指脂肪族酮、芳酮中的一種或一種以上、含氮化合物溶劑指腈類、胺類、吡啶中的一種或一種以上。
8.根據權利要求5或6所述的酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，其特徵在於第(2)步中，採用如下方法分離阿糖胞苷酯反應混合物經過濾除酶後，真空蒸發濃縮，濃縮液真空乾燥後以甲醇、乙醇有機溶劑和乙酸乙酯重結晶或者經矽膠柱色譜分離純化，即得阿糖胞苷酯。
全文摘要
本發明涉及一種在非水介質中酶催化製備阿糖胞苷酯的方法，是在非水介質中，以羧酸酯或者酸酐為醯基供體，利用酶催化阿糖胞苷進行醯化反應，合成阿糖胞苷酯。本發明具有反應條件溫和、環境友好、反應具有高度區域選擇性和反應過程簡單可控、產物易分離的優點。
文檔編號C12P19/38GK1661030SQ20041007750
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月22日 優先權日2004年12月22日
發明者宗敏華 申請人:華南理工大學