一種製備美那諾坦的方法
2023-04-29 19:13:51
專利名稱：一種製備美那諾坦的方法
技術領域：
本發明屬於製藥技術領域,尤其是涉及一種製備美那諾坦(Afamelanotide)的方法。
背景技術：
研究證實，皮膚被曬黑或皮膚沉積色素可以保護光敏性皮膚病的人群免受日光和紫外線的傷害。黑色素細胞刺激激素(Melanocortin peptide hormone alpha-melanocytestimulating hormone, a-MSH)能夠使皮膚的黑素細胞產生黑色素,在光照誘導的曬黑反應過程中起重要作用。 1995年，美國專利US4457864公開了一系列包括美那諾坦在內的-MSH類似物。美 那諾坦分子結構式為乙醯基-L-絲氨醯-L-酪氨醯-L-絲氨醯-L-正亮氨醯-L-穀氨醯-L-組氨醯-D-苯丙氨醯-L精氨醯-L-色氨醯-甘氨醯-L-賴氨醯-L-脯氨醯-纈氨醯胺。美那諾坦是一種人工合成的-MSH類似物,最初由Arizona University研發，已證實可激活皮膚色素沉著，促使皮膚變黑，可緩解各種光線性皮膚病症狀。美那諾坦具有較強的日光防護作用，作用強度比天然a-MSH高近1000倍。2010年5月，義大利藥物管理局批准美那諾坦用於治療紅細胞生成性原卟啉徵導致的光敏性疾病。目前國內還沒有關於美那諾坦合成工藝方法的報導；國外關於美那諾坦合成工藝的報導，如PNAS77 (10) : 5754-5758，採用Boc固相合成工藝，操作複雜，收率僅為25%，在合成過程中使用了大量腐蝕性強的三氟乙酸和氫氟酸，不利於工業生產、應用價值不高。
發明內容
本發明的目的在於提供一條較適當的固相合成法合成美那諾坦路線，有利於產業化生產，成本低、操作方便、對環境影響小、收率高。為實現上述目的，本發明採取以下技術方案
一種製備美那諾坦的方法，其特徵在於，包括以下步驟
1)由Fmoc-L-Val-OH和氨基樹脂為起始原料，氨基樹脂經脫保護後與Fmoc-L-Val-OH偶聯得到Fmoc-L-Val-氨基樹脂；
2)將Fmoc-L-Val-氨基樹脂採用固相合成方法按美那諾坦的多肽序列逐一偶聯得到N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂；
3)N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂經與乙酸酐/吡啶反應生成含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂；
4)裂解含側鏈保護基團的美那諾坦氨基樹脂，純化、凍幹得到美那諾坦。其中所述氨基樹脂選自Sieber樹脂、Rink Amide樹脂、Rink Amide-MBHA樹脂、Rink Amide-BHA樹脂和Rink Amide-AM樹脂中的任一種，優選為Rink Amide樹脂。所述氨基樹脂取代度為0. I mmol/g-1. 6 mmol/g，優選氨基樹脂取代度為0. 3mmol/g-0. 8 mmol/g。
其中，所述的步驟I為Fmoc-L-Val_0H和氨基樹脂在偶聯劑和有機鹼的作用下，在反應溶劑中生成Fmoc-L-Val-氨基樹脂；所述的偶聯劑包括DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt 或 TBTU/HOBt，優選偶聯劑為 HBTU/HOBt 或 HATU/HOAt ;所述的有機鹼包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應溶劑包括NMP和/或DMF。其中〃/〃表示〃和〃的含義。實驗發現，本發明的偶聯劑能夠明顯提高反應速率，同時HBTU/HOBt偶聯體系顯著的降低生產成本並提高收率。所述步驟3中反應採用等摩爾數的乙酸酐和吡啶作為反應物，乙酸酐和吡啶的摩爾總用量為樹脂取代摩爾數的I. 5-100倍，優選為10-30倍。
本發明要求保護的方法，所述步驟4中，裂解含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂採用的裂解試劑為TFA/H20、TFA/H20/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT 或 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT ;優選體積比為 95/5 的 TFA/H20,體積比為 95/2. 5/2. 5的 TFA/H20/TIS,體積比為 90/5/3/2 的 TFA/thioanisole/anisole/EDT,或體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。
更具體的，本發明所述的製備方法優選包括如下步驟
所述的步驟I為將氨基樹脂置於反應器中，經NMP洗滌溶脹後；將體積比1:4的哌啶NMP溶液加至溶脹的氨基樹脂中脫除氨基樹脂上的Fmoc保護基；加入相當於氨基樹脂用量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Val-0H、l. 5-10倍量的H0Bt、l. 5-10倍量的HBTU，加入體積為足以溶解上述溶質的NMP溶解，完全溶解後加入相當於氨基樹脂用量3-20倍量的DIPEA至反應器中反應l_20h，反應結束後量取相當於氨基樹脂用量5-100倍量的乙酸酐、相當於氨基樹脂用量5-100倍量的吡啶混合於NMP中，加入反應器中反應l-10h，洗滌得Fmoc-Val-氨基樹脂。所述的步驟2為將體積比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Val-氨基樹脂中進行脫保護反應；加入相當於氨基樹脂用量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Pro-OHU. 5-10倍量的HOBtU. 5-10倍量的HBTU，加入體積為足以溶解上述溶質的NMP溶解，完全溶解後加入相當於氨基樹脂用量3-20倍量的DIPEA混合均勻後加入反應器中反應l_20h ;反應結束後洗滌產物，再按美那諾坦的多肽序列逐個偶聯胺基酸，各胺基酸及偶聯試劑的用量同上，依次完成 Fmoc-L-Lys (Boc) _0H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Trp (Boc) -0H> Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H>Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-L-His(Trt)-0H> Fmoc-L-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-L-Nle_0H、Fmoc-L-Ser (tBu) -0H、Fmoc_L-Tyr (tBu) -0H>Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 的偶聯,得到 N 端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂。所述的步驟3為將N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂經洗滌後投入反應器，相當於氨基樹脂用量5-100倍量的乙酸酐、相當於氨基樹脂用量5-100倍量的吡啶混合於等體積的NMP中，加入反應器中反應l-10h，得到含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂。所述的步驟4為向含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂中加入體積比為82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT 的裂解試劑，冰浴反應 0. I-Ih 後，室溫下繼續攪拌反應l-10h，然後抽濾。抽濾後將裂解試劑濾液利用旋轉蒸發和/或N2氣吹至無TFA溢出，加入3-100倍量的沉澱試劑靜置；離心分離沉澱的粗肽，粗肽經純化、凍幹得美那諾坦。該步驟中，對含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂進行裂解、沉澱得到的粗肽，其沉澱試劑包括乙醚、環己烷、石油醚、乙醚/石油醚(體積比為1:10-10:1)、乙醚/環己烷(體積比為1:10-10:1)，優選乙醚或體積比為1:1的乙醚/石油醚，更優選冰乙醚。本發明中，美那諾坦是通過對含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂進行裂解，得到的粗肽經過高壓液相色譜純化、凍幹得到。此外，本發明中，縮略語的解釋如下
NMM N-甲基嗎啡啉；
DIC N, N』 - 二異丙基碳二醯亞胺；
HBTU :苯並三氮唑-N，N，N』，N』 -四甲基脲六氟磷酸鹽；
HOBt :1_羥基苯並三唑；
DMF :二甲基甲醯胺；
NMP :1-甲基-吡咯烷酮；
DCM :二氯甲烷；
TFA :三氟乙酸；
TNBS :2 4 6-三硝基苯磺酸；
DIPEA N, N- 二異丙基乙基胺；
TIS :三異丙基矽烷；
Thioanisole :甲基苯基硫釀；
Anisole :苯甲釀；
EDT 1,2-乙二硫醇；
Phenol :苯酌■； h為時間單位小時。採用上述技術方案，本發明能夠製備得到一種純度高於83%的美那諾坦，此外，本發明製備採用了 Fmoc固相合成方法，該方法與原有報導的Boc固相合成方法相比，操作簡單，合成過程中避免了大量使用腐蝕性強的三氟乙酸和氫氟酸，有利於工業生產和環境保護，有效降低生產成本，純度83%，合成收率60%，遠高於報導的25%收率。具有廣泛的應用前景和可觀的經濟實用價值。適宜工業化推廣應用。
圖I本發明實施例I所述製備方法反應路線圖。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，由於篇幅所限，此處只列舉了最具代表性的實施方式，雖然本發明所涉及的各反應條件及其具體參數未一一體現在具體實施方式
中，但本領域技術人員依然可以預見，說明書中給出的各反應條件均能夠實現本發明。實施例I
如圖I所示，本發明要求保護的製備方法包括如下步驟
步驟一、Fmoc-L-Val-Rink Amide 樹脂製備I、將IOg取代度為0.6 mmol/g的Rink Amide樹脂置於反應器中，加入NMP洗滌兩次，隨後採用NMP溶脹Ih。2、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至溶脹的Rink Amide樹脂中，脫除Rink Amide樹脂上的Fmoc保護基，脫除完畢用NMP洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。3、稱取6. Ilg Fmoc-L-Val-OH,2. 43g H0Bt、6. 83g HBTU，加入54ml NMP溶解，完全溶解後加入6. 27ml DIPEA，混合均勻後加入反應器中開始反應。4、反應6h，結束反應，NMP洗滌三次，量取7. 6ml乙酸酐、6. 5ml吡啶混於40ml NMP中，加入反應器中反應2h，用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，直接用於下
一步氣基酸偶聯。 步驟二、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的製備 I、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至Fmoc-L-Val-Rink Amide樹脂中,進行脫保護反
應，反應後用NMP進行洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次。2、稱取 6.07g Fmoc-L-Pro-OH, 2. 43g H0Bt、6. 83g HBTU，加入 54ml NMP 溶解，完全溶解後加入6. 27ml DIPEA，混合均勻後加入反應器中開始反應。3、反應4h結束反應。4、反應結束，NMP進行洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，按美那諾坦的多肽序列逐個偶聯胺基酸，依次完成 Fmoc-L-Lys (Boc) -OH>Fmoc~GIy-OH>Fmoc-L-Trp (Boc) -OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-His (Trt) -0H> Fmoc-L-Glu (OtBu) -0H>Fmoc-L-Nle_0H、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L_Tyr (tBu) -0H>Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 的偶聯。步驟三、N端乙醯化反應
I、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。量取11.4ml乙酸酐、9. 8ml吡啶混於40ml NMP中，加入反應器中反應2h，得到含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂，用NMP進行洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌抽乾待用。步驟四、含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的裂解
I、配製裂解試劑按 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT 體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 配製，放置於4°C冷藏保存。2、稱取抽乾的IOg含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂至另一反應器中，加入50ml裂解試劑，冰浴反應0. 5h後，室溫下繼續攪拌反應2h。3、反應結束，抽濾裂解試劑，向濾液中倒入IL的冰乙醚，靜置6h。4、離心分離沉澱的粗肽，沉澱用冰乙醚洗滌3次，用體積百分數為0. 1%的TFA的水溶液溶解，冷凍後置於冷凍乾燥機上乾燥至恆重，得白色粗肽4. 38g，純度83%，合成收率60%。實施例2
如圖I所示，本發明要求保護的製備方法包括如下步驟
步驟一、Fmoc-L-Val-Rink Amide 樹脂製備
I、將30g取代度為0. I mmol/g的Rink Amide樹脂置於反應器中，加入NMP洗滌兩次，隨後採用NMP溶脹Ih。2、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至溶脹的Rink Amide樹脂中，脫除Rink Amide樹脂上的Fmoc保護基，脫除完畢用NMP洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。3、稱取 10.2g Fmoc-L-Val-OH,4. 05g HOBtUI. 4g HBTU，加入80ml NMP溶解，完全溶解後加入10. 5ml DIPEA，混合均勻後加入反應器中開始反應。4、反應lh，結束反應，NMP洗滌三次，量取3. 8ml乙酸酐、3. 3ml吡啶混於70ml NMP中，加入反應器中反應2h，用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，直接用於下
一步氣基酸偶聯。步驟二、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的製備 I、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至Fmoc-L-Va l-Rink Amide樹脂中,進行脫保護反
應，反應後用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。2、稱取 10. Ig Fmoc-L-Pro-OH,4. 05g H0Bt、ll. 4g HBTU，加入80ml NMP溶解，完全溶解後加入10.5ml DIPEA，混合均勻後加入反應器中開始反應。3、反應Ih結束反應。4、反應結束，NMP進行洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，按美那諾坦的多肽序列逐個偶聯胺基酸，依次完成 Fmoc-L-Lys (Boc) -OH > Fmo c~G I y-OH > Fmo c-L-T rp (Boc) -OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-His (Trt) -0H> Fmoc-L-Glu (OtBu) -0H>Fmoc-L-Nle_0H、Fmoc-L-Ser (tBu) -0H、Fmoc_L-Tyr (tBu) -0H>Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 的偶聯。步驟三、N端乙醯化反應
I、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。量取28. 5ml乙酸酐、24. 5ml吡啶混於50ml NMP中，加入反應器中反應10h，得到含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂，用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，抽乾待用。步驟四、含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的裂解
I、配製裂解試劑按TFA/thioanisole/anisole/EDT體積比為90/5/3/2配製，放置於4°C冷藏保存。2、稱取抽乾的20g含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂至另一反應器中，加入50ml裂解試劑，冰浴反應0. 5h後，室溫下繼續攪拌反應IOh。3、反應結束，抽濾裂解試劑，向濾液中倒入200mL的冰乙醚，靜置6h。4、離心分離沉澱的粗肽，沉澱用冰乙醚洗滌3次，用體積百分數為0. 1%的TFA的水溶液溶解，冷凍後置於冷凍乾燥機上乾燥至恆重，得白色粗肽。實施例3
如圖I所示，本發明要求保護的製備方法包括如下步驟
步驟一、Fmoc-L-Val-Rink Amide 樹脂製備
I、將5g取代度為1.6 mmol/g的Rink Amide樹脂置於反應器中，加入NMP洗滌兩次，隨後採用NMP溶脹Ih。2、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至溶脹的Rink Amide樹脂中，脫除Rink Amide樹脂上的Fmoc保護基，脫除完畢用NMP洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。3、稱取4.07g Fmoc-L-Val-OHU. 62g H0Bt、4. 55g HBTU，加入36ml NMP溶解，完全溶解後加入4. 18ml DIPEA,混合均勻後加入反應器中開始反應。4、反應20h，結束反應，NMP洗滌三次，量取7. 6ml乙酸酐、6. 5ml吡啶混於40ml NMP中，加入反應器中反應2h，用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，直接用於下
一步氣基酸偶聯。步驟二、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的製備
I、將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至NMP洗漆乾淨的Fmoc-L-Val-Rink Amide樹脂
中，進行脫保護反應，反應後用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。2、稱取4.05g Fmoc-L-Pro-OHU. 62g H0Bt、4. 55g HBTU，加入36ml NMP溶解，完全溶解後加入4. 18ml DIPEA,混合均勻後加入反應器中開始反應。
3、反應20h結束反應。4、反應結束，NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次，按美那諾坦的多肽序列逐個偶聯胺基酸，依次完成 Fmoc-L-Lys (Boc) -OH > Fmo c~G I y-OH > Fmo c-L-T rp (Boc) -OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-His (Trt) -0H> Fmoc-L-Glu (OtBu) -0H>Fmoc-L-Nle_0H、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L_Tyr (tBu) -0H>Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 的偶聯。步驟三、N端乙醯化反應
I、N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂用NMP進行洗滌3次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌2次。量取76ml乙酸酐、65ml吡啶混於20ml NMP中，加入反應器中反應lh，得到含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂，用NMP進行洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌抽乾待用。步驟四、含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂的裂解
I、配製裂解試劑按TFA/H20/TIS體積比為95/2. 5/2. 5配製，放置於4°C冷藏保存。2、向抽乾的含側鏈保護基團的美那諾坦-Rink Amide樹脂加入20ml裂解試劑，冰浴反應0. 5h後，室溫下繼續攪拌反應Ih。3、反應結束，抽濾裂解試劑，向濾液中倒入400mL的冰乙醚，靜置6h。4、離心分離沉澱的粗肽，沉澱用冰乙醚洗滌3次，用體積百分數為0. 1%的TFA的水溶液溶解，冷凍後置於冷凍乾燥機上乾燥至恆重，得白色粗肽14. Og，純度53%，合成收率56%。實施例4
與實施例I相比，區別點僅在於，本實施例中氨基樹脂為取代度為0. I mmol/g的Sieber 樹脂。步驟I中採用的偶聯劑為所述的偶聯劑為HATU/HOAt ;有機鹼為TMP ;反應溶劑為NMP/DMF。步驟4中，裂解試劑為體積比為95/5的TFA/H20。
本實施例所得產物純度為55%，合成收率54%。實施例5
與實施例I相比，區別點僅在於，本實施例中氨基樹脂為取代度為0. 3 mmol/g的RinkAmide-MBHA樹脂。步驟I中採用的偶聯劑為所述的偶聯劑為DIC/HOBt，有機鹼為NMM，反應溶劑為DMF。步驟4中，裂解試劑為體積比為95/2. 5/2. 5的TFA/H20/TIS。
本實施例所得產物純度為58%，合成收率57%。實施例6
與實施例I相比，區別點僅在於，本實施例中氨基樹脂為取代度為0. 8 mmol/g的RinkAmide-BHA樹脂。步驟I中採用的偶聯劑為PyB0P/H0Bt，有機鹼為DIPEA，反應溶劑為DMF。步驟4中，裂解試劑為體積比為90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT。
本實施例所得產物純度為61%，合成收率57%。實施例I
與實施例I相比，區別點僅在於，本實施例中氨基樹脂為取代度為I. 2 mmol/g的RinkAmide-AM樹脂。步驟I中採用的偶聯劑為TBTU/HOBt，有機鹼為NMM，反應溶劑為NMP。步驟 4 中，裂解試劑為體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。
本實施例所得產物純度為67%，合成收率56%。雖然，上文中已經用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的 範圍。
權利要求
1.一種製備美那諾坦的方法，包括以下步驟 1)由Fmoc-L-Val-OH和氨基樹脂為起始原料，氨基樹脂經脫保護後與Fmoc-L-Val-OH偶聯得到Fmoc-L-Val-氨基樹脂； 2)將Fmoc-L-Val-氨基樹脂採用固相合成方法按美那諾坦的多肽序列逐一偶聯得到N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂； 3)N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂經乙醯化反應生成含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂； 4)裂解含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂，純化、凍幹得到美那諾坦。
2.根據權利要求I所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述氨基樹脂選自Sieber樹脂、Rink Amide 樹脂、Rink Amide-MBHA 樹脂、Rink Amide-BHA 樹脂和 Rink Amide-AM 樹脂的任一種，優選為Rink Amide樹脂。
3.根據權利要求I所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述氨基樹脂取代度為O.I mmol/g-1. 6 mmol/g,優選氨基樹脂取代度為 O. 3 mmol/g-0. 8 mmol/g。
4.根據權利要求I所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述的步驟I中，Fmo c -L-Va I-OH和脫保護後的氨基樹脂在偶聯劑和有機鹼的作用下,在反應溶劑中生成Fmoc-L-Val-氨基樹脂；所述的偶聯劑包括 DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt或TBTU/HOBt，優選偶聯劑為HBTU/HOBt或HATU/HOAt ;所述的有機鹼包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應溶劑包括NMP和/或DMF。
5.根據權利要求I所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述步驟3中乙醯化反應採用等摩爾數的乙酸酐和吡啶作為反應物，乙酸酐和吡啶的摩爾總用量為樹脂取代摩爾數的I. 5-100倍，優選為10-30倍。
6.根據權利要求I所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述步驟4中，裂解試齊U 為TFA/H20、TFA/H20/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT 或 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT ;優選體積比為 95/5 的 TFA/H20，體積比為 95/2. 5/2. 5 的 TFA/H20/TIS，體積比為 90/5/3/2 的 TFA/thioanisole/anisole/EDT,或體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。
7.根據權利要求1-6任一項所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述的步驟I為將氨基樹脂置於反應器中，經NMP洗滌溶脹後；將體積比1:4的哌啶NMP溶液加至溶脹的氨基樹脂中脫除氨基樹脂上的Fmoc保護基；加入相當於氨基樹脂用量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Val-OH, I. 5-10倍量的H0Bt、l. 5-10倍量的HBTU，加入體積為足以溶解上述溶質的NMP溶解，完全溶解後加入相當於氨基樹脂用量3-20倍量的DIPEA至反應器中反應l_20h，反應結束後量取相當於氨基樹脂用量5-100倍量的乙酸酐、相當於氨基樹脂用量5-100倍量的吡啶混合於NMP中，加入反應器中反應Ι-lOh，洗滌得Fmoc-L-Val-氨基樹脂。
8.根據權利要求1-6任一項所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述的步驟2為將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至Fmoc-L-Val-氨基樹脂中進行脫保護反應；加入相當於氨基樹脂用量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Pro-0H、l. 5-10倍量的H0Bt、l. 5-10倍量的HBTU，力口入體積為足以溶解上述溶質的NMP溶解，完全溶解後加入相當於氨基樹脂用量3-20倍量的DIPEA混合均勻後加入反應器中反應l-20h ;反應結束後洗滌產物，再按美那諾坦的多肽序列逐個偶聯胺基酸，各胺基酸及偶聯試劑的用量同上，得到N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂。
9.根據權利要求1-6任一項所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述的步驟3為將N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂經洗滌後投入反應器，相當於氨基樹脂用量5-100倍量的乙酸酐、相當於氨基樹脂用量5-100倍量的吡啶混合於適量的NMP中，加入反應器中反應Ι-lOh，得到含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂。
10.根據權利要求1-6任一項所述製備美那諾坦的方法，其特徵在於所述的步驟4為向含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂中加入體積比為82. 5/5/5/5/2. 5的TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT的裂解試劑，冰浴反應O. I-Ih後，室溫下繼續攪拌反應Ι-lOh，然後抽濾；抽濾後將裂解試劑濾液利用旋轉蒸發和/或N2氣吹至無TFA溢出，加入3-100倍量的沉澱試劑靜置；離心分離沉澱的粗肽，粗肽經純化、凍幹得美那諾坦。
全文摘要
本發明公開了一種製備美那諾坦的方法，包括以下步驟1)由Fmoc-L-Val-OH和氨基樹脂出發，得到Fmoc-L-Val-氨基樹脂；2)將Fmoc-L-Val-氨基樹脂採用固相合成方法按美那諾坦的多肽序列順序逐一偶聯得到N端為游離氨基的含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂；3)乙醯化反應生成含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂；4)採用裂解試劑裂解含側鏈保護基團的美那諾坦-氨基樹脂，冰乙醚沉澱得到粗肽；粗肽經過純化、凍幹得到美那諾坦。本發明採用的製備美那諾坦的工藝方法具有廣泛的應用前景和可觀的經濟實用價值。
文檔編號C07K1/04GK102816211SQ20121033102
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者朱頤申, 周雲隆, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學