一種採用動物血清發酵製備的富硒微生物製劑及製備方法

2023-04-29 14:15:26

一種採用動物血清發酵製備的富硒微生物製劑及製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種採用動物血清發酵製備的富硒微生物製劑，原料按重量份計由如下成分組成：亞硒酸鈉8-15份，動物血水解液50-65份，複合微量元素5-15份，磷酸二氫鉀8-20份，尿素10-25份，蛋白腖8-20份，酵母粉4-10份，NaCl 8-20份，NaOH 8-15份，NaNO34-10份，NaCl 10-25份，NH4Cl 4-10份，K2HPO48-20份，牛肉膏4-10份，葡萄糖10-25份，澱粉10-25份，碳酸鈣8-20份，胺基酸10-25份，硝酸鉀2-6份，硫酸亞鐵2-6份，硫酸鎂10-25份，檸檬酸三鈉25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份；本發明的富硒微生物製劑的製備方法，發酵時間短，通過增加發酵過程中微生物的增殖速度，菌劑的保存期可以延長至2年。
【專利說明】一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑及製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種富砸營養型微生物肥料，具體是一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑及製備方法，屬於生物肥料【技術領域】。

【背景技術】
[0002]我國是一個缺砸大國。普查證明，我國70%以上的地區土壤中嚴重缺砸，我國95%以上的糧食和畜禽肉類中砸含量低於50 μ g/kg，屬於貧砸大國。我國人均每天砸攝入量僅有39 μ g左右，不足成年人勝利需要最小量50 μ g/天的80%，距離健康需要量100?200 μ g/天相差更大；距離安全上線800 μ g更遠。在我國，除少數地區外，90 %的人口需要採用生物工程技術補充砸。不僅人要補充砸，畜禽也要補充砸。
[0003]我國是農業大國，化肥在我國農業生產中起到了重要的作用。但是，隨著單位面積的化肥用量越來越高，出現了嚴重的土地「越餵越瘦」的情景。與之相伴的不僅僅是土壤的退化、農藥施用量的增加與農產品品質的下降，還有近40%的地下水因為硝酸鹽含量太高不能直接飲用。因此，開發環境友好型肥料是我國的發展戰略。富砸微生物菌肥因其具有土壤性能改良、農作物增產、農產品品質改善、肥力持久及環境友好等優點，而受到廣泛關注。微生物肥料迄今已有一百多年的歷史，己在亞洲、美洲、歐洲和非洲等世界上60多個國家推廣應用。近年來美、英、法、日等發達國家，加大了微生物菌肥的研發投入，得到了種類更加豐富，性能更加優良的功能化微生物菌肥，替代了大約40%的化肥使用量。我國也高度重視綠色肥料的開發與應用，微生物肥料產業取得了一定發展，生產企業超過800家，年產量近千萬噸，年產值過百億元，但是與同期化肥的產量和用量相比，僅佔不足5% ο但是隨著人們對生活品質要求的提高，開發綠色無汙染食品的呼籲越來越高，這種社會需求將導致微生物肥料的市場需求量越來越大。
[0004]砸為人體所必需的營養微量元素之一。人或動物缺少或攝入過量的砸，則會引起某些疾病，如缺砸地區的克山病、大骨節病、心肌病、癌症等發病率很高。研宄和實踐證明，砸元素對人體健康發揮著內在的關鍵作用，它是穀胱甘肽過氧化酶、硫氧還蛋白還原酶和減碘酶等內源性抗氧化劑的關鍵成分一一激活劑。它對於調節人體免疫系統、抵禦疾病、延緩衰老、預防和輔助治療癌症等多種疾病發揮著重要作用，特別是在清除脂質自由基方面是其他抗氧化劑不可比擬和替代的。
[0005]砸是近幾十年來才被發現的對人體健康極為重要的、不可缺少的、具有全局作用的內源性強抗氧化物質和自由基清除劑。聯合國世界衛生組織WHO宣布:砸是人生命中必須的微量元素，砸被國內外醫藥界尊稱為「生命的火種」，享有「長壽元素」、「抗癌之王」、「心臟守護神」、「天然解毒劑」等美譽。砸已被科技界公認為「有助於人類免除各種病痛的折磨，如不良情緒、胰臟疾病、糖尿病、生殖系統疾病、病毒感染和癌症等。」有報導，血液中含砸量最低的人死於心臟病的概率是含量高者的3倍。砸能使人體的免疫系統重新恢復活力。砸可排出體內重金屬毒素，砸在體內是以砸氨酸的形式組成砸蛋白，砸蛋白遇到鉛、汞、鎘、蛇等有害金屬灰迅速結合變成無害化合物而排出體外。砸是體內碘的調節劑，它在甲狀腺激素代謝過程中對碘起著非常重要的調節作用。與砸結合的還有一種非常重要的抗氧化酶一一硫氧還蛋白還原酶，具有很多生物學功能，影響著核酸的合成。砸預防不孕不育，特別是預防男性死精、精子減少等症狀，不少資料顯示，今天不孕不育症與缺砸有直接關係。
[0006]人與動物攝入砸的途經主要靠含砸的食物來保證，因此，富砸殼聚糖微生物製劑的製備以及富砸產品的種植是極為重要的。
[0007]可以被人體所吸收的砸分為元素砸、無機砸和有機砸三種。砸的特點是生物活性和毒性之間範圍極端狹窄，為此，各國科學家研宄了許多砸化合物，試圖尋找活性高、毒性低的砸形式。隨著納米技術的成熟，科學家採用先進的納米技術，將零價砸(元素砸的一種)製成納米顆粒砸一納米砸。納米砸與一般零價砸相比，發生了生物性質的突變。具體以下特點:1)具有抗氧化性；2)由於高活性的特性，因而對人體的危害性大大減少，可以補充低劑量砸相當於以前高劑量的營養含量，從而避免了給人體帶來的副作用。所以納米砸使砸的物質結構由原來分子態的化合物變成了納米態的零價物質，不僅使人體充分吸收砸、降低了其毒性，而且還具備較好的生物活性。
[0008]中國專利文獻CN 102348516A(申請號:201110205067.5)公開一種植物葉面吸收的高效濃縮富砸劑，其中含有高濃度砸溶液，胺基酸營養素，促吸收劑及至少為脲、磷酸鹽、硫酸鹽、葡萄糖、焦糖之一或幾種組合的輔助營養物質；其中所述高濃度砸溶液為含砸化合物的水溶液，以砸元素質量百分含量計濃度為0.1%-30%M/V?應用實施本發明高效濃縮富砸劑，較之於現有普通富砸溶液在同等環境下葉面噴施的生產富砸農作物產品效率提高了 50%;成本降低了 30%;且產量增產3-8%;可使農作物產品含砸量提高到110yg/kg。但該富砸製劑中砸以無機砸鹽形式存在，無機砸鹽生物活性低，不具有抗氧化性，人體對無機砸鹽吸收率很小，食用過量對人體有一定毒性，增加了對人體的危害性。
[0009]血清，指血液凝固後，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營養物質、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用。其分為胎牛血清、幹細胞培養胎牛血清、特殊用途胎牛血清、胎牛血清替代物、小牛血清、新生牛血清、加強型小牛血清、補鐵小牛血清、成牛血清、供體馬血清、兔血清、雞血清、豬血清、馬血清、其他動物血清、合成血清替代品。它主要由水和各種化學成分組成，這些化學成分包括白蛋白、0 1、(!2、|3、丫-球蛋白，甘油三酯，總膽固醇，谷丙轉氨酶等。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。血清中含多種蛋白質(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等)、多種金屬離子、激素、促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等、各種生長因子、轉移蛋白、不明成分。
[0010]血清可以提供基本營養物質:胺基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。提供結合蛋白:結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。對培養中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如Se03，砸等。


【發明內容】

[0011]針對現有技術的不足，本發明提供一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑及製備方法，本發明的富砸微生物製劑中含有單質砸，且單質砸為納米級，無毒性，對人體沒有危害，對有害重金屬有拮抗作用，對於蔬菜中的硝酸鹽有降解作用，可與其他肥料混用，穩定性好，加水施用於植物葉面，達到穀物、蔬菜、果實的富砸目的。而且其含有大量微生物以其生命活動及其代謝產物導致農作物得到特定肥料效應、生長調節效應、防病蟲效應和土壤生物修復等效應的農業產品。這種富砸營養型微生物肥料，它能改良土壤，增加土壤微生物的數量，提高果蔬植物的抗病、抗逆能力，提高肥料利用率等優點。
[0012]本發明的技術方案如下:
[0013]一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，原料按重量份計由如下成分組成:
[0014]亞砸酸鈉8-15份，動物血水解液50-65份，複合微量元素5_15份，磷酸二氫鉀8-20 份，尿素 10-25 份，蛋白腖 8-20 份，酵母粉 4-10 份，NaCl 8-20 份，NaOH 8-15 份，NaNO34-10 份，NaCl 10-25 份，NH4Cl 4-10 份，K2HPO4 8-20 份，牛肉膏 4-10 份，葡萄糖 10-25 份，澱粉10-25份，碳酸鈣8-20份，胺基酸10-25份，硝酸鉀2_6份，硫酸亞鐵2_6份，硫酸鎂10-25份，檸檬酸三鈉25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份；
[0015]所述的動物血水解液是以未凝固的動物血為原料，經升溫至75-80°C，加入水解酶水解8-15h ;水解後升溫至120°C，保溫l_2h進行滅酶；滅酶後，降溫至常溫後製得，所述的混合菌液為解澱粉芽孢桿菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌液、蘇雲金芽孢桿菌菌液和膠質芽孢桿菌菌液的混合液。
[0016]本發明優選的，一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，原料按重量份計由如下成分組成:
[0017]亞砸酸鈉12-13份，動物血水解液60-62份，複合微量元素8-10份，磷酸二氫鉀10-15份，尿素15-18份，蛋白腖10-15份，酵母粉6-8份，NaCl 10-15份，NaOH 10-12份，NaN036-8 份，NaCl 15-20 份，NH4Cl 4-10 份，K2HPO4 12-18 份，牛肉膏 6-8 份，葡萄糖 15-20份，澱粉15-20份，碳酸鈣12-18份，胺基酸16-20份，硝酸鉀3_5份，硫酸亞鐵3_5份，硫酸鎂13-22份，檸檬酸三鈉30-35份，生化酶18-25份，混合菌液820-830份。
[0018]本發明優選的，所述混合菌液是通過以下方法製備得到:
[0019](I)將解澱粉芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，製得解澱粉芽孢桿菌菌液；發酵液原料組成:8-10%大豆粉，4-7%糖蜜，3-5%澱粉，餘量為水，按重量百分比計；
[0020](2)將枯草芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，即得枯草芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:大豆粉4-7 %，葡萄糖4-8 %，磷酸氫二鉀1-2 %，酵母膏1-2 %，硫酸鎂0.02-0.05 %，碳酸鈣0.3-0.6%，餘量為水，按重量百分比計；
[0021](3)將地衣芽孢桿菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，即得地衣芽孢桿菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12-20 %，玉米澱粉8-12 %，葡萄糖5-8 %，餘量為水，按重量百分比計；
[0022](4)將蘇雲金芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38°C下有氧發酵24-48h，即得蘇雲金芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12-18%，氫氧化鉀3-5%，磷酸2-4%，尿素1_3%，牛肉膏0.5_2%，硫酸鎂0.1-0.2%，硫酸鋅0.1-0.2%，餘量為水，按重量百分比計；
[0023](5)將膠質芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，即得膠質芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:玉米澱粉8-12 %，牛肉膏1-2 %，葡萄糖1-3 %，蛋白腖0.5-1 %，碳酸鈣0.5-1 %，磷酸氫二鉀0.5-1 %，硫酸鎂0.02-0.05 %，餘量為水，按重量百分比計；
[0024](6)按體積比將解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液按(1-6):(1-3):(1-2):(1-2):(1-2)的比例混合混勻，即得混合菌液。
[0025]進一步優選的，解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液的體積比為:(2-4): (2-3):2:2:2。
[0026]進一步優選的，步驟⑴、⑵、(3)、(4)、(5)中使用的發酵液均於110°C?120°C下滅菌2?3小時，冷卻後再進行接種。
[0027]本發明優選的，步驟⑴、(2)、(3)、⑷、(5)中有氧發酵時間45_48h。
[0028]本發明優選的，所述的解澱粉芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml，枯草芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?160億個/ml，地衣芽孢桿菌液中活菌含量為120?150億個/ml，蘇雲金芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml，膠質芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml。
[0029]本發明優選的，所述的水解酶為動物蛋白水解酶，動物蛋白水解酶的用量為100kg動物血添加3-4kg的動物蛋白水解酶，動物蛋白水解酶南寧龐博生物工程有限公司有售。
[0030]本發明優選的，所述複合微量元素，是由等質量的下述物質混合而成:硫酸錳，硫酸亞鐵，硼酸，硫酸銅，硫酸鋅，鉬酸錢。
[0031]本發明優選的，所述的生化酶為磷酸葡萄糖激酶PEK、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、穀氨酸脫氫酶、氨甲醯磷酸合酶I或氨甲醯磷酸合酶II。
[0032]本發明還提供一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的製備方法，包括步驟如下:
[0033]將原料亞砸酸鈉、動物血水解液、複合微量元素、磷酸二氫鉀、尿素、蛋白腖、酵母粉、NaCl、NaOH, NaNO3.NaCl, NH4Cl, K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣、胺基酸、硝酸鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、檸檬酸三鈉、生化酶、混合菌液混合均勻後，調節pH至7?7.5，得混合物料，將混合物料於30?35°C在無氧條件下經發酵24-48h，當混合物料的顏色從淡黃色變到紅色，即製得富砸殼聚糖營養型微生物肥料，所述的富砸殼聚糖營養型微生物肥料製劑含單質砸0.3?0.4g/L，所述砸為納米級，平均粒徑為60?150nm，活性菌總數蘭150億個/mLo
[0034]本發明優選的，混合物料在發酵過程中通入惰性氣體維持無氧環境，所述的惰性氣體為氮氣或氬氣。
[0035]本發明製得的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑呈液體狀態，溶液呈紅色表明砸納米粒子的存在。
[0036]上述採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的應用，用於缺砸、貧砸地區的農作物種植施肥用，包括根部施肥和葉面施肥，根部施肥時將富砸殼聚糖營養型微生物肥料直接施用，葉面施肥時將富砸殼聚糖營養型微生物肥料稀釋2?5倍施用。
[0037]本發明優選的，所述的農作物為葡萄，蘋果，西葫蘆，辣椒，黃瓜，白菜油菜，西紅柿，前子。
[0038]進一步優選的，所述的根部施肥富砸製劑直接均勾地布灑在農作物根部周圍土壤中，再覆土蓋嚴，或者以農作物根部為中心等分若干條溝或穴坑，將稀釋後的富砸製劑均勻布灑在條溝或穴坑內，再覆土蓋嚴，施肥量:每棵施5?10斤稀釋後的富砸製劑。
[0039]本發明使用的解澱粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌，膠質芽孢桿菌均為現有技術中已有的常規菌種，可常規市場購買得到，本發明所用菌種均購自中國農業科學院農業微生物菌種保藏管理中心(公開出售)，其中，解澱粉芽孢桿菌的編號為ACCC10167，枯草芽孢桿菌的編號ACCC04177，地衣芽孢桿菌的編號為ACCC02936，蘇雲金芽孢桿菌的編號為ACCC11075，膠質芽孢桿菌的編號為ACCC10013。
[0040]本發明所涉及的發酵液中的組分均為現有技術中已有的常規組分，均按照常規方法製備得到，比如，大豆粉，玉米澱粉，糖蜜，酵母膏，牛肉膏等。
[0041]本發明所使用的亞砸酸鈉購自濟南莊盟生物技術有限公司。
[0042]本發明的動物血水解液中含有蛋白質、胺基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質主要為白蛋白和球蛋白。胺基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本成分，其中有些胺基酸動物細胞本身不能合成(稱為必需胺基酸)，必須由培養液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子(如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、類胰島素生長因子等)；血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%?20%的血清，動物血清還可起到酸鹼度緩衝液的作用。針對長期以來微生物菌劑發酵液中菌體數量難以提高的問題，根據微生物的生理特性及生長特徵，在發酵過程中，通過嘗試採用動物血清類等不同來源的胺基酸溶液，利用動物血清類胺基酸改善培養基營養組份結構，實現了微生物的高效增殖及活性保持，有效提高了活菌數量及存活周期，顯著提高了微生物菌劑的增殖率，微生物菌劑的含菌量達到了 200億/mL，並取得了經濟作物增產10-15%的優異效果。通過增加發酵過程中微生物的增殖速度，菌劑的保存期可以延長至2年。
[0043]有益效果
[0044]本發明的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑優點如下:
[0045]1、本發明的富砸微生物製劑的製備方法，發酵時間短，僅需24-48h，大大提高了富砸微生物製劑的使用效率，節約了成本。
[0046]2、本發明的動物血水解液中含有蛋白質、胺基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質主要為白蛋白和球蛋白。胺基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本成分，其中有些胺基酸動物細胞本身不能合成(稱為必需胺基酸)，必須由培養液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子(如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、類胰島素生長因子等)；
[0047]3、本發明的動物血水解液中還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%?20%的血清，動物血清還可起到酸鹼度緩衝液的作用。
[0048]4、針對長期以來微生物菌劑發酵液中菌體數量難以提高的問題，根據微生物的生理特性及生長特徵，在發酵過程中，通過嘗試採用動物血清類等不同來源的胺基酸溶液，利用動物血清類胺基酸改善培養基營養組份結構，實現了微生物的高效增殖及活性保持，有效提高了活菌數量及存活周期，顯著提高了微生物菌劑的增殖率，微生物菌劑的含菌量達到了 200億/mL，並取得了經濟作物增產10-15%的優異效果。通過增加發酵過程中微生物的增殖速度，菌劑的保存期可以延長至2年。
[0049]5，本富砸微生物製劑使用的枯草芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，膠凍樣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌膠質芽孢桿菌菌種，不僅可以提高富砸微生物製劑的發酵速度，而且使砸納米顆粒的粒徑更加均勻，更有益於植物對此富砸微生物製劑的吸收。
[0050]6，本富砸微生物製劑使用的枯草芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，膠凍樣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌膠質芽孢桿菌菌種，會對土壤中的微生物帶來有益影響，它可以增加土壤中微生物的數量及提高土壤中微生物的活性。此類菌種以其生命活動及其代謝產物導致農作物得到特定肥料效應，生長調節效應，防病蟲效應和土壤生物修復等效應的農業產品。
[0051]7、本發明的富砸製劑對於農作物病蟲害有抗逆作用，其所含的枯草芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，膠凍樣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌膠質芽孢桿菌對有害重金屬有拮抗作用，對於蔬菜中的硝酸鹽有降解作用，可以減少農藥施用量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1為本發明採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的電鏡掃描照片，
[0053]圖2為本發明採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的xps譜圖(a)，
[0054]圖3為本發明採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的xps譜圖(b)。

【具體實施方式】
[0055]下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。
[0056]實施例1
[0057]一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，原料重量份如下:
[0058]亞砸酸鈉8份，動物血水解液60份，複合微量元素5份，磷酸二氫鉀8份，尿素10份，蛋白腖8份，酵母粉4份，NaCl 8份，NaOH 8份，NaNO3 4份，NaCl 10份，NH4Cl 4份，K2HPO4 8份，牛肉膏4份，葡萄糖10份，澱粉10份，碳酸鈣8份，胺基酸10份，硝酸鉀2份，硫酸亞鐵2份，硫酸鎂10份，檸檬酸三鈉25份，生化酶10份，混合菌液800份；
[0059]所述混合菌液是通過以下方法製備得到:
[0060](I)將解澱粉芽孢桿菌菌種以體積比為0.25%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在35°C下有氧發酵45h，製得解澱粉芽孢桿菌菌液；發酵液原料組成:8%大豆粉，4%糖蜜，3%澱粉，餘量為水，按重量百分比計；
[0061](2)將枯草芽孢桿菌菌種以體積比為0.25%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在35°C下有氧發酵45h，即得枯草芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:大豆粉4%，葡萄糖4%，磷酸氫二鉀I %，酵母膏I %，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.3%，餘量為水，按重量百分比計;
[0062](3)將地衣芽孢桿菌種以體積比為0.25%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在35°C下有氧發酵24h，即得地衣芽孢桿菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12%，玉米澱粉8%，葡萄糖5%，餘量為水，按重量百分比計；
[0063](4)將蘇雲金芽孢桿菌菌種以體積比為0.25%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在35°C下有氧發酵45h，即得蘇雲金芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12%，氫氧化鉀3%，磷酸2%，尿素1%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0.1%，硫酸鋅0.1%，餘量為水，按重量百分比計；
[0064](5)將膠質芽孢桿菌菌種以體積比為0.25%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在35°C下有氧發酵45h，即得膠質芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:玉米澱粉8%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，蛋白腖0.5%，碳酸鈣0.5%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%，餘量為水，按重量百分比計；
[0065](6)步驟⑴、⑵、(3)、(4)、(5)中使用的發酵液均於120°C下滅菌2小時，冷卻後再進行接種，按體積比將解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液按4:3:2:2:2的比例混合混勻，即得混合菌液。
[0066]所述的動物血水解液是以未凝固的動物血為原料，經升溫至80°C，加入動物蛋白水解酶水解12h ;水解後升溫至120°C，保溫Ih進行滅酶；滅酶後，降溫至常溫後製得，動物蛋白水解酶的用量為100kg動物血添加4kg的動物蛋白水解酶。
[0067]所述複合微量元素，是由等質量的下述物質混合而成:硫酸錳，硫酸亞鐵，硼酸，硫酸銅，硫酸鋅，鉬酸錢。
[0068]所述的生化酶為磷酸葡萄糖激酶PEK。
[0069]製備方法:
[0070]將原料亞砸酸鈉、動物血水解液、複合微量元素、磷酸二氫鉀、尿素、蛋白腖、酵母粉、NaCl、NaOH, NaNO3.NaCl, NH4Cl, K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣、胺基酸、硝酸鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、檸檬酸三鈉、生化酶、混合菌液混合均勻後，調節pH至7.5，得混合物料，將混合物料於32°C通入氮氣保持無氧條件下經發酵30h，當混合物料的顏色從淡黃色變到紅色，即製得富砸殼聚糖營養型微生物肥料，所述的富砸殼聚糖營養型微生物肥料製劑含單質砸0.3?0.4g/L，所述砸為納米級，平均粒徑為lOOnm，活性菌總數蘭150億個/mL。
[0071]圖1為本發明採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的掃描電鏡照片，從圖中可以看出，納米級單質砸的平均粒徑在lOOnm。
[0072]圖2 (a)顯示，XPS光譜下，溶液中Cls，Ols的，Nls和Se3d的存在。但Se3d在XPS光譜中不明顯，即它的發射峰的強度非常弱，這可能是由於砸納米顆粒容易被芽孢桿菌的蛋白質分泌物捕獲。
[0073]圖3(b)顯示，XPS光譜下，溶液中的Se3d結合能在55.74eV，它是砸元素本身的特徵峰。C，N，O的存在可能是由於樣品中蛋白質和其他生物大分子汙染的存在。
[0074]我們可以從XPS光譜中得出如下結論，此反應合成砸元素，而且是被芽孢桿菌的蛋白質分泌物覆蓋的小尺寸的納米砸顆粒。M-Se的形成過程中中蛋白質起重要作用。
[0075]實施例2
[0076]如實施例1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，不同之處在於，原料重量
[0077]份如下:
[0078]亞砸酸鈉10份，動物血水解液62份，複合微量元素8份，磷酸二氫鉀10份，尿素15 份，蛋白腖 12 份，酵母粉 6 份，NaCl 10 份，NaOH 10 份，NaN036 份，NaCl 15 份，NH4Cl 4份，K2HPO4 12份，牛肉膏6份，葡萄糖15份，澱粉15份，碳酸鈣12份，胺基酸16份，硝酸鉀
3份，硫酸亞鐵3份，硫酸鎂13份，檸檬酸三鈉30份，生化酶18份，混合菌液820份。
[0079]混合菌液中解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液的體積比為:6:3:2:2:2。
[0080]製備方法同實施例1。
[0081]實施例3
[0082]如實施例1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，不同之處在於，原料重量
[0083]份如下:
[0084]亞砸酸鈉12份，動物血水解液58份，複合微量元素12份，磷酸二氫鉀18份，尿素20 份，蛋白腖 18 份，酵母粉 8 份，NaCl 15 份，NaOH 12 份，NaNO3 8 份，NaCl 20 份，NH4Cl 10份，K2HPO4 18份，牛肉膏8份，葡萄糖20份，澱粉20份，碳酸鈣18份，胺基酸20份，硝酸鉀5份，硫酸亞鐵5份，硫酸鎂22份，檸檬酸三鈉35份，生化酶25份，混合菌液830份。
[0085]混合菌液中解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液的體積比為:1:1:1:1:1。
[0086]實施例4
[0087]如實施例1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，不同之處在於，原料重量
[0088]份如下:
[0089]亞砸酸鈉15份，動物血水解液65份，複合微量元素15份，磷酸二氫鉀20份，尿素25 份，蛋白腖 20 份，酵母粉 10 份，NaC120 份，NaOH 15 份，NaN0310 份，NaCl 25 份，NH4CllO份，K2HPO4 20份，牛肉膏10份，葡萄糖25份，澱粉25份，碳酸鈣20份，胺基酸25份，硝酸鉀6份，硫酸亞鐵6份，硫酸鎂25份，檸檬酸三鈉40份，生化酶25份，混合菌液848份。
【權利要求】
1.一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，原料按重量份計由如下成分組成: 亞砸酸鈉8-15份，動物血水解液50-65份，複合微量元素5-15份，磷酸二氫鉀8_20份，尿素 10-25 份，蛋白腖 8-20 份，酵母粉 4-10 份，NaCl 8-20 份，NaOH 8-15 份，NaN034_10 份，NaCl 10-25 份，NH4Cl 4-10 份，K2HP048_20 份，牛肉膏 4-10 份，葡萄糖 10-25 份，澱粉 10-25份，碳酸鈣8-20份，胺基酸10-25份，硝酸鉀2-6份，硫酸亞鐵2_6份，硫酸鎂10-25份，檸檬酸三鈉25-40份，生化酶10-25份，混合菌液800-848份； 所述的動物血水解液是以未凝固的動物血為原料，經升溫至75-80°C，加入水解酶水解8-15h ;水解後升溫至120°C，保溫l_2h進行滅酶；滅酶後，降溫至常溫後製得，所述的混合菌液為解澱粉芽孢桿菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌液、蘇雲金芽孢桿菌菌液和膠質芽孢桿菌菌液的混合液。
2.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，原料按重量份計由如下成分組成: 亞砸酸鈉12-13份，動物血水解液60-62份，複合微量元素8-10份，磷酸二氫鉀10-15份，尿素 15-18 份，蛋白腖 10-15 份，酵母粉 6-8 份，NaCl 10-15 份，NaOH 10-12 份，NaN036_8份，NaCl 15-20 份，NH4Cl 4-10 份，K2HPO412-18 份，牛肉膏 6-8 份，葡萄糖 15-20 份，澱粉15-20份，碳酸鈣12-18份，胺基酸16-20份，硝酸鉀3_5份，硫酸亞鐵3_5份，硫酸鎂13-22份，檸檬酸三鈉30-35份，生化酶18-25份，混合菌液820-830份。
3.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，所述混合菌液是通過以下方法製備得到: (1)將解澱粉芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38°C下有氧發酵24-48h，製得解澱粉芽孢桿菌菌液；發酵液原料組成:8-10%大豆粉，4-7%糖蜜，3-5%澱粉，餘量為水，按重量百分比計； (2)將枯草芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，即得枯草芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成--大豆粉4-7 %，葡萄糖4-8 %，磷酸氫二鉀1-2 %，酵母膏1-2 %，硫酸鎂0.02-0.05 %，碳酸鈣0.3-0.6%，餘量為水，按重量百分比計； (3)將地衣芽孢桿菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38°C下有氧發酵24-48h，即得地衣芽孢桿菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12-20 %，玉米澱粉8-12 %，葡萄糖5-8 %，餘量為水，按重量百分比計； (4)將蘇雲金芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38°C下有氧發酵24-48h，即得蘇雲金芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:糖蜜12-18%，氫氧化鉀3-5%，磷酸2-4%，尿素1_3%，牛肉膏0.5_2%，硫酸鎂0.1-0.2%，硫酸鋅0.1-0.2%，餘量為水，按重量百分比計； (5)將膠質芽孢桿菌菌種以體積比為0.25% -0.5%的接種量接入裝有發酵液的發酵罐中，在30-38?下有氧發酵24-48h，即得膠質芽孢桿菌菌液；所述發酵液原料組成:玉米澱粉8-12 %，牛肉膏1-2 %，葡萄糖1-3 %，蛋白腖0.5-1 %，碳酸鈣0.5-1 %，磷酸氫二鉀0.5-1%，硫酸鎂0.02-0.05%，餘量為水，按重量百分比計； (6)按體積比將解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液按(1-6):(1-3):(1-2):(1-2):(1-2)的比例混合混勻，即得混合菌液。
4.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，解澱粉芽孢桿菌菌液:枯草芽孢桿菌菌液:地衣芽孢桿菌液:蘇雲金芽孢桿菌菌液:膠質芽孢桿菌菌液的體積比為:(2-4): (2-3):2:2:2，步驟(1)、⑵、⑶、⑷、(5)中使用的發酵液均於110°C?120°C下滅菌2?3小時，冷卻後再進行接種，步驟⑴、(2)、(3)、⑷、(5)中有氧發酵時間45-48h，所述的解澱粉芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml，枯草芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?160億個/ml，地衣芽孢桿菌液中活菌含量為120?150億個/ml，蘇雲金芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml，膠質芽孢桿菌菌液中活菌含量為120?150億個/ml。
5.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，所述的水解酶為動物蛋白水解酶，動物蛋白水解酶的用量為100kg動物血添加3-4kg的動物蛋白水解酶。
6.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，所述複合微量元素，是由等質量的下述物質混合而成:硫酸錳，硫酸亞鐵，硼酸，硫酸銅，硫酸鋅，鉬酸銨。
7.根據權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑，其特徵在於，所述的生化酶為磷酸葡萄糖激酶PEK、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、穀氨酸脫氫酶、氨甲醯磷酸合酶I或氨甲醯磷酸合酶II。
8.權利要求1所述的一種採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的製備方法，包括步驟如下: 將原料亞砸酸鈉、動物血水解液、複合微量元素、磷酸二氫鉀、尿素、蛋白腖、酵母粉、NaCl、NaOH, NaNO3、NaCl、NH4Cl、K2HPO4、牛肉膏、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣、胺基酸、硝酸鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、檸檬酸三鈉、生化酶、混合菌液混合均勻後，調節pH至7?7.5，得混合物料，將混合物料於30?35°C在無氧條件下經發酵24-48h，當混合物料的顏色從淡黃色變到紅色，即製得富砸殼聚糖營養型微生物肥料，所述的富砸殼聚糖營養型微生物肥料製劑含單質砸0.3?0.4g/L，所述砸為納米級，平均粒徑為60?150nm，活性菌總數蘭150億個/mL。
9.根據權利要求8所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的製備方法，其特徵在於，混合物料在發酵過程中通入惰性氣體維持無氧環境，所述的惰性氣體為氮氣或氬氣。
10.權利要求1所述的採用動物血清發酵製備的富砸微生物製劑的應用，用於缺砸、貧砸地區的農作物種植施肥用，包括根部施肥和葉面施肥，根部施肥時將富砸殼聚糖營養型微生物肥料直接施用，葉面施肥時將富砸殼聚糖營養型微生物肥料稀釋2?5倍施用，所述的農作物為葡萄，蘋果，西葫蘆，辣椒，黃瓜，白菜油菜，西紅柿，茄子。
【文檔編號】C12R1/07GK104478586SQ201410757819
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】王曙光, 李曉, 肖嵐 申請人:山東大學