牙生物膜成熟和致齲性的抑制的製作方法
2023-04-29 14:14:46 2
本發明涉及牙菌斑生物膜成熟和牙菌斑生物膜的致齲性的抑制，以及抑制牙菌斑生物膜的致齲活性的產品。本發明還涉及使用這樣的產品的裝置。
背景技術：
齲齒是細菌來源的感染，其導致牙齒硬組織的去礦化和破壞。蛀牙是由在可發酵的碳水化合物如蔗糖、果糖和葡萄糖(例如，來自在牙齒表面上積累的食物殘渣)的存在下產生乳酸的特定類型的細菌所引起。牙齒的礦物質含量對於由乳酸的產生所引起的酸度增加敏感。
對齲齒最負有責任的細菌是變形鏈球菌(mutans streptococci)，最突出的是變形鏈球菌(Streptococcus mutans)和遠緣鏈球菌(Streptococcus sohrinus)，以及乳酸桿菌。如果不治療，齲齒可導致疼痛、牙齒脫落和感染。
由於沒有已知方法在牙齒結構被齲齒破壞時再生大量的牙齒結構，廣泛提倡防止和預防措施，如定期保持口腔衛生和飲食調整，以避免齲齒。儘管如此，齲齒仍然是全世界人類最常見的問題之一。
除了預防、保持口腔衛生和飲食調整之外，已經有著很多關於細菌活性自身的微生物方面，特別是幹擾細菌活性自身的關注。研究了許多方法以減少導致齲齒發展的細菌的數量，或者抑制導致齲齒發展的這些細菌的活性。然而，細菌致齲活性的抑制帶來了一個問題，因為細菌傾向於以細菌生物膜(嵌入多糖、蛋白質和DNA的細胞外基質中的表面附著的細菌群落)的形式沉積在口中。在這些牙菌斑生物膜中，細菌能夠抵抗宿主免疫應答，並且不僅比它們處於浮遊形式時更加耐受抗生素和殺生物劑，而且還能夠更好地抵抗機械清除。
牙菌斑生物膜在多個階段中形成，伴隨不同水平的致病力。早期的牙菌斑生物膜(0-8小時時間的)被認為是正常的，因為它們在每個個體中積累。這樣的早期牙菌斑生物膜具有低的酸生產能力，因此具有相對低的致齲性。8-48小時的牙菌斑生物膜的成熟導致酸生產能力顯著增加以及牙菌斑生物膜的致齲可能增加。最終，成熟的牙菌斑生物膜(時間超過約48小時)可以導致牙齦刺激，並最終導致由牙齦疾病如牙齦炎和牙周炎所代表的真正感染。
技術實現要素：
多年來已經測試了化合物抑制致齲細菌生長和減少牙菌斑生物膜形成的能力。這些研究沒有帶來可以停止齲齒發展的產品的成功開發。因此仍然需要可用於預防或抑制齲齒進展的有效試劑。因此，本發明的一個方面是提供一種新穎的替代化合物，其優選在預防和/或減少齲齒(的風險)方面具有更好的功能。
令人驚訝地，已經發現某些小分子抑制劑可用於預防牙菌斑生物膜的成熟。令人驚訝地，還已經發現這些抑制劑可用於降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的口腔疾病的風險，包括致齲活性(乳酸鹽產生)或牙齦發炎和感染的刺激。
考慮到這樣的用途，本發明還涉及包含這些小分子抑制劑的口服組合物。
眾所周知，有助於牙菌斑生物膜形成的絕大多數細菌是革蘭氏陽性菌。特別地，已知通過產生乳酸而有助於齲齒形成的細菌是革蘭氏陽性菌。這可能是由飲食中有利於牙菌斑中的這些革蘭氏陽性糖分解物種的可發酵糖的存在所引起。因此發現用根據本發明的小分子抑制劑治療牙菌斑導致牙菌斑生物膜中的乳酸甚至在可發酵糖的存在下顯著減少是非常令人驚訝的。因此，本發明導致與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病(如齲齒)的風險顯著降低。
具體實施方式
根據一個實施方式，本發明涉及小分子抑制劑用於製造預防牙菌斑生物膜成熟和/或降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病的風險的藥物的用途，其中小分子抑制劑特徵為通式1：
其中R1可以是具有3至9個碳原子的支化或非支化烴，和
其中R2可以特別地是選自以下的結構：
其中式2-5的結構中的每一個都可以進一步通過至少一個低級烷基和/或至少一個滷素基團而衍生化。
根據另一個實施方式，本發明涉及小分子抑制劑用於製造預防牙菌斑生物膜成熟和/或降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病的風險的藥物的用途，其中小分子抑制劑特徵為通式1：
其中R1可以是特別地具有3至9個碳原子的支化或非支化烴，和
其中R2可以特別地是選自以下的結構：
與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病例如是牙齦炎、牙周炎、齲齒、(頂端)牙髓炎、種植體(周圍)炎((peri)implantitis)和口臭。
在另一個實施方式中，本發明涉及式1的小分子抑制劑，特別地用於預防牙菌斑生物膜成熟和/或降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病的風險。
在另一個實施方式中，本發明涉及有效量的根據本發明的小分子抑制劑在用於預防牙菌斑生物膜成熟的化妝品中的用途。
在另一個實施方式中，本發明涉及有效量的式1的小分子抑制劑用於預防牙菌斑生物膜成熟和降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病(包括致齲活性(乳酸鹽產生)或牙齦發炎和感染(例如牙齦炎和牙周炎)的刺激)的風險的非治療用途(例如化妝品用途)。
在又一個實施方式中，本發明還涉及在人和/或動物中使用有效量的式1的小分子抑制劑以預防牙菌斑生物膜成熟和/或降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病(包括致齲活性(乳酸鹽產生)或牙齦發炎和感染的刺激)的風險的治療用途或治療方法。
在另一個實施方式中，本發明涉及有效量的式1的小分子抑制劑在用於減少牙生物膜中的乳酸鹽產生的藥物或化妝品中的用途。
在另一方面，本發明涉及有效量的如上文進一步限定的式1的化合物在製造抑制牙菌斑生物膜中的乳酸鹽產生的藥物中的用途或用於抑制牙菌斑生物膜中的乳酸鹽產生的非治療目的的用途。
在另一方面，本發明涉及有效量的如上文進一步限定的式1的化合物在製造預防或治療牙齦發炎或感染的藥物中的用途或用於預防或治療牙齦發炎或感染的非治療目的的用途。
在另一個實施方式中，本發明涉及通式1的化合物，其中R1可以是具有3至9個碳原子的支化或非支化烴，和
其中R2可以是特別地選自以下的結構：
其中式2-5的結構中的每一個都可以進一步通過至少一個低級烷基和/或至少一個滷素基團而衍生化，用作藥物。
在另一個實施方式中，本發明涉及通式1的化合物，其中R1可以是具有3至9個碳原子的支化或非支化烴，和
其中R2可以是特別地選自以下的結構：
用作藥物。
在一個具體實施方式中，式1的化合物中的R1是具有3至9個碳原子的非支化烴。
在另一個具體實施方式中，式1的化合物中的R2是
在另一個具體實施方式中，式1的化合物中的R1是具有3至9個碳原子的非支化烴，且R2是
根據通式1的化合物，其中R1是非支化壬基且R2是被報導具有針對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌的群體感應的拮抗活性(Smith等(2003年1月)；Smith等(2003年6月))。
對於根據本發明的用途，式1的小分子抑制劑以1至1000μM的濃度存在於牙菌斑生物膜上。該濃度被認為是有效量(導致活性化合物在口腔中局部集中的活性化合物的量；還參見下文)。更低的濃度可能不是有效的，而更高的濃度可能導致不期望的副作用。
對於上述用途，式1的小分子抑制劑可以是口服組合物的部分。
本文所用的術語「口服組合物」是指可以引入口腔並且可以與牙齒接觸的除了食物和飲料以外的任何組合物。口服組合物包含化合物。術語「化合物」還可以指具有本文所述類型(例如根據式1)的兩種或更多種不同的化合物的組合。口服組合物可以例如是液體(包含分散體)或可以是糊劑。在優選的實施方式中，口服組合物可以是非粘性的並且可以是可傾倒的液體。
術語「口服組合物」可以是指化妝品、藥物或準藥物或另外的組合物。例如，術語「口服組合物」還可以指可以具有預防蛀牙、美白牙齒、去除牙菌斑、清潔口腔、預防口臭、去除牙垢、預防牙結石沉積等中的一種或多種的作用的化妝品(更具體地，潔齒劑)。
具體地，本發明的術語「口服組合物」可以是指例如潔齒劑、漱口液(其可以通過衝洗或使用裝置(如口腔衝洗器)施用)、錠劑(troche)、含漱劑、牙齦按摩膏、牙齒錠劑(dental lozenge)、人工唾液、潔齒粉、顆粒劑或可崩解片、凝膠劑、清漆、牙膏、預防膏劑、口香糖和幹口糊劑。因此，口服組合物可以例如是液體、糊劑或口香糖。在另一方面，本發明還提供了含有口服組合物的容器。
本發明的口服組合物還可以包含下列成分中的一種或多種：
●多元醇溼潤劑，特別地5至90重量％的一種或多種多元醇溼潤劑，例如甘油、赤蘚糖醇、山梨醇、甘露醇、麥芽糖醇、木糖醇或聚乙二醇；
●甜味劑，特別地0.001至5重量％的一種或多種甜味劑，例如安賽蜜及其鹽、阿斯巴甜、二氫查耳酮、甘草甜素、甘草甜素衍生物、甘草、糖精、甜菊、rebaudosides、三氯蔗糖、踝蛋白或索馬甜；
●柔和磨料，特別地1至60重量％的一種或多種柔和磨料，其具有小於或等於牙釉質的硬度，例如碳酸鈣、磷酸二氫鈣、磷酸鈣、焦磷酸鈣、二氧化矽或羥基磷灰石；
●強磨料，特別地1至60重量％的一種或多種強磨料，其具有大於牙釉質的強度，例如氧化鋁、二氧化矽、二氧化鈦或氟磷灰石；
●香料，特別地0.1至10重量％的一種或多種香料；
●表面活性化合物，特別地1至5％的一種或多種表面活性化合物，例如月桂基硫酸鈉(SLS)；
●含氟化合物，特別地1至5000ppm重量的一種或多種含氟化合物，例如氟化鈉、SnF2、胺氟或單氟磷酸鈉；
●單-、二-或多齒酸或其鹽，特別地0.1至10重量％的一種或多種單-、二-或多齒酸或其鹽，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸、抗壞血酸、磷酸、鹽酸或硫酸，以調節和保持pH在6和10之間；
●防腐劑，特別地0.1至1.0重量％的一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸酯、山梨酸鉀、乳鐵蛋白、溶菌酶或丙酸鈣；
●抗氧化劑，特別地0.1至1.0重量％的一種或多種抗氧化劑，例如抗壞血酸、α-生育酚、β-胡蘿蔔素、輔酶Q10或褪黑素；
●增稠劑，特別地0.1至10重量％的一種或多種增稠劑，例如膠體纖維素、水合二氧化矽、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；
●5至95重量％的水。
上述成分優選因為與口服用途的相容性而被選擇，並且特別地不應當包含在施用於口腔時或在攝取時具有毒性或在其他方面不期望的副作用的成分。
口服組合物可以包含相對於口服組合物的總重量為1至10,000μM的量的通式1的化合物。更小的量在正常使用期間可能不是有效的，而更大的量可能具有不期望的效果並且可能任選地影響口服組合物的質地和/或風味。使用這樣的口服組合物，在將口服組合物施用於口腔時，可以在口腔中提供例如1和1000μM的上述濃度。
因此在另一方面，本發明涉及包含有效量的通式1的化合物的口服組合物，其中R1可以是具有3至9個碳原子的支化或非支化烴，和
其中R2可以是特別地選自以下的結構：
其中式2-5的結構中的每一個都可以進一步通過至少一個低級烷基和/或至少一個滷素基團而衍生化。
在另一方面，本發明涉及包含有效量的通式1的化合物的口服組合物，其中R1可以是具有3至9個碳原子的支化或無支化烴，和
其中R2可以是特別地選自以下的結構：
在一個具體實施方式中，本發明涉及包含通式1的化合物的口服組合物，其中R1是具有3至9個碳原子的無支化烴。
在另一個具體實施方式中，本發明涉及包含有效量的通式1的化合物的口服組合物，其中R2是
在另一個實施方式中，本發明涉及包含有效量的通式1的化合物的口服組合物，其中R1是具有9個碳原子的無支化烴鏈，且R2是
如上所述，本發明的口服組合物可以使用適合的裝置施用，例如口腔衝洗器，如空氣牙線或水牙線，如例如在WO2012117313和US4,302,186中描述的裝置，其通過引用併入本文。因此，根據另一方面，本發明涉及一種裝置，特別地涉及電子裝置，例如電動牙刷、齒間清潔器、口腔衝洗器、刮舌器或任何其他適當的口內遞送系統，用於施用進一步包含包含有效量的式1的小分子抑制劑的口服組合物的口服組合物。裝置可以特別地配置成容納可更換或可再填充的容器。這樣的容器在空的時候可以用新的、充滿的容器更換。或者，替代性地或另外地，裝置包括在空的時候可以再填充的可再填充的容器。
本發明的化合物和組合物的治療或化妝用途或治療方法還包括將這些化合物或組合物與適合的裝置(例如口腔衝洗器，如上文提到的空氣牙線或水牙線)一起使用。
本文所用的術語「以有效量」是指導致活性化合物在口腔中和特別地在牙齒的位置處局部集中的活性化合物的量，其足夠高以造成預防牙菌斑生物膜成熟和降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病(包括致齲活性(乳酸鹽產生)或牙齦發炎和感染(例如牙齦炎和牙周炎)的刺激)的風險的期望效果。
令人驚訝地，已經發現適合於造成預防牙菌斑生物膜成熟和降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病的風險的期望效果的式1的小分子抑制劑的濃度可以低於抑制性濃度。
本文所用的術語「抑制性濃度」是指完全抑制口腔斑塊生物膜生長的濃度。
例如，對於通式1的化合物，其中R1是具有9個碳原子的非支化烴鏈，且R2是可以在10μM和100μM之間的濃度下觀察到期望效果，而該化合物的抑制性濃度高於800μM。
通式1的化合物可以根據Smith等(2003年1月)和Smith等(2003年6月)中描述的方法或與其類似的方法製備。
進一步地，特別地如本文所定義的基團R2，甚至更特別地如獨立權利要求中所定義的基團R2，不進一步地(通過至少一個低級烷基和/或至少一個滷素基團)衍生化，儘管在其他實施方式中不排除衍生化。進一步地，R1可以特別地選自丙基、丁基、戊基、己基、辛基和壬基。在又一些方面，R1可以選自乙基和丙基。在又一些方面，R1可以是H。特別地，R1是具有3至9個碳原子的支化或非支化烴。低級烷基特別地是具有多至4個碳原子的烷基。
術語「小分子抑制劑」特別地是指低分子量化合物，其適合於預防牙菌斑生物膜成熟和/或降低與源自成熟牙菌斑生物膜的功能相關的疾病的風險，特別地適合於減少通過成熟牙菌斑生物膜進行的乳酸的產生。任選地，也可以應用術語「化合物」代替術語「小分子抑制劑」。
術語「包含」也包括其中術語「包含」是指「由……組成」的實施方式。術語「和/或」特別地涉及在「和/或」之前和之後提及的項目中的一個或多個。例如，短語「項目1和/或項目2」以及類似短語可以涉及項目1和項目2中的一個或多個。術語「包含」在一個實施方式中可以是指「由……組成」，但是在另一個實施方式中也可以是指「含有至少所限定的物質和任選地一種或多種另外的物質」。
應注意的是上述實施方式說明而不是限制本發明，並且本領域技術人員將能夠設計許多替代實施方式而不脫離所附權利要求的範圍。在權利要求中，置於括號之間的任何附圖標記不應被解釋為限制權利要求。使用動詞「包含」及其詞形變化不排除除權利要求中所述的要素或步驟以外的要素或步驟的存在。要素之前的冠詞「一」或「一個」不排除多個這樣的要素存在。本發明可以通過包括多個不同要素的硬體，以及通過適當編程的計算機來實現。在列舉多個裝置的設備權利要求中，這些裝置中的多個可以由硬體的同一個項目實現。僅僅是某些措施記載在彼此不同的從屬權利要求中這一事實不表示不可以使用這些措施的組合以獲益。
在本專利中討論的各個方面可以組合以提供額外的益處。進一步地，本領域技術人員應理解可以組合實施方式，並且也可以組合多於兩個實施方式。此外，特徵中的一些可以形成一個或多個分案的基礎。
附圖說明
圖1顯示以菌落形成單位(CFU)表示的體外口腔斑塊生物膜形成。化合物的濃度顯示在x軸上。與對照相比的統計學顯著性差異用星號(*)標記。
圖2顯示在具有不同C鏈長度的高絲氨酸內酯分子的存在下生長的生物膜的總乳酸產量。還測試3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺，並使用DMSO作為對照。使用100μM的每種化合物。在含有0.2％蔗糖的緩衝蛋白腖水(BPW)中孵育3小時後，給出每個生物膜的乳酸產量。顯示了與對照相比的顯著性：***P＜0.01。
圖3顯示在含有0.2％蔗糖的BPW中孵育3小時後，在不同濃度的3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺和HSL的存在下生長的生物膜的總乳酸產量，以mM/生物膜表示。與對照相比，所有濃度的3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺都導致統計學顯著性差異。
圖4A顯示乳酸鹽產量，以mM乳酸鹽表示；以及圖4B顯示相對於CFU校正的乳酸鹽產量，以μM乳酸鹽/1×106CFU表示。化合物的濃度顯示在x軸上。與對照樣本相比的統計學顯著性差異用星號(*)標記。
圖5顯示與對照生物膜相比，在加入100μM 3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺(a)、10μM呋喃酮C30(b)或10μM 3,4-二溴代-2(5H)-呋喃酮(c)後，在48和96小時後生長的關於最豐富的物種(鏈球菌(A)和韋榮球菌(B))的體外口腔斑塊生物膜的組成變化(△％)。
實施例
材料與方法
接種物收集
從十個供體將用作接種物的刺激唾液收集在冰上。唾液在最後一次刷牙後24小時捐贈。將唾液用60％無菌甘油稀釋2倍，等分並保存在-80℃下。在使用之前，通過混合200μl的每個供體的解凍唾液並渦旋30秒製備合併樣本。在體外用合併唾液按1:50接種口腔斑塊生物膜。
測試化合物
表1中測試的所有化合物均獲自Sigma Aldrich。除了3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺外，表2的所有化合物均由以色列University of the Negev的M.Meijler友情提供。化合物溶於DMSO並在-20℃下儲存。化合物在生物膜生長期間，但不在進一步的表型分析即乳酸鹽產生期間，以指定濃度連續存在。
表1.在體外口腔斑塊生物膜模型中測試的化合物(實施例1)
表2.測試對於乳酸產量的影響的化合物(實施例2)
體外口腔斑塊生物膜形成
體外口腔斑塊生物膜在用玻璃蓋玻片(直徑12mm；Menzel,Braunschweig，德國)組裝的Amsterdam Active Attachment模型(AAA模型，Exterkate等(2010))中生長。模型在緩衝的半確定成分McBain培養基(2.5g/1粘蛋白(Sigma，St Louis，Missouri)、2.0g/1細菌蛋白腖(Difco，Detroit，Michigan)、2.0g/1胰蛋白酶解酪蛋白腖(trypticase peptone)(BBL，Cockeysville，Maryland)、1.0g/1酵母提取物(BD Diagnostic Systems，Sparks，Maryland)、0.35g/1NaCl、0.2g/1KCl、0.2g/1CaCl2、1mg/1氯高鐵血紅素(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)和2mg/1維生素K1(McBain等(2005)，以及50mmol/1PIPES，pH為7.0)中用合併的唾液接種8小時。
在所測試的化合物的存在下，將體外口腔斑塊生物膜在AAA模型中生長48-96小時。用唾液接種該模型，並在37℃下厭氧培養8小時以允許微生物附著到玻璃蓋玻片上。8小時附著後，更新接種培養基並使體外口腔斑塊生物膜生長16小時。每天重複該更新程序，直至收穫日。
通過將玻璃蓋玻片轉移至2ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中收穫體外口腔斑塊生物膜。使用具有130瓦特和20kHz最大值的Vibracell VCX130超聲波儀(Sonics&Materials，Newtown，USA)分散生物膜。將生物膜在冰上超聲處理1分鐘，脈衝率為50％，脈衝為1秒。振動幅度設定為40％。
CFU測定
為了估計體外口腔斑塊生物膜形成的量，測定總的厭氧菌落形成單位。簡而言之，製備分散的生物膜的系列稀釋液，並在胰蛋白酶大豆瓊脂血板上鋪板。隨後將平板在37℃下厭氧孵育96小時，
通過計數每個稀釋的菌落數測定菌落形成單位。
乳酸產量測定
為了估計致齲表型，在收穫之前測定體外口腔斑塊生物膜的乳酸產量(Exerkate等，2010)。簡而言之，將蓋玻片上的生物膜置於含有具有0.2％蔗糖的1.5ml BPW的24孔板中。在37℃下在厭氧條件下允許乳酸形成3小時。使用之前描述的比色測定(van Loveren等(2000))分析在該期間產生的乳酸的總量，表示為mM乳酸，並且表示為μΜ乳酸/1x 106CFU。
DNA分離和PCR
根據製造商說明書(LGC Genomics，Mag mini kit)，使用苯酚珠打(bead-beating)，接著是Agowa分離而分離DNA。簡而言之，在Tris飽和苯酚、pH8、0.1mm鋯珠和Mag裂解緩衝液之外，細胞以1200rpm機械破碎四次，每次兩分鐘。將含DNA相與結合緩衝液和磁珠混合。通過使用nanodrop(Isogen，ND-1000)在260nm處測定吸光度估計DNA濃度。
用於16S rDNA PCR擴增的引物列於表2中。PCR在25μl的終體積中進行，其包含1μl的每種引物(10mM)、1μl dNTP(10mM)、2.5μl 10x含MgCl2的DreamTaq緩衝液(Thermo Scientific)、0.2μl DreamTaq DNA聚合酶(5u/μl，Thermo Scientific)和50ng DNA。預變性在94℃下進行4分鐘，隨後是35個循環的94℃變性30秒、54℃退火1分鐘、72℃引物延伸1分鐘，和最後的72℃延伸5分鐘。通過在用溴化乙錠染色的1％(w/v)瓊脂糖凝膠(Sphearo Q，Leiden，The Netherlands)上電泳5μl而確認產物形成。
這些樣品在TNO Zeist(Netherlands)通過16S rDNA Illumina測序而進行分析。
實施例1
在Amsterdam Active Attachment模型中測試表1的化合物
體外口腔斑塊生物膜形成輕微地受到3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺影響，但僅僅是對於所測試的最高濃度(100μM)。當存在100μM的該化合物時，體外口腔斑塊生物膜造成至多6.6x 108菌落形成單位(CFU)，對比於對照和所有其他濃度的1.5x 109CFU(圖1)。呋喃酮C30和3,4-二溴代-2(5H)-呋喃酮也輕微地影響體外口腔斑塊生物膜形成，但由於差異小於一個對數，這不認為是生物地相關的。
齲齒與牙菌斑生物膜引起的高乳酸鹽產量有關。因此，測量所有體外口腔斑塊生物膜的乳酸鹽產量。圖4A顯示通過加入100μM的3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺幾乎完全阻斷乳酸鹽產生。添加10μM的該化合物也顯著減少體外口腔斑塊生物膜的乳酸鹽產量。雖然對照的體外口腔斑塊生物膜的乳酸鹽產量在生長96小時後比在生長48小時後更低，但是減少作用仍然存在。3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺的最高濃度也略微降低了總生物量，但這不可以解釋更低的乳酸鹽產量。圖4B顯示當相對於CFU校正時，在加入100μM或10μM的該化合物後，乳酸鹽的產量仍然更低。
對於呋喃酮C30和對於3,4-二溴代-2(5H)-呋喃酮，沒有觀察到乳酸鹽產量減少。在生長96小時後，這兩種呋喃酮甚至看起來上調體外口腔斑塊生物膜的乳酸產量。
實施例2
在C12-HSL及其結構變體的存在下的乳酸產量
測量在具有不同C鏈的高絲氨酸內酯(HSL)分子(表2的化合物)的存在下生長的生物膜的乳酸產量。3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺具有C12鏈，因此HSL-C12QS分子在結構上最相似。HSL-C12(S)是QS分子的活性形式，HSL-C12(R)是無活性的對映異構體。對於C12鏈，測試對映異構體兩者。
在100μM的化合物之一的存在下，將生物膜在補充有0.2％蔗糖的緩衝McBain培養基中生長48小時。培養基每天更新兩次。生長48小時後，將生物膜轉移至含0.2％蔗糖的BPW中，並使生物膜產生乳酸鹽3小時。
圖2顯示生物膜的乳酸鹽產量。僅HSL-C14和3-氧代-N顯示降低的乳酸產量。對於HSL-C14，這可以解釋為缺乏生物膜產生，因為該化合物對於生物膜的形成具有毒性。對於3-氧代-N不是這樣，正常量的生物膜是可見的。
獲得的數據顯示天然高絲氨酸內酯(C12-HSL)或其結構變體對乳酸產量沒有影響。這表明3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺不太可能作為QS的抑制劑。因此觀察到的效果一定與3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺對於體外口腔牙菌斑的組成和行為的目前未知的影響有關。
實施例3
群體感應性天然高絲氨酸內酯與3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺無幹擾
在該實驗中，測試了群體感應性分子C13-HSL對於3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺的乳酸鹽減少活性的影響。在0或25或100μM的3-氧代-N(2-氧代環己基)十二烷醯胺以及0或25或100μM的C12-HSL的存在下，將生物膜在補充有0.2％蔗糖的緩衝McBain培養基中生長48小時。培養基每天更新兩次。生長48小時後，將生物膜轉移至含0.2％蔗糖的BPW中，並使生物膜產生乳酸鹽3小時。
圖3顯示了每個生物膜的總乳酸產量。可以得出結論，QS分子不降低我們的化合物的效果。這指向不同於群體感應的、通過本發明的化合物降低乳酸鹽產量的機制。
實施例4
在群體感應性抑制劑的存在下的體內口腔斑塊生物膜的組成
使用16S rDNA測序研究生物膜的組成(表4A和4B)。對於所有的生物膜，韋榮球菌和鏈球菌是兩個主要的屬，但它們的比例是不同的。48小時後，與對照相比，對於在添加100μM的3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺的情況下生長的生物膜觀察到組成變化。已知消耗乳酸鹽的韋榮球菌在加入該化合物的情況下生長的生物膜中豐度增加10％，並且鏈球菌在這些生物膜中減少超過30％(表2)。在3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺生長的生物膜中，鏈球菌屬的減少伴隨著放線桿菌屬的增加。對於呋喃C30和3,4-二溴代-2(5H)-呋喃酮兩者，這種效應不存在或甚至是相反的。
在加入群體感應性抑制劑的情況下生長的所有96小時生物膜都顯示鏈球菌的減少和韋榮球菌與放線桿菌的增加(表2)。
在48和96小時後生長的關於最豐富的物種(鏈球菌(A)和韋榮球菌(B))的生物膜的組成變化(△％)顯示在圖5中。
表3.在不同QS抑制劑的存在下生長48小時(表3A)或96小時(表3B)的生物膜的微生物組成。通過16S rDNA測序確定組成。還測定了用於所有生物膜的原始接種物的組成。
「Unclass」意思是：未分類的。
表3A
表3B
實施例5
牙膏
根據本發明的牙膏可以含有以下成分(以重量/重量％表示)：
●20-25％磨料；
●20-30％溼潤劑如山梨醇；
●1-5％表面活性化合物、1-5％增稠劑、1-2％香料化合物、0.5-2％白色染料化合物、0.05-0.5％防腐劑、0.5-5％3-氧代-N-(2-氧代環己基)十二烷醯胺；
●20-30％水
參考文獻
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