血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑及其製備工藝的製作方法

2023-04-29 18:27:26 1

專利名稱：血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽分子導向的活性劑及其製備工藝，特別涉及一種血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑及其製備工藝。
背景技術：
血栓靶向診斷和治療的藥物(超聲造影劑)用於研究和臨床早已顯出其作為診斷工具的價值，並已有幾十年的歷史了，例如用於心血管系統以及組織微循環灌流等。也有利用各種造影劑增強診斷聲學圖像的方法，包括固體微顆粒懸液，乳化的大納米顆粒，氣泡，其它物質包被的氣泡、液體或其乾粉製劑。靶向藥物(超聲造影劑)應該具有(1)能夠與超聲波輻射相互作用產生可檢測的信號；(2)有特異性的靶點(例如病理學的特定組織細胞結構)，並與靶分子具有親和力和特異性；(3)保持藥物的活性。
超聲造影劑為許多公開的資料所記載，並有部分產品上市銷售，如Bracco公司的產品Sonovue。這些聲學造影劑由類似紅細胞大小的含氣微泡組成，注入靜脈後在超聲下，具有線性散射和非線性散射的特性，可使血流豐富的實質器官產生較強的對比顯影。
導向的超聲造影劑的例子有例如EP-A-0727225描述了導向的超聲造影劑，該報導組分與表面活性劑或白蛋白載體有關，包括作為載體的蛋白質、肽、糖—基質的細胞粘附分子配體，現在認識到這種方法會產生微泡的生長無法控制的問題，有潛在的引起血栓的可能(例如心腦血管血栓)。
WO-A-9320802描述了組織特異性配體(如抗體、肽)連接的單層脂質體用於增強超聲成像，為沒有氣體的超聲增強造影劑。本技術也描述了在血纖維蛋白，血栓，動脈粥樣硬化症區域的導向造影應用。也有一些導向超聲造影劑的出版物，談到可利用單克隆抗體作為載體材料的，但都沒有給出細節，例如WO-A-9300933，WO-A-9401140，WO-A-9428874。
CN1234742A和CN1302211A描述了由形成膜的表面活性劑物質單分子層所穩定的充氣微泡，包括導向的診斷和/或治療劑的組分，報導為水懸液，該組分表面活性劑採用磷脂及其衍生物、脂肽，可與受體結合的多種公開資料中的功能基團，其中也敘述了與血液粘度，出血，血栓，溶栓相關的已知的配體和受體，另外也給出了一個血栓導向脂肽和溶組織纖溶酶原激活物微泡的製備。這些報導組分的受體和配體為公開，其主要通過其組份的表面活性劑的特殊功能基團進行結合以形成穩定的微泡。對導向分子(即靶分子特異性結合到體內某位置或組織的分子)，具體的說就是結合到血栓的有效分子，沒有給出詳細的重要的實際細節。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可保證長時間多肽，蛋白，藥物的穩定性和活性，且具有使用的方便性的高親和力的血栓診斷和/或治療含氣乾粉活性劑及其製備工藝。
為達到上述目的，本發明採用的技術方案是1)多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh的合成首先採用1mmol的胺基酸試劑瓶，在自動化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規模將胺基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預活化胺基酸，將合成的多肽置於TFA溶液中2-3小時，得到粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用製備型HPLC純化所得的粗品；2)脂質-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將所述的多肽融入預冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預冷2小時，在預冷的多肽PBS溶液中按脂質H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH為1∶99～99∶1的摩爾比加入脂質，在4℃條件下攪拌4小時，待完全成乳白色混懸液後，4℃以下冷凍乾燥；3)DPPG和脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH含氣凍乾粉的製備將脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH與DPPG按20∶1～1∶20的摩爾比溶解在水中，使脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH和DPPG混合後的質量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分攪拌混勻約40～60分鐘後，加入表面活性劑使表面活性劑的質量百分比濃度為1～20PPm的，室溫下攪拌混勻後加入穩定劑，使穩定劑的質量百分比濃度為1-10％，混勻30分鐘後加入凍幹瓶中4℃以下低溫下冷凍乾燥，完全乾燥後，加入0.01-1.0Mpa個大氣壓的氣體封閉即可。
本發明所述的多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh中的A為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；B為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；C為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；D為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或rp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基。Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)；脂質為二硬脂酸磷脂醯乙醇胺、二棕櫚酸磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、膽固醇、神經鞘脂類、神經鞘氨醇，神經磷脂，神經醯胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經節苷脂，葡萄糖苷(脂)醯鞘氨醇，4-羥雙氫(神經)鞘氨醇；L-a-磷酸卵磷脂、血小板激活因子、磷脂醯甘油，磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇-4-磷酸、磷脂醯肌醇-4、5-二磷酸鹽、心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂、與生物有關的磷脂的衍生物、磷脂醯乙醇胺的衍生物、磷酸卵磷酯的衍生物、磷脂醯肌醇和磷脂醯肌醇磷酸的衍生物、磷脂酸的衍生物、磷脂醯甘油的衍生物、心磷脂衍生物、甘油二酯的衍生物、磷脂醯乙醇胺-NH2末端基團、己醯胺基團、十二烷基醯胺基團、磷脂醯巰乙胺、丁二醯基團、戊二醯基團、十二烷羧基基團、生物素基團、磷脂醯乙二醇、生物素化的磷脂帽、脂肪酸修飾的衍生物、溶血磷脂膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯甘油、溶血磷酸甘油酯、溶血磷脂酸、烷基磷酸膽鹼、氧化的脂質、生物素化的脂質、縮醛磷脂、聚合的磷脂、滷代磷脂、氟化磷脂、同位素標記磷脂、聚PEG化的磷脂、PEG末端有功能基團的聚PEG化磷脂DSPE-mPEG-CarboxylicAcid、DSPE-mPEG-Maleimide、DSPE-mPEG-PDP、DSPE-mPEG-Amine、DSPE-mPEG-Biotin或DSPE-mPEG-BCT；表面活性劑為棕櫚酸、油酸或亞麻酸；穩定劑為甘露醇、丙三醇或聚乙二醇；氣體為氮氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、惰性氣體、硫氟化物、全氟碳，全氟化的酮、全氟化的醚、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
按照本發明的製備方法製成的含氣乾粉活性劑每支藥物含1-25mg的脂質-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH、25-1mg的DPPG、0.01-0.4mg的表面活性劑、0.1-5.0mg的穩定劑和0.01-1.0Mpa的氣體。
本發明基於血栓的特異性結合分子，篩選合成了系列血栓特異性高親和力的多肽分子，基於該分子的凍乾粉報導物，其中凍乾粉在一定的容器內並密封含有一定壓力的氣體。這樣，例如，採用混合脂質形成彈性增強的微泡，其增強超聲回波性能，其中高親和力的活性分子的作用使聚集濃度增加，回波性加強。這樣，應用的多肽分子是強烈的血小板抑制劑，有抗血栓形成作用。這樣可保證長時間多肽，蛋白，藥物的穩定性和活性，且具有使用的方便性。


圖1是本發明樣品鑑定的質譜圖，其中橫坐標為分子量，縱坐標為百分比強度；
圖2是本發明高效液相色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為強度；圖3是影像強度圖，其中橫坐標為注射前後，縱坐標為顯影強度。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
本發明的一個有利的實施方案是基於另外的發現，即與病變組織血栓特異性結合的導向分子——合成多肽，能與血小板活化時的一個糖蛋白受體結合GPIIIa/IIb的有效部位結合，阻止血小板的進一步活化和聚集，該性質使它成為有效的顯影溶栓劑。該性質是利用受體、配體結合，多肽分子拮抗了配體的激活作用而實現的。這些靶向藥物可以藉助合成的多肽分子有效的結合到正在形成的血栓表面，血栓的超聲顯影增強或原來不能顯影的部位的血栓顯影。另外一個利用該導向分子的有利的一個方面是能夠在血栓形成的早期提供增強超聲回波，血栓形成後(即陳舊性血栓)，血小板激活漸弱或消失，導向分子結合漸弱，不提供增強的回波信號。本發明特別適於血栓的早期靶向定位診斷和新舊血栓的鑑別。
任何生物兼容性的氣體均可存在於報導物內，並被密封在容器內。本發明所使用的氣體包括在正常人體溫37℃下實質上或完全為氣體的任何物質，包括它們的混合物。例如，這些氣體包括，空氣；氮氣；氧氣；二氧化碳；氫氣；惰性氣體；硫氟化物；六氟化硒；滷代矽烷；低分子量的碳氫化合物；烷(如甲、乙、丙、丁、戊烷)；環烷(如環丙烷，環丁烷，環戊烷)；烯(如乙烯，丙烯，丙二烯或丁烯)；炔(如乙炔，丙炔)；醚；酮；酯；低分子量滷代碳氫化合物；滷代氣體中的至少一個滷原子為氟所取代。本發明優選六氟化硫。
本發明報導物內的脂質原則上是任何在液相中可成膜的天然或人工合成脂質、類脂。有效的磷脂的例子包括腦磷脂和卵磷脂及其合成、半合成物，如二硬脂酸磷脂醯乙醇胺，二棕櫚酸磷脂醯乙醇胺，磷脂醯甘油；天然的磷脂包括去毒的脂質A；膽固醇；神經鞘脂類，如神經鞘氨醇，神經磷脂，神經醯胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經節苷脂，葡萄糖苷(脂)醯鞘氨醇，植物鞘氨醇及其衍生物(如4-羥雙氫(神經)鞘氨醇)；丙三醇為基本結構的脂類，如膽鹼類(如L-a-磷酸卵磷脂，血小板激活因子)，如磷脂醯甘油，如乙醇胺類(如磷脂醯乙醇胺)，如肌醇類(如磷脂醯肌醇，磷脂醯肌醇-4-磷酸，磷脂醯肌醇-4，5-二磷酸鹽)，心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂。
合成類脂質包括1、與生物有關的脂質衍生物，(1)如磷脂醯乙醇胺的衍生物(如不對稱醯基基團上面為不同的碳鏈長度的脂肪酸所取代，對稱的為相同的不同碳鏈長度的脂肪酸所取代)；如下表所列含有不對稱碳鏈的磷脂醯乙醇胺的衍生物

含有對稱碳鏈的磷脂醯乙醇胺的衍生物碳數目 衍生物6:0 Dicaproyl二己醯基
8:0 Dioctanoyl二辛醯10:0Dicapryl二辛酸的12:0Dilauroyl二十二(烷)醯14:0Dimyristoyl二肉豆蔻醯16:0Dipalmitoyl二棕櫚醯16:0[(CH3)4]Diphytanoyl二植烷醯16:1Dipalmitoleoyl二棕櫚油醯(基)17:0Diheptadecanoyl二-十七烷醯18:0Distearoyl二硬脂醯18:1(delta 9-cis) Dioleoyl二油醯18:1(delta 9-trans) Dielaidoyl二反油醯18:2Dilinoeoyl二亞油醯18:3Dilinolenoyl二亞麻油醯20:4Diarachidonoyl二花生四烯醯Docosa-hexaenoyl22:6二二十二-六乙基(2)磷酸卵磷酯的衍生物含有不對稱脂肪酸鏈的磷酸卵磷酯的衍生物

含有對稱脂肪酸鏈的磷酸卵磷酯的衍生物




(3)磷脂醯肌醇和磷脂醯肌醇磷酸的衍生物1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-4，5-Bisphosphate]1，2-二辛醯-甘油-3-[磷酸肌醇-4，5-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，5-Bisphosphate]1，2-二辛醯-甘油-3-[磷酸肌醇-3，5-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，4-Bisphosphate]1，2-二辛醯-甘油-3-[磷酸肌醇-3，4-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，4，5-Trisphosphate]1，2-二辛醯-甘油-3-[磷酸肌醇-3，4，5-三磷酸鹽(酯)]L-α-Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate(brain)L-α-磷脂醯肌醇-4，5-二磷酸鹽(酯)(腦)L-α-Phosphatidylinositol-4-phosphate(brain)L-α-磷脂醯肌醇-4-磷酸鹽(酯)(腦)
L-α-Phosphatidylinositol(liver)L-α-磷脂醯肌醇(肝)L-α-Phosphatidylinositol(soy)L-α-磷脂醯肌醇(大豆)(4)磷脂酸的衍生物含不對稱脂肪酸鏈的磷脂酸的衍生物

含對稱脂肪酸鏈的磷脂酸的衍生物

(5)磷脂醯甘油的衍生物含不對稱脂肪酸鏈的磷脂醯甘油的衍生物

含對稱脂肪酸鏈的磷脂醯甘油的衍生物碳數目衍生物Dicaproyl二6:0己醯基Dioctanoyl8:0二辛醯Dicapryl二10:0辛酸的12:0 Dilauroyl二十二(烷)醯Dimyristoyl二14:0肉豆蔻醯
Dipalmitoyl二16:0棕櫚醯Diphytanoyl二16:0[(CH3)4]植烷醯Dipalmitoleoyl二16:1棕櫚油醯(基)Diheptadecanoyl二-十七17:0烷醯Distearoyl二18:0硬脂醯Dioleoyl二18:1(delta 9-cis)油醯18:1(delta 9-trans) Dielaidoyl二反油醯18:2 Dilinoeoyl二亞油醯Dilinolenoyl二亞麻油18:3醯Diarachidonoyl二20:4花生四烯醯Docosa-hexaenoyl22:6二-二十二-六乙基(6)心磷脂衍生物

(7)甘油二酯的衍生物


2.頭部含有修飾基團的衍生物具有與蛋白、肽、藥物連接的功能基團的衍生物，如下圖所示(1)磷脂醯乙醇胺Phosphatidylethanolamine，-NH2末端基團Phosphatidylethanolamine

(2)、N-Caproylamine-PE，己醯胺基團N-Caproylamine-PE

(3)、N-Dodecanylamine-PE十二烷基醯胺基團N-Dodecanylamine-PE

4、Phosphatidyl thioethanol 磷脂醯巰乙胺Phosphatidylthioethanol 5、N-MCC-PEN-MCC-PE 6、N-MPB-PEN-MPB-PE 7、N-PDP-PEN-PDP-PE 8、N-Succinyl-PE丁二醯基團N-Succinyl-PE 9、N-Glutaryl-PE戊二醯基團
N-Glutaryl-PE 10、N-Dodecanyl-PE十二烷羧基基團N-Dodecanyl-PE 11、N-Biotinyl-PE生物素基團N-Biotinyl-PE 12、Phosphatidyl Ethylene Glycol磷脂醯乙二醇Phosphatidyl Ethylene Glycol 13、N-Biotinyl Cap-PE生物素化的磷脂帽N-Biotinyl Cap-PE 3.另外含有兩個以上功能首基的衍生物如烷基磷酸鹽衍生物，甲基衍生物。PH敏感的脂質，如二葡基甘油二酯-琥珀酸鹽(丁二酸鹽)。
本發明優選的功能基團為苯丙三唑碳酸酯(BCT)，如下圖 脂肪酸修飾的衍生物溶解磷脂類，如溶血磷脂膽鹼，溶血磷脂醯乙醇胺，溶血磷脂醯甘油，溶血磷酸甘油酯，溶血磷脂酸；烷基磷酸膽鹼；氧化的脂質；生物素化的脂質；縮醛磷脂；聚合的磷脂(如丁二炔磷脂)；滷代磷脂；氟化磷脂；同位素標記磷脂(如氘標記)；聚PEG化的磷脂；PEG末端有功能基團的聚PEG化磷脂，如(DSPE-mPEG-CarboxylicAcid，DSPE-mPEG-Maleimide，DSPE-mPEG-PDP，DSPE-mPEG-Amine，DSPE-mPEG-Biotin，DSPE-mPEG-BCT)。本發明優選DSPE-mPEG-BCT。另外，本發明優選兩種、兩種以上的脂質按比例混合形成乾粉劑的主要成分，優選的另外一種脂質為DPPG。
本發明報導物內所說的表面活性劑原則上可以是任何形式的膜形成材料。例如，陰離子表面活性劑(如羧酸鹽類，硫酸酯鹽類，磺酸鹽類，磷酸酯鹽類)；陽離子表面活性劑(如胺鹽類，季銨鹽型，胺基酸型，甜菜鹼型)；非離子型表面活性劑(如聚乙二醇型，多元醇型)；葡萄糖酸鈉；硬脂酸鋅；脂肪酸類(如油酸，亞油酸，棕櫚酸)。
本發明優選棕櫚酸。
本發明報導物所說的穩定劑(保護劑)原則上可以是任何凍乾粉針劑的保護劑。例如醇類(如脂肪族醇，丁醇，丙三醇)；多羥基化合物(如甘油)；糖類(如蔗糖，甘露糖醇，葡聚糖)；聚乙二醇(如聚乙二醇1000-10000)。優選聚乙二醇。
本發明報導物的乾粉製劑在水中相當容易的重構，加入溶劑(例如無菌蒸餾水)，在密閉的容器內(優選5-20ml注玻璃瓶)，用手振蕩約30秒。產生的微泡的大小是均勻的，達到了相當好的可控的大小和比利分配範圍。冷凍乾燥物的優勢，在於蛋白、多肽類的藥物可以保存相當長的時間活性，本發明的實驗已經證實在4℃條件下，藥物活性可以穩定保存18個月以上。水中重構產生的微泡彌散物可在密閉的容器內保存至少數個小時。
本發明提供了多肽導向的血栓靶向定位成象的報導物，另一個有效地實施例通過該報導物攜帶溶栓性治療性藥物。雖然在例如CN1234742A、CN1302211A和WO-A-9507072中已經提出了將超聲造影劑和藥物組合，但這些產品缺乏與位點具特異性的載體，或已有載體(配體)，但載體(配體)均為公開。本發明配體(多肽)為本發明所專有，對血栓上的糖蛋白受體具有高度親和力和特異性。按照本發明所利用的溶栓治療性藥物可在微泡的內部被攜帶，或附著在或摻入到微泡的膜上，部分藥物可在乾粉劑中最終溶於溶劑中。這樣，治療藥物可通過本文提到的活性基團共價結合或離子鍵結合，或物理性的與報導物混合在一起。
本發明有用的藥物的代表性例子包括組織抑制因子如單克隆抗體及其片段；血小板抑制劑如凝血酶受體抑制劑，GP IIb/IIIa受體抑制劑(如阿昔單抗)，ADP受體抑制劑，前列腺素，阿司匹林，磷酸二酯酶抑制劑；組織因子，肝素，水蛭素；t-PA，尿激酶，纖溶酶，鏈激酶，rt-纖溶酶原激活物，r-葡萄球菌激酶，阿尼普酶。
按照本發明的產品，可用於體外診斷系統，如體外血栓診斷試劑盒。在體外本發明利用有效的靶分子和那些已知的血栓診斷技術、方法，利用螢光標記技術、納米標記技術等實現體外血栓診斷。
按照本發利用的脂質(衍生物)具有連接基團，官能團則與連接基團相連，模式為脂質-連接基團-官能團，本發明優選脂質-mPEG(聚乙二醇)-官能團。mPEG為目前生物技術和生物藥物應用中研究較多的一種聚合物，PEG在水中有良好的溶解性，每個PEG與兩個或三個水分子結合而高度水化，可阻止PEG修飾物表面被其它聚合物或蛋白質吸附或遮蓋，另外PEG對蛋白質和細胞的活性無損，共價結合的PEG為非免疫原性和非抗原性，PEG修飾對修飾分子的化學性質、活性影響很小，PEG連接物可使體內網狀內皮系統的攝取減少。本發明所用的PEG選用合適的分子量，例如200道爾頓和20千道爾頓之間。優選3400道爾頓。
由於本發明的導向分子及其成分可以允許其它造影劑組件如X線造影劑，光造影劑，放射性造影劑，磁共振造影劑連接在報導物上，因此本發明的診斷和/或治療藥物也包括上述情況。
實施例1DSPE DPPG含氣凍乾粉的製備與微泡重建將DSPE∶DPPG按1∶5(摩爾比)溶解在水中，在40℃條件充分混勻約40-60分鐘。顯微鏡鏡檢沒有大的顆粒後，加入8PPm的棕櫚酸表面活性劑，室溫下混勻15分鐘；後加入PEG4000作為穩定劑，混勻30分鐘；後加入凍幹瓶中低溫下冷凍乾燥，完全乾燥後，加入1個大氣壓的六氟化硫氣體封閉。重新加入溶劑(蒸餾水)約10倍體積，振蕩形成含有微泡的懸液，粒度分析儀分析微泡特性。如下·濃度 2-5×108/ml·D504.0μm·90％閾值 8μm·SF6包被體積 8μl/ml·pH 6.0 to 6.5·重構後穩定性 6hours實施例2包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH含氣凍乾粉及生物評估該實施例為導向型微泡，該微泡含有線性結構的本發明權利要求的多肽分子。
1)多肽H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-Oh的合成首先採用1mmol的胺基酸試劑瓶，在自動化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規模將胺基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預活化所有胺基酸，將合成的多肽置於TFA溶液中2-3小時，可從樹脂上同時移走肽和側鏈保護基，得到100mg粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用製備型HPLC純化所得的粗品得89mg；冷凍乾燥後，將獲得純品進行分析型HPLC分析和質譜法鑑定，如圖1，預期分子量656.6，實測656.57，參見圖2，其純度為98.2％。
2)DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將多肽溶入預冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預冷2小時，在預冷的多肽PBS溶液中按DSPE-PEG3400-BTCH-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH摩爾比為5∶1的摩爾比加入脂質，在4℃條件下攪拌4小時，待完全成乳白色混懸液後，冷凍乾燥，由質譜法和磁共振確認形成產物的結構；3)DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH含氣凍乾粉的製備將DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH與DPPG按1∶5的摩爾比溶解在水中，使DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和DPPG混合後的質量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分攪拌混勻約40-60分鐘後，加入8Ppm的棕櫚酸表面活性劑，室溫下攪拌混勻後加入1mgPEG4000作為穩定劑，混勻30分鐘後加入凍幹瓶中低溫下冷凍乾燥，完全乾燥後，加入0.01-1.0Mpa個大氣壓的六氟化硫氣體封閉，重新加入溶劑(蒸餾水)約10倍體積，振蕩形成含有微泡的懸液，粒度分析儀分析微泡特性。如下·濃度 2-5×108/ml·D504.0μm·90％閾值 8μm·SF6包被體積 8μl/ml·pH 6.0 to 6.5·重構後穩定性 6hours具有導向分子的含有DSPE、DPPG的乾粉劑重構後的充氣微泡的體外研究血栓結合試驗研究取人外周靜脈血，將靜脈血塗於玻片上，室溫下乾燥。取c)所形成的微泡懸液，懸液逐滴滴於玻片，懸液完全覆蓋玻片上形成的血栓。37℃孵育10分鐘，PBS衝洗三次，顯微鏡下觀察微泡結合血栓情況。
狗體內血栓成像實驗用戊巴比妥麻醉20公斤左右的雜種狗。分離暴露兩側髂靜脈，兩側髂靜脈內人工造血栓。取c)所形成的微泡懸液經上肢靜脈注射後，分別在注射0，1，3，5，10，15，25分鐘採用都卜勒超聲成像觀察血栓強度變化。並與實施例1的乾粉劑重構後的微泡進行比較，參見圖3，採用本發明的影像強度達到1200。
實施例3包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗纖維蛋白原單抗的含氣凍乾粉利用實施例2中所描述的相同的方法製備含有抗纖維蛋白原單克隆抗體的凍乾粉。另外，抗纖維蛋白原單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在乾粉劑中。
實施例4包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗纖維蛋白單抗的含氣凍乾粉利用實施例2中所描述的相同的方法製備含有抗纖維蛋白單克隆抗體的凍乾粉。另外，抗纖維蛋白單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在乾粉劑中。
實施例5包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗GP IIb/IIIa單抗的含氣凍乾粉利用實施例2中所描述的相同的方法製備含有抗GP IIb/IIIa受體的單克隆抗體的凍乾粉。另外，抗GP IIb/IIIa受體的單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在乾粉劑中。
實施例6包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和t-PA官能團化的含氣凍乾粉A、血栓親和性的脂肽DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成利用實施例21)和22)中所描述的相同的方法製備合成血栓親和脂肽。
B、具有的t-PA的修飾1mg t-PA溶於0.2ml碳酸銨緩衝液中(a)。0.4mg硫-SMPB溶解在0.5mlDMSO中(b)。a液與b液室溫下混合振蕩反應1小時。層析柱純化分離收集，質譜法，磁共振鑑定合成物，冷凍乾燥成乾粉狀。
C、磷脂醯巰乙胺-硫-SMPB-t-PA的合成室溫下磷脂醯巰乙胺與B按摩爾比3∶1比例溶於PBS中振蕩1-2小時，製備型HPLC分離純化，質譜法鑑定純化產物。
D、包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和t-PA官能團化的含氣凍乾粉的製備利用施例23)中所描述的相同的方法製備含有t-PA官能團化的含氣凍乾粉。t-PA可以物理性或通過離子鍵分散在乾粉劑中。
實施例7包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和尿激酶官能團化的含氣凍乾粉利用實施例6中所描述的相同的方法製備含有尿激酶官能團化的，或離子鍵，或物理性分散的含氣凍乾粉劑。
實施例8包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和鏈激酶官能團化的含氣凍乾粉利用實施例6中所描述的相同的方法製備含有鏈激酶官能團化的，或離子鍵，或物理性分散的含氣凍乾粉劑。
實施例9包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-凝血酶的含氣凍乾粉利用實施例2中所描述的相同的方法，多肽分子被凝血酶取代合成包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-凝血酶的含氣凍乾粉，分離純化鑑定方法也同實施例2的方法。
權利要求
1.一種血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於1)多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh的合成首先採用1mmol的胺基酸試劑瓶，在自動化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規模將胺基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預活化胺基酸，將合成的多肽置於TFA溶液中2-3小時，得到粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用製備型HPLC純化所得的粗品；2)脂質-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將所述的多肽融入預冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預冷2小時，在預冷的多肽PBS溶液中按脂質H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH為1∶99～99∶1的摩爾比加入脂質，在4℃條件下攪拌4小時，待完全成乳白色混懸液後，4℃以下冷凍乾燥；3)DPPG和脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH含氣凍乾粉的製備將脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH與DPPG按20∶1～1∶20的摩爾比溶解在水中，使脂質-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH和DPPG混合後的質量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分攪拌混勻約40～60分鐘後，加入表面活性劑使表面活性劑的質量百分比濃度為1～20PPm的，室溫下攪拌混勻後加入穩定劑，使穩定劑的質量百分比濃度為1-10％，混勻30分鐘後加入凍幹瓶中4℃以下低溫下冷凍乾燥，完全乾燥後，加入0.01-1.0Mpa個大氣壓的氣體封閉即可。
2.根據權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於所說的多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh中的A為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；B為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；C為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；D為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬醯胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺醯胺)或Gly(甘胺酸)或rp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基。Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)。
3.根據權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於所說的脂質為二硬脂酸磷脂醯乙醇胺、二棕櫚酸磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、膽固醇、神經鞘脂類、神經鞘氨醇，神經磷脂，神經醯胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經節苷脂，葡萄糖苷(脂)醯鞘氨醇，4-羥雙氫(神經)鞘氨醇；L-a-磷酸卵磷脂、血小板激活因子、磷脂醯甘油，磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇-4-磷酸、磷脂醯肌醇-4、5-二磷酸鹽、心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂、與生物有關的磷脂的衍生物、磷脂醯乙醇胺的衍生物、磷酸卵磷酯的衍生物、磷脂醯肌醇和磷脂醯肌醇磷酸的衍生物、磷脂酸的衍生物、磷脂醯甘油的衍生物、心磷脂衍生物、甘油二酯的衍生物、磷脂醯乙醇胺-NH2末端基團、己醯胺基團、十二烷基醯胺基團、磷脂醯巰乙胺、丁二醯基團、戊二醯基團、十二烷羧基基團、生物素基團、磷脂醯乙二醇、生物素化的磷脂帽、脂肪酸修飾的衍生物、溶血磷脂膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯甘油、溶血磷酸甘油酯、溶血磷脂酸、烷基磷酸膽鹼、氧化的脂質、生物素化的脂質、縮醛磷脂、聚合的磷脂、滷代磷脂、氟化磷脂、同位素標記磷脂、聚PEG化的磷脂、PEG末端有功能基團的聚PEG化磷脂DSPE-mPEG-Carboxylic Acid、DSPE-mPEG-Maleimide、DSPE-mPEG-PDP、DSPE-mPEG-Amine、DSPE-mPEG-Biotin或DSPE-mPEG-BCT。
4.根據權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於所說的表面活性劑為棕櫚酸、油酸或亞麻酸。
5.根據權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於所說的穩定劑為甘露醇、丙三醇或聚乙二醇。
6.根據權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝，其特徵在於所說的氣體為氮氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、惰性氣體、硫氟化物、全氟碳，全氟化的酮、全氟化的醚、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
7.按照權利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑的製備工藝製得的活性劑，其特徵在於每支藥物含1-25mg的脂質-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH、25-1mg的DPPG、0.01-0.4mg的表面活性劑、0.1-5.0mg的穩定劑和0.01-1.0Mpa的氣體。
全文摘要
本發明涉及一種血栓診斷和/或治療用含氣乾粉活性劑及其製備工藝，該活性劑為凍乾粉，由多肽分子，脂質，表面活性劑，穩定劑和氣體構成；活性分子為多肽，能與血栓形成時活化的血小板高親和力特異性結合，並對其有強烈的抑制作用，兼具血栓的靶向高親和力和強的溶栓作用。使用時加入溶劑振蕩形成藥液，經靜脈注射給藥，可實現血栓靶向超聲成像，同時有強的溶栓活性。
文檔編號C07K7/00GK1727008SQ20051004276
公開日2006年2月1日 申請日期2005年6月7日 優先權日2005年6月7日
發明者王冰, 王梅, 艾紅, 李義平, 王亞文, 鄭黎明, 臧偉進 申請人:西安交通大學, 陝西嘉維科技發展有限公司