Esat6和cfp10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用的製作方法

2023-04-29 18:32:26

專利名稱：：Esat6和cfp10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬醫學免疫學診斷
技術領域：
，特別涉及結核分枝桿菌ESAT6和CFP10蛋白作為皮膚變態反應原在在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用。
背景技術：
：在全世界結核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，1985年以來愛滋病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美發達國家結核病發病率呈回升趨勢，尤其是結核菌耐藥問題和非結核分枝桿菌病的發病率逐年上升使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增結核病人8001000萬，每年死亡人數約300萬。1993年世界衛生組織(WHO)史無前例地宣布"全球結核病緊急狀態"，1998年又重申遏制結核病的行動刻不容緩。中國的結核病疫情和耐藥情況都相當嚴重，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查初步結果表明，中國有5.5億人感染了結核菌；現有肺結核病人451萬，其中傳染性肺結核病人196萬；每年死亡人數約13萬，結核病死亡在中國各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位；分離出的分枝桿菌中，結核分枝桿菌佔86.4%,牛分枝桿菌佔2.5%，非結核分枝桿菌佔11.1%,非結核分枝桿菌的比率較前明顯增加。因此，結核病的早期診斷、鑑別診斷和流行病學調查對結核病的早期、有效化療和控制結核菌傳播都有極其重要的意義。舊結核菌素、純蛋白衍化物(PPD)是結核分枝桿菌培養濾液蛋白，其作用於人體會激發已致敏機體產生細胞免疫反應，激活T淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，釋放大量細胞因子，並使這些細胞增殖、聚集，包裹抗原形成結節，這就是遲髮型變態(DTH)反應，其反應強度與細胞免疫呈平行關係。舊結核菌素不易標準化和易發生非特異性反應，目前已經很少使用。PPD皮膚試驗已成為目前臨床上最常用且最簡便的一種結核菌感染診斷方法，反應越強，表示結核感染可能性越大，中國一直使用硬結》5mm為陽性，>20mm或有水泡、壞死、淋巴結炎等為強陽性，3歲以下兒童》15mm為強陽性的標準。但由於PPD中含有許多分枝桿菌(包括致病性分枝桿菌、環境中非致病性分枝桿菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮試陽性並不能鑑別是因為結核分枝桿菌複合群感染，還是接觸環境中非結核分枝桿菌或卡介苗接種後3造成的致敏。因此，PPD皮試診斷結核菌感染的特異性差，用該方法進行結核病流行病學抽樣調查獲得的結核菌感染率是不準確的，並不能真正反映人群中結核菌感染的實際狀況。目前許多學者都在研究新的抗原作為皮膚變態反應原，以期建立新的結核皮膚診斷試劑。如研究應用38kDa蛋白(又稱為Phos蛋白、抗原78、Pab蛋白、抗原5)或6kDa早期分泌抗原耙(6kDaearlysecretoryantigenictarget,簡稱ESAT6)作為皮膚試驗的抗原。38kDa蛋白是脂蛋白，既存在於分枝桿菌細胞內，又分泌於細胞外，是結核分枝桿菌培養濾液中的主要成分之一，其編碼序列與大腸桿菌磷酸結合蛋白Phos有51%的同源性。目前的研究已表明天然的38kDa蛋白和重組的38kDa蛋白的免疫原性一致，均可誘導結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌致敏的豚鼠產生DTH反應，缺乏種特異性；38kDa蛋白(抗原5)也可誘導PPD皮試陽性的人體產生典型的DTH反應，但似乎其特異性和敏感性均不如PPD;進一步研究發現38kDa蛋白抗原C末端附近存在一個免疫原性強的T細胞抗原決定簇，其合成多肽38,G(350-369位胺基酸)是結核分枝桿菌複合群特異的，可誘導結核分枝桿菌、BCG致敏小鼠和PPD皮試陽性的健康人產生DTH反應。與PPD相比，合成多肽38.G特異性有所改善，能鑑別結核分枝桿菌複合群和非結核分枝桿菌感染，但依然不能鑑別結核分枝桿菌感染和BCG接種。因此，38kDa蛋白並不是結核病特異的皮膚診斷試劑。ESAT6蛋白是一種低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，理論上推導的分子量為9，904Da，等電點為pl4.5。但經雙向凝膠電泳和免疫印跡轉移分析發現該蛋白有兩個等電點pI4和p14.5，這可能與蛋白質的修飾有關，如醯胺側鏈的脫醯胺作用、氧化作用或磷酸化作用。在未變性條件下，凝膠過濾和SDS-PAGE顯示其分子量為24kDa，可能是該蛋白的自然構型為多聚體所致；在變性條件下，SDS-PAGE顯示其分子量為6kDa;而質譜分析其分子量為9，890土10Da，未發現多聚體形式，說明所形成的多聚體之間的聯繫可能是非常弱的。它由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和少數致病性分枝桿菌基因組的RD1區域編碼，但所有卡介苗菌株及絕大部分環境分枝桿菌基因組均丟失該區域，不表達ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多個T淋巴細胞抗原表位，該蛋白或其多肽可作為T細胞刺激抗原，可用作皮膚試驗抗原用於診斷結核菌感染、活動性結核病。本發明人曾於2005年3月18日向國家專利局提交過一份名稱為"診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑"的發明專利申請，該專利申請於2005年10月19日公開。該試劑用於診斷結核菌感染、活動性結核病靈敏度低。CFP10是一個由Rv3874基因編碼的100個胺基酸的蛋白，其基因位於ESAT6基因的上遊，與ESAT6編碼基因均位於RD-l區，屬於同一個lhp-exe操縱子，由同一個啟動子調節轉錄，兩者分布於相同的分枝桿菌中，其基因存在於結核分枝桿菌複合群和少數其他分枝桿菌(如胃、堪分枝桿菌)中，但在BCG所有菌株中均未發現其基因。CFP10計算分子量10,794kDa，SDS-PAGE電泳分子量約10-11kDa。CFP10序列與ESAT6基因有約40X的同源性，其蛋白也屬於ESAT6家族的成員之一，兩者具有相同的免疫學特性。CFP10蛋白也含有多個T淋巴細胞抗原表位，該蛋白或其多肽均可作為T細胞刺激抗原。ESAT6蛋白和CFP10蛋白所具有的T淋巴細胞抗原表位不同，不同遺傳背景的結核感染者對這兩種抗原的反應也不完全相同，一部分結核感染者對這兩種抗原的刺激均產生反應，而部分結核感染者只對ESAT6蛋白或CFP10蛋白起反應。單獨應用ESAT6蛋白作為刺激抗原，部分結核感染者由於對ESAT6蛋白不反應而造成漏診。因此，提供一種高靈敏度的用於鑑定診斷結核病的藥物就成為本
技術領域：
急需解決的問題。
發明內容本發明的目的是為克服已有技術的不足之處，提供一種ESAT6和CFP10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用，可用於鑑別卡介苗接種者、特異地檢測結核菌感染的皮膚診斷變態反應原，用於人類或動物結核菌感染的檢測及其使用方法、劑量和判斷標準。本發明的上述目的是通過以下技術方案達到的ESAT6和CFP10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用，其特徵在於，所述用於鑑定診斷結核病的藥物由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，所述的結核變態反應原採用ESAT6和CFP10混合蛋白。所述的ESAT6和CFP10蛋白可為天然的ESAT6和CFP10蛋白或通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白。所述的用於鑑定診斷結核病的藥物中的ESAT6和CFP10蛋白終濃度分別為6-15yg/ffll。本發明用於動物的用於鑑定診斷結核病的藥物的具體使用方法包括以下步驟吸取用於鑑定診斷結核病的藥物0.lml，所述的用於鑑定診斷結核病的藥物為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白濃度分別為6iig—15^g;注射於動物的皮內，如豚鼠的背部、猴子的上眼瞼等，於注射後24小時測量、記錄注射部位紅腫的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應(即有無過敏、水泡等症狀)。反應紅腫平均直徑》5mm者為陽性反應，其中反應紅腫平均直徑》5mm、<10mm者為弱陽性反應，反應紅腫平均直徑^10mra、〈20mm者為中等陽性反應，凡是反應紅腫平均直徑》20mm均屬強陽性反應。本發明用於人體的上述用於鑑定診斷結核病的藥物的具體使用方法包括以下步驟.-吸取用於鑑定診斷結核病的藥物0.lml，所述的用於鑑定診斷結核病的藥物為每毫升稀釋液中的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白濃度分別為6ug—15ixg;皮內注射於人的前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應(即有無過敏、水泡、淋巴結炎等症狀)。反應硬結平均直徑^5mm者為陽性反應，其中反應硬結平均直徑^5mra、〈lOmin者為弱陽性反應，反應硬結平均直徑^10mra、〈20咖者為中等陽性反應，凡是反應硬結平均直徑^20鵬均屬強陽性反應。本發明的特點及技術效果-本發明將ESAT6和CFP10蛋白作為結核皮膚變態反應原，用於皮膚試驗診斷結核菌感染和活動性結核病。其檢測結核菌感染的特異度顯著高於PPD皮試法和38kDa蛋白皮試法；靈敏度高於單獨應用ESAT6蛋白進行皮試，而且ESAT6和CFP10抗原為基因工程重組蛋白，製備簡便、價廉，檢測費用較低。本發明人研究證明應用ESAT6和CFP10蛋白作為結核變態反應原製備成用於鑑定診斷結核病的藥物，可引起結核感染的人體或動物產生免疫應答。該用於鑑定診斷結核病的藥物可特異地誘導結核感染者產生遲髮型變態反應，可鑑別是BCG接種、環境中非結核分枝桿菌感染後造成的致敏還是真正的結核分枝桿菌感染，可用於結核菌感染檢測、結核病臨床診斷和鑑別診斷、機體免疫反應監測。下面通過附圖和具體實施方式對本發明做進一步說明，但並不意味著對本發明保護範圍的限制。圖1是本發明實施例1中pET24b-ESAT6重組質粒的酶切鑑定結果。圖2是本發明實施例1中pET32a-CFP10重組質粒的酶切鑑定結果。圖3是本發明實施例1中重組質粒pET24b-ESAT6DNA序列分析結果。圖4本發明實施例1中重組質粒pET32a-CFP10DNA序列分析結果。圖5是本發明實施例1中SDS-PAGE鑑定重組ESAT6在大腸桿菌中的表達。圖6為本發明實施例1中SDS-PAGE鑑定重組CFP10在大腸桿菌中的表達。圖7為本發明實施例1中重組ESAT6蛋白的SDS-PAGE分析結果。圖8為本發明實施例1中不同的誘導溫度下CFP10目的蛋白在可溶性蛋白中的含量分析。圖9為本發明實施例1中SDS-PAGE鑑定純化的重組ESAT6蛋白。圖10為本發明實施例1中重組CFPIO蛋白的親和層析純化。圖11為本發明對比例2中應用TSPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測。圖12為本發明對比例3中應用TSPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測。具體實施方式實施例1一、用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備-(一)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白作為結核變態反應原；1、引物設計與合成esat6引物設計Pl(上遊)..含限制性內切酶NheI位點5'-GCTAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAAT-3'P2(下遊)含限制性內切酶XhoI位點5'—CTCGAGTGCGAACATCCCAGTGACG-3'擴增片段299bpcfp10引物設計P3(上遊)含限制性內切酶KpnI位點5，-CGAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGATGGCAGAGATGAAGACCGA-3，P4(下遊)含限制性內切酶EcoRI位點5，-CGGAATTCTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3，擴增片段300bp2、PCR擴增esat6和cfp10基因分別用P1、P2和P3、P4引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴增ESAT6和CFP10基因。PCR反應程序94。C預變性3niin;94°C30sec，55°C30sec，68°Clmin，循環30次；最後72。C延伸7min。於1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定299bp(esat6)、300bp(cfp10)的擴增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結束後，在長波紫外線照射下，用乾淨的手術刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mlI型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入150WII型7柱子清洗液，離心1200rpm2-3min以清洗和乾燥樹脂；將微量離心柱插入一個新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入40WTE緩衝液，靜置一分鐘，12,000rpra離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ngA4。貯存於-2(TC備用。4、目的基因與pGEM-T載體連接參照Promega公司pGEM-TvectorSystem-I產品說明，將50ng純化後的PCR產物與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合，10yl反應體系如下2X連接緩衝液pGEM-T載體PCR產物0.6J4LDNA連接酶1W無菌水補至10Ml混勻後置於4T:冰箱反應12h，75""C滅活10min，冰浴後直接進行轉化。5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞的製備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種於5mlLB培養液中，置37°C振蕩培養箱中於200rpm培養過夜；次晨按1/100轉種於100mlLB培養液中，置37。C振蕩培養箱中於200rpm繼續培養2-3h，待菌濃度ODe。。為0.6-0.8時，放入用冰預冷的大離心管中，於4。C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預冷的0.lmol/LCaC12重懸菌沉澱，冰浴30min;4°C、6000rpm、離心10min，棄上清；用4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉澱，置4卩冰箱放置過夜；次晨加入lml無菌甘油，吹打混合均勻，每分裝於一個1.5ml的離心管中，置-7(TC保存備用。6.連接產物的轉化將目的基因片段與PGEM-T的連接產物各分別加入含有大腸桿菌DH5a感受態細胞的離心管中，冰浴0.5h;放入42。C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培養液400Hl，37。C恆溫搖床培養1h;加入X-Gal60Ml，IPTG4W，混勻，取出2001^1塗布於含有60ug/ml氨苄青黴素的LB平板上。倒置平板，放37t:恆溫培養箱培育14h。7.質粒的提取根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落5個，分別接種於5ml含有60Pg/ral氨苄青黴素的LB培養基中，置37t:振蕩培養過夜；根據《分子克隆》鹼裂解方法，小量提取質粒。(1)質粒小量提取試劑的配製溶液I:50mmol/L葡萄糖25,1/LTrisCL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)8在10lbf/in2(6.895X101Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲存於4'C備用。溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS臨用前配製溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸li.5ml去離子水28.5ml貯存於4"C，備用。(2)小量提取質粒分別取約3.0ml菌液置離心管中，於12，000rpm離心lmin，棄上清；細菌沉澱重懸於200W溶液I中，冰浴10rain;加400W新配製的溶液II，冰浴5min;加300W溶液III，冰浴10min;於4°C12，000rpm離心lOmin;上清液移入乾淨的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無水乙醇充分混合，於-20'C放置2h沉澱DNA;於4。C12，000rpm離心10min，棄上清；用lml70%乙醇洗滌沉澱一次，室溫充分乾燥；將沉澱溶於TE緩衝液中，加入無面A酶的胰RNA酶，使其終濃度為20Pg/ml，於37。C水浴30min，消化RNA;取進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、定量，置一2or儲存備用。8.鑑定重組質粒(1)PCR擴增鑑定以挑選的菌落質粒DNA為模板，以相應的引物P1、P2或P3、P4進行PCR擴增，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，陽性重組質粒命名為PGEM-ESAT6或PGEM-CFPIO。(2)酶切鑑定取重組質粒PGEM-ESAT65W，分別用限制性內切酶NheI和Xhol雙酶切2h;取重組質粒PGEM-CFP105W，分別用限制性內切酶KpnI和EcoRI雙酶切2h;於1%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標準及擴增產物為對照，酶切後的片斷與擴增片斷一致。(3)序列測定直接挑選一個克隆送測序。測序結果與報導的基因組序列一致。9.重組表達質粒的構建(1)ESAT6重組表達質粒的構建用限制性內切酶NheI和Xhol雙酶切pGEM-ESAT6重組質粒DNA和表達載體pET24b質粒DNA，於1%瓊脂糖凝膠中電泳，切取291bp的ESAT6基因片段和5.27kb的pET24b質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量後，ESAT6基因片段與pET24b質粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，在LDNA連接酶催化下，於16。C連接過夜，次日取連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，置37'C恆溫箱孵育14h。挑選4個克隆分別轉種於5ml含50yg/ml硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37。C恆溫振蕩器培養過夜，用鹼裂解法提取質粒。(2)CFP10重組表達質粒的構建用限制性內切酶KpnI和EcoRI雙酶切pGEM-CFP10重組質粒DNA和表達載體pET32a質粒DNA，於1%瓊脂糖凝膠中電泳，切取300bp的CFP10基因片段和5.857kb的pET32a質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量後，CFP10基因片段與pET-32a質粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，在T4DNA連接酶催化下，於16°。連接過夜，次日取連接產物5W轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，置37'C恆溫箱孵育14h。挑選4個克隆分別轉種於5ml含50"g/ml硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37'C恆溫振蕩器培養過夜，用鹼裂解法提取質粒。10.重組表達質粒的鑑定採用雙酶切和DNA測序鑑定重組表達質粒；鑑定正確的陽性克隆命名為pET24b-ESAT6(見圖l、3)及pET32a-CFP10(見圖2、4)。如圖1所示，本發明實施例1中pET24b-ESAT6重組質粒的酶切鑑定結果。圖1中的1為LambdaDNA-HindIII分子量標準23.13，9.416，6.557，4.361，2.322，2.027,0.564，0.125kb;2為pET24b-ESAT6重組質粒；3為pET24b-ESAT6重組質粒限制性內切酶NheI和Xhol酶切後。如圖2所示，本發明實施例1中pET32a-CFP10重組質粒的酶切鑑定結果。圖2中的1為300bp分子量標準；2為pET32a-CFP10重組質粒限制性內切酶KpnI和EcoRI酶切後和效果。如圖3所示，是本發明實施例1中重組質粒pET24b-ESAT6DNA序列分析結果。如圖4所示，是本發明實施例1中重組質粒PET32a-CFP10DNA序列分析結果。11、pET24b-ESAT6和pET32a-CFP10工程菌的誘導表達及鑑定將pET24b-ESAT6和pET32a-CFP10質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉種於5ml含50tig/ml硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37'C恆溫振蕩器培養過夜，然後按1%轉種到10ml含50Pg/ral硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37。C恆溫振蕩器培養至OD600為0.6—0.8時，加入IPTG，誘導3—4hr。將1X載樣緩衝液加入來自lml菌液的沉澱樣本，混懸後，置IOCTC沸水浴5rain，於12000rpm離心10min，取上清液40W進行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恆流lOmA，分離膠恆壓15mA，待溴酚藍電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰，觀察是否有目的蛋白表達條帶。結果如圖5和6所示。圖5是本發明實施例1中SDS-PAGE鑑定重組ESAT6在大腸桿菌中的表達。其中，l為蛋白質中等分子量標準(24，20，14.2kDa);2為IPTG誘導前的表達；3-6分別為IPTG誘導後1，2，3，4小時的表達。圖6為本發明實施例1中SDS-PAGE鑑定重組CFP10在大腸桿菌中的表達。其中，l為蛋白質中等分子量標準(97.4，66.2，42.7，31.0，20.1，14.4);2-4為含載體質粒pET32a的大腸桿菌BL2lUDE3);5-10為含重組質粒pET32a-cfp10的大腸桿菌BL21(入DE3);2，5,8為IPTGi秀導1h;3,6,9為IPTG誘導2h;4，6,10為IPTG誘導4h。從圖5和6可以看出，工程菌IPTG誘導3-4h表達量最多。將誘導菌超聲破碎後的上清液和沉澱部分進行SDS-PAGE，所得結果見圖7。圖7為重組ESAT6蛋白的SDS-PAGE分析結果。其中，1-3為純化的重組ESAT6蛋白；4，5分別為重組ESAT6表達菌超聲破碎後的沉澱和上清液；6為重組ESAT6大腸桿菌IPTG誘導後的結果。從圖7可以看出，pET24b-ESAT6工程菌的沉澱部分可見較明顯的特異蛋白表達帶，而上清液中只見極少量特異蛋白表達帶，說明表達的重組ESAT6大多以細胞內不溶性包涵體的形式存在。將不同的誘導溫度下的CFP10目的蛋白在可溶性蛋白中的含量進行分析，結果見圖8。其中，l為蛋白質中等分子量標準(97.4，66.2,42.7，31.0，20.1，14.4);2為含載體質粒pET32a的大腸桿菌BL21(入DE3);3為含重組質粒pET32a-cfp10的大腸桿菌BL21(人DE3);4—6為重組CFP10表達菌超聲破碎後的沉澱；7—10為重組CFP10表達菌超聲破碎後的上清液；2,3，4,7為誘導溫度37'C時的結果；5，8為誘導溫度為32'C時的結果；6，9，10為誘導溫度為30。C時的結果。從圖8可以看出，pET32a-CFP10工程菌在30"C時，CFP10重組蛋白均出現在破碎的上清中，沉澱極少，說明該重組蛋白主要以可溶性形式表達，經過凝膠掃描分析該蛋白佔總可溶性蛋白的50%以上。12.ESAT6、CFP10重組蛋白的純化(1)採用Novagen公司生產的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說明書直接純化ESAT6融合蛋白，SDS-PAGE電泳見圖9。如圖9所示，為SDS-PAGE鑑定純化的重組ESAT6蛋白。其中，1為蛋白質中等分子量標準(24，20，14.2kDa);2為純化的重組ESAT6蛋白；3為重組ESAT6工程菌IPTG誘導前；4為重組ESAT6工程菌IPTG誘導後4小時。從圖9可以看出，純化的ESAT6融合蛋白呈一條帶，未見其他雜蛋白，經過掃描分析純度在95%以上。(2)在5L的發酵罐中發酵培養了3LpET32a-CFP10工程菌進行誘導表達，發酵完成後收集細菌，進行超聲破碎細菌離心收集上清進行親和層析，採用咪唑進行梯度洗脫，目的蛋白得到了很好的純化，經過凝膠電泳掃描分析純度可以達到90%以上。將親和層析的樣品進行透析濃縮後進行腸激酶消化，然後再進行親和層析，得到了比較純的CFPIO，最後經過凝膠過濾層析去除微量的腸激酶，得到了CFP10純品，對於重組CFP10蛋白的親和層析純化所得結果見圖10。其中，1,9為蛋白質中等分子量標準(97.4,66.2，42.7,31.0，20.1，14.4);2為含載體質粒pET32a的大腸桿菌BL21(ADE3);3為含重組質粒pET32a-cfp10的大腸桿菌BL21(入DE3);4為重組CFP10表達菌超聲破碎後的上清液；5-7為親和層析後的重組CFP10樣品；8為腸激酶消化、親和層析後的重組CFP10樣品；10為s印hacrylS100凝膠過濾層析後的重組CFP10樣品。從圖10可以看出，經過掃描分析純度在95%以上。(二)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(三)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白，使其終濃度分別為10ug/ml，除菌濾過，檢定，分裝入一容器，lml/支，置4"C避光保存備用。(四)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白，使其終濃度分別為20ug/ml，兩者等體積混勻後，混合蛋白中ESAT6與CFP10蛋白的終濃度分別為10ug/ml，除菌濾過，檢定，分裝入一容器，lml/支，置4t避光保存備用。二、動物模型的製備1.細菌培養將結核分枝桿菌H37Rv接種在改良羅氏培養基上，於37。C培養4周，用生理鹽水衝洗下培養基表面的結核分枝桿菌H37Rv菌落，吸入一支事先稱好重量的新的無菌離心管中，於8(TC滅活2個小時。於4000rpm離心10分鐘，將上清液吸到一支新的無菌離心管中，稱量並計算出菌體沉澱的重量；用吸出的上清液將菌體沉澱稀釋為80mg/ml。2.菌懸液製備將80mg/ml的菌懸液超聲破碎後，取2ral，加入等體積的福氏不完全佐劑，混勻，使其終濃度為40mg/ml。3.動物準備從中國預防醫學科學院流行病學研究所購進有合格證的體重為250g左右的豚鼠12隻，雌雄各半。放動物實驗室餵養1周後，取PPD0.lral皮內注射，於24小時觀察皮試反應，結果12隻豚鼠24小時皮試反應均陰性，可用於進一步的試驗。4.動物免疫:將皮試反應陰性的豚鼠隨機分為2組，雌雄各半。一組豚鼠於後肢腹股溝處，皮下注射市售卡介苗0.2ml1次；另一組豚鼠於後肢腹股溝處，皮下注射40mg/ml的結核分枝桿菌混懸液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周後，對兩組豚鼠拔毛，取PPDO.lml皮內注射，於24小時、48小時、72小時觀察皮試反應，結果各組豚鼠於24小時、48小時皮膚反應均為陽性(結果見表l)，72小時皮膚反應均為陰性，雌、雄豚鼠皮膚反應無顯著差異，說明結核菌免疫成功。12表1豚鼠免疫後PPD皮膚試驗24小時、48小時皮膚紅腫反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage13上述用於鑑定診斷結核病的藥物在豚鼠結核病模型中的應用:1.皮膚試驗對兩組豚鼠背部拔毛，以輪圈法皮內注射PPD、重組ESAT6蛋白、重組CFP10蛋白及重組ESAT6蛋白與重組CFP10蛋白的混合液各0.lml，於注射後24小時、48小時、72小時分別測量豚鼠背部各注射點皮膚紅腫的縱、橫直徑大小(mm)，記錄其平均值。2.結果24小時、48小時皮膚反應結果見表2、3;72小時皮膚反應均小於5mm，為陰性；雌、雄豚鼠皮膚反應無顯著差異。表2豚鼠不同蛋白皮膚試驗24小時皮膚紅腫反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage13表3豚鼠不同蛋白皮膚試驗48小時皮』tableseeoriginaldocumentpage13實施例21.用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10u1聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(3)用稀釋液將所述的結核分枝桿菌重組ESAT6稀釋成1、2、4、6、8、10ug/ml，除菌濾過，分裝入一容器，lml/支，置4'C避光保存備用。2.動物模型的製備(1)細菌培養將結核分枝桿菌H37Rv接種在改良羅氏培養基上，於37'C培養4周，用生理鹽水衝洗下培養基表面的結核分枝桿菌H37Rv菌落，吸入一支事先稱好重量的新的無菌離心管中，於S0。C滅活2個小時。於4000rpm離心10分鐘，將上清液吸到一支新的無菌離心管中，稱量並計算出菌體沉澱的重量；用吸出的上清液將菌體沉澱稀釋為80mg/ml。(2)菌懸液製備將80mg/ml的菌懸液超聲破碎後，取2ml，加入等體積的福氏不完全佐劑，混勻，使其終濃度為40rag/ml。(3)動物準備從中國預防醫學科學院流行病學研究所購進有合格證的體重為250g左右的豚鼠36隻，雌雄各半。放動物實驗室餵養l周后，取PPD0.lml皮內注射，於24小時觀察皮試反應，結果36隻豚鼠24小時皮試反應均陰性，可用於進一步的試驗。(4)動物免疫分別於豚鼠後肢腹股溝處，皮下注射O.lml(5mg)滅活的結核分枝桿菌H37Rv全菌體，一周致敏一次，共致敏4次，最後一次致敏後l周進行皮膚試驗。3.上述用於鑑定診斷結核病的藥物在豚鼠結核病模型中的應用(1)常規皮試法將致敏豚鼠隨機分成6組，每組6隻，雌雄各半。背部剪毛，以稀釋液、5IUPPD為對照，每隻豚鼠在同一部位注射同一劑量的抗原，注射量均為O.lml，皮內注射後24h、48h、72h分別測量豚鼠背部各注射點皮膚紅腫的縱、橫直徑大小(mm)，記錄其平均值。24小時、48小時皮膚反應結果見表4，0.1ug、0.2yg重組ESAT6抗原組平均皮膚硬結直徑顯著小於PPD;0.4ug、0.6pg、0.8ug重組ESAT6抗原組平均皮膚硬結直徑與PPD對照品相似；1.0ixg重組ESAT6抗原組平均皮膚硬結直徑顯著大於PPD。72小時皮膚反應均小於5mm，為陰性。稀釋液對照組，豚鼠局部皮膚無紅腫、硬結反應。表4重組ESAT6抗原常規皮試法誘髮結核菌致敏豚鼠皮膚反應結果14,,wB紅腫反應平均值X士SD(mm)組別劑量-24小時48小時稀釋液對照組51U8.25±1.737.41±1.220.1lig6.67±0.815.33±0.440.2g6.83±0.755.67±0.670.4Ug8.33±1.037.16±0.560.6g9.33±2.257.40±0.880.8yg9.33±1.758.00±1.671.0Pg9.67±1.218.00±0.67(2)輪圈法皮膚試驗為排除豚鼠個體差異，採用輪圈法在一隻豚鼠背上注射PPD及不同劑量的重組ESAT6抗原，研究影響豚鼠皮膚變態反應反應的因素劑量效應、時間效應、豚鼠性別。取6隻豚鼠，雌雄各半，以輪圈法注射於豚鼠背部一側，每側6個點，稀釋液、5IUPPD、0.4yg、0.6ixg、0.8ug、l.Oiig重組ESAT6抗原，注射量均為0.lml，皮內注射後24h、48h、72h分別測量豚鼠背部各注射點皮膚紅腫的縱、橫直徑大小(mm)，記錄其平均值。結果見表5。1)劑量效應結果表明重組ESAT6抗原從低劑量到高劑量組誘發豚鼠皮膚變態反應的絕對值逐漸升高，但0.4ug—1.0wg重組ESAT6抗原與PPD對照品誘發豚鼠皮膚變態反應的效果差異無顯著性。2)時間效應重組ESAT6抗原誘發豚鼠皮膚變態反應，隨著時間的延長，平均絕對值變小。0.lug、0.2ug、0.4ug、0.6yg、0.8wg、l.Oixg劑量誘發豚鼠皮膚變態反應，24h、48h、72h之間均有差異，24小時的平均直徑顯著大於48小時的平均直徑，48小時的平均直徑顯著大於72小時的平均直徑。大部分豚鼠在注射後72小時皮膚皮膚變態反應直徑小於5ram，無實際意義。3)豚鼠性別效應豚鼠雌雄個體之間皮膚變態反應強度略有不同，大部分雄豚鼠皮膚變態反應強於雌豚鼠，雄豚鼠皮膚變態反應的平均直徑高於雌豚鼠，但無顯著差別。表5重組ESAT6抗原輪圈皮試法誘髮結核菌致敏豚鼠皮膚反應結果抗原'紅腫反應平均^f直X±SD(mm)劑量24小時48小時稀釋液對照組一-PPD對照組5IU7.33±0.896.33±0.44重組ESAT6抗原(3)結論應用結核分枝桿菌重組ESAT6抗原誘發滅活結核菌致敏豚鼠的皮膚變態反應，0.6—0.8ug的劑量較合適，皮內注射後24、48小時是皮膚反應較理想的觀測時間，雌雄豚鼠的皮膚反應無顯著差別。實施例31.用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組CFP10蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(3)用稀釋液將所述的結核分枝桿菌重組CFP10稀釋成2、4、6、8、10、12ug/ml，除菌濾過，分裝入一容器，lml/支，置4。C避光保存備用。2.動物模型的製備(1)細菌培養將結核分枝桿菌H37Rv接種在改良羅氏培養基上，於37"C培養4周，用生理鹽水衝洗下培養基表面的結核分枝桿菌H37Rv菌落，吸入一支事先稱好重量的新的無菌離心管中，於8(TC滅活2個小時。於4000rprn離心10分鐘，將上清液吸到一支新的無菌離心管中，稱量並計算出菌體沉澱的重量；用吸出的上清液將菌體沉澱稀釋為80mg/rnl。(2)菌懸液製備將80mg/ml的菌懸液超聲破碎後，取2ml，加入等體積的福氏不完全佐劑，混勻，使其終濃度為40mg/ml。(3)動物準備從中國預防醫學科學院流行病學研究所購進有合格證的體重為250g左右的豚鼠6隻，雌雄各半。放動物實驗室餵養l周后，取PPDO.lml皮內注射，於24小時觀察皮試反應，結果6隻豚鼠24小時皮試反應均陰性，可用於進一步的試驗。(4)動物免疫分別於豚鼠後肢腹股溝處，皮下注射40rag/ml的結核分枝桿菌混懸液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周後，對兩組豚鼠拔毛，取PPDO.lml皮內注射，於24小時、48小時、72小時觀察皮試反應，結果各組豚鼠於24小時、48小時皮膚反應均為陽性。0.4Ug7.25±0.835.83±0.440.6Ug7.42±0.756.38±0.780.8"g7.75±0.926.67±1.00l.Oiig8.00±0.676.83±0.56重組ESAT6抗原3.上述用於鑑定診斷結核病的藥物在豚鼠結核病模型中的應用(l)輪圈法皮膚試驗為排除豚鼠個體差異，採用輪圈法在一隻豚鼠背上注射PPD及不同劑量的重組CFP10抗原，研究影響豚鼠皮膚變態反應反應的因素劑量效應、時間效應、豚鼠性別。取6隻豚鼠，雌雄各半，以輪圈法注射於豚鼠背部一側，每側8個點，稀釋液、5IUPPD、0.2ug、0.4yg、0.g、0.g、1.0yg、1.g重組CFP10抗原，注射量均為0.lml，皮內注射後24h、48h、72h分別測量豚鼠背部各注射點皮膚紅腫的縱、橫直徑大小(mm)，記錄其平均值。結果見表6。1)劑量效應結果表明重組CFP10抗原從低劑量到高劑量組誘發豚鼠皮膚變態反應的絕對值逐漸升高，但0.6yg—1.0"g重組ESAT6抗原與PPD對照品誘發豚鼠皮膚變態反應的效果差異無顯著性。2)時間效應重組ESAT6抗原誘發豚鼠皮膚變態反應，隨著時間的延長，平均絕對值變小。0.liig、0.2tig、0.4ug、0.6iig、0.8yg、l.Oug劑量誘發豚鼠皮膚變態反應，24h、48h、72h之間均有差異，24小時的平均直徑顯著大於48小時的平均直徑，48小時的平均直徑顯著大於72小時的平均直徑。大部分豚鼠在注射後72小時皮膚皮膚變態反應直徑小於5ram，無實際意義。3)豚鼠性別效應豚鼠雌雄個體之間皮膚變態反應強度無顯著差別。表6重組CFP10抗原輪圈皮試法誘髮結核菌致敏豚鼠皮膚反應結果紅腫反應平均值X土SD(mm)抗原劑量-24小時48小時(2)結論應用結核分枝桿菌重組CFP10抗原誘發滅活結核菌致敏豚鼠的皮膚變態反應，0.6—0.8iig的劑量較合適，皮內注射後24、48小時稀釋液對照組PPD對照組5IU0,2Ug0.4tig0.6tig0.8JJgl.Olig1.2tig8.58±1.525.58±1.026.67±1.377.83±1.128.83±1.048,75±1.109.25±1.166.5±1.483.67±1.034.67±1.375.17±1.176.75±1,046.58±U67.5±1.17重組CFP10抗原是皮膚反應較理想的觀測時間，雌雄豚鼠的皮膚反應無顯著差別。實施例41.用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10iil聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(3)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白，使其終濃度分別為10iig/ml;(4)將10yg/ml的重組ESAT6和CFP10蛋白按體積2:8(E2+C8)、4:6(E4+C6)、5:5(E5+C5)、6:4(E6+C4)、8:2(E8+C2)混合，ESAT6與CFP10混合蛋白的總濃度為10iig/ml，除菌濾過，分裝入一容器，lml/支，置4C避光保存備用。2.動物模型的製備(1)細菌培養將結核分枝桿菌H37Rv接種在改良羅氏培養基上，於37"C培養4周，用生理鹽水衝洗下培養基表面的結核分枝桿菌H37Rv菌落，吸入一支事先稱好重量的新的無菌離心管中，於8(TC滅活2個小時。於4000rpra離心10分鐘，將上清液吸到一支新的無菌離心管中，稱量並計算出菌體沉澱的重量；用吸出的上清液將菌體沉澱稀釋為80mg/ml。(2)菌懸液製備將80mg/ml的菌懸液超聲破碎後，取2ml，加入等體積的福氏不完全佐劑，混勻，使其終濃度為40mg/ml。(3)動物準備從中國預防醫學科學院流行病學研究所購進有合格證的體重為250g左右的豚鼠12隻，雌雄各半。放動物實驗室餵養1周後，取PPD0.lml皮內注射，於24小時觀察皮試反應，結果12隻豚鼠24小時皮試反應均陰性，可用於進一步的試驗。(4)動物免疫將皮試反應陰性的豚鼠隨機分為2組，雌雄各半。一組豚鼠於後肢腹股溝處，皮下注射市售卡介苗0.2ml1次；另一組豚鼠於後肢腹股溝處，皮下注射40mg/ml的結核分枝桿菌混懸液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周後，對兩組豚鼠拔毛，取PPDO.lml皮內注射，於24小時、48小時、72小時觀察皮試反應，結果各組豚鼠於24小時、48小時皮膚反應均為陽性。3.上述用於鑑定診斷結核病的藥物在豚鼠結核病模型中的應用(1)皮膚試驗對兩組豚鼠背部拔毛，以輪圈法皮內注射PPD、重組ESAT6蛋白、重組CFP10蛋白及重組ESAT6蛋白與重組CFP10蛋白不同體積的混合液各O.lml，於注射後24小時、48小時、72小時分別測量豚鼠背部各注射點皮膚紅腫的縱、橫直徑大小(mm)，記錄其平均值。(2)結果24小時、48小時皮膚反應結果見表7、8、9、10;72小時皮膚反應均小於5mm，為陰性。卡介苗免疫組對重組ESAT6蛋白、重組CFP10蛋白及重組ESAT6蛋白與重組CFP10蛋白不同體積的混合液均無反應。雌、雄豚鼠皮膚反應無顯著差異。結果表明ESAT6蛋白、CFP10蛋白及ESAT6與CFP10混合蛋白均可鑑別結核菌感染者和卡介苗接種者；ESAT6與CFP10不同濃度的混合蛋白的皮膚反應略強於單獨應用ESAT6蛋白、CFP10蛋白，說明兩者的刺激有一定的相加作用。表7結核菌免疫組豚鼠不同蛋白皮膚試驗24小時皮膚反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage19表8結核菌免疫組豚鼠不同蛋白皮膚試驗48小時皮膚反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage19表9卡介苗免疫組豚鼠不同蛋白皮膚試驗24小時皮膚反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage19表10卡介苗免疫組豚鼠不同蛋白皮膚試驗48小時皮膚反應平均直徑大小(mm)tableseeoriginaldocumentpage20對比例1採用結核PPD皮膚試驗檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院志願者1，女，43歲，身體健康。1.吸取結核PPD試劑O.lml，皮內注射於前臂掌側中央；2.注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑，並記錄有無異常反應；3.結果皮膚反應硬結平均直徑21mm，為強陽性反應，說明有結核菌感染。實施例51.用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(3)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白，使其終濃度分別為20yg/ml，兩者等體積混勻後，混合蛋白中ESAT6與CFP10蛋白的終濃度分別為10ug/ml，除菌濾過，檢定，分裝入一容器，lml/支，置4r避光保存備用。2.上述皮膚試劑在人體的應用(1)吸取上述用於鑑定診斷結核病的藥物0.lml，皮內注射於志願者1的前臂掌側中央，於注射後24、48、72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應；(2)結果24、48、72小時皮膚反應硬結平均直徑分別為18.5mm、15.5咖、9.5mm，為陽性反應，無異常反應。對比例2採用英國牛津免疫技術公司的TSPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院結核科住院患者張某，男，19歲，診斷繼發性肺結核雙肺塗(+)初治。1.人外周血單個核淋巴細胞的分離和培養抽取張某靜脈血4ml，放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒混勻後，加在淋巴細胞分離液上方，於3000rpm離心20分鐘；吸取白色的單個核細胞層，用8ml預熱至37。C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000rpm離心10min;重複l次；棄去上清液，加入400Ml預熱至37'C的含10X小牛血清的1640培養液重懸沉澱細胞，計數細胞數後，用含10%小牛血清的1640培養液調整細胞至2><106細胞/1111。2.在96孔濾膜板的陰性對照孔內加入50^L無血清培養液；在陽性對照孔內加入50"L陽性對照試劑；在A測試孔內加入結核桿菌ESAT6混合多肽A;在B測試孔內加入結核桿菌CFP10混合多肽B。3.每份樣品在陰性對照、陽性對照、測試？LA和測試？LB內分別加入IOOuL含有2xl5個外周單核細胞。4.將96孔濾膜板放入5%C02培養箱在37。C培養20小時。5.每孔加入200uLPBS洗板4次。6.加入50uL新鮮配製的工作濃度標記抗體。7.在4°C孵育60分鐘。8.每孔加入200yLPBS洗板4次。9.加入50yL底物液氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。10.i溫避光反應7分鐘。2211.用雙蒸水洗滌細胞培養孔。12.將板放在37。C烘箱中千燥。13.將96孔濾膜板放入美國CTL公司的ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析。結果見圖12。從圖12可以看出，檢測孔A的斑點數為4，為陰性；檢測孔B的斑點數為45，為陽性，說明該結核病患者對ESAT6的刺激不產生免疫反應，而對CFP10的刺激產生免疫反應。說明周某對ESAT6和CFP10的免疫反應。實施例71.用於鑑定診斷結核病的藥物(診斷結核菌感染、活動性結核病的特異性皮膚試劑)的製備(1)通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白作為結核變態反應原；(2)稀釋液的配製16g氯化鈉、0.4g氯化鉀、2.88g磷酸氫二鈉、0.48g磷酸二氫鉀、6g苯酚於1500ml蒸餾水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入10ul聚山梨酯80，加入鹽酸調節pH值至7.2，加雙蒸餾水定容至2000ml。(3)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白，使其終濃度分別為20iig/ml，兩者等體積混勻後，混合蛋白中ESAT6與CFP10蛋白的終濃度分別為10iig/ml，除菌濾過，檢定，分裝入一容器，lral/支，置4t:避光保存備用。(4)用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組ESAT6蛋白，使其終濃度分別為10ixg/ml，除菌濾過，檢定，分裝入一容器，lml/支，置4t:避光保存備用。2.上述皮膚試劑在人體的應用(1)吸取上述的重組ESAT6蛋白0.lml，皮內注射於志願者張某的左前臂掌側中央；吸取上述重組ESAT6和CFP10混合蛋白0.lml，皮內注射於志願者張某的右前臂掌側中央，於注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑(mm)，並記錄有無異常反應；(2)結果重組ESAT6蛋白72小時皮膚反應硬結平均直徑4畫，為陰性反應，無異常反應；重組ESAT6和CFP10混合蛋白為21mra，為強陽性反應，無異常反應。2權利要求1、ESAT6和CFP10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用，其特徵在於，所述用於鑑定診斷結核病的藥物由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，所述的結核變態反應原採用ESAT6和CFP10混合蛋白。2、根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的ESAT6和CFP10蛋白為天然的ESAT6和CFP10蛋白或通過基因工程技術克隆、表達、純化得到的結核分枝桿菌重組ESAT6和CFP10蛋白。3、根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的用於鑑定診斷結核病的藥物中的ESAT6和CFP10蛋白終濃度分別為6-15yg/ml。全文摘要本發明涉及ESAT6和CFP10蛋白在製備用於鑑定診斷結核病的藥物中的應用，其特徵在於，所述用於鑑定診斷結核病的藥物由稀釋液及溶於其中的結核變態反應原構成，所述的結核變態反應原採用ESAT6和CFP10混合蛋白。本發明將ESAT6和CFP10蛋白作為結核皮膚變態反應原，用於皮膚試驗診斷結核菌感染和活動性結核病。其檢測結核菌感染的特異度顯著高於PPD皮試法和38kDa蛋白皮試法；靈敏度高於單獨應用ESAT6蛋白進行皮試，而且ESAT6和CFP10抗原為基因工程重組蛋白，製備簡便、價廉，檢測費用較低。文檔編號A61K49/00GK101455847SQ200710179339公開日2009年6月17日申請日期2007年12月12日優先權日2007年12月12日發明者馮士生,吳雪瓊,張俊仙,張靈霞,豔梁,段海清,陽幼榮申請人:中國人民解放軍總醫院第二附屬醫院