轉aoc基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

2023-04-29 10:01:26

專利名稱：轉aoc基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是一種轉AOC
基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素 (artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對於腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法 (ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能。可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由於青蒿素結構複雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于于重的0. 1%，在芽中最高也只有於重的0. 16%，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的可行性也不高。經對現有技術文獻檢索發現，2010年，Lies Maes等在《New phytologist》(《新植物學家〉〉)發表了題為"Dissection of the phytohormonal regulation of trichome formation and biosynthesis of the antimalarial compound artemisinin in Artemisia annua plants"( 「分析植物激素調節腺毛形成和青蒿中青蒿素的合成」)的論文，報導通過噴灑茉莉酸類物質，既可促進青蒿中的腺毛的形成，又可以提高青蒿素合成途徑關鍵酶基因表達，進而提高青蒿素的含量。如果通過代謝工程提高青蒿植株中內源茉莉酸含量，那麼所產生的茉莉酸類物質就應該可以調節腺毛的發育和青蒿素合成途徑關鍵酶基因表達，從而大幅度據高青蒿中青蒿素的含量。現有技術中丙二烯氧化環化酶(Allene oxide cyclase, A0C)是青蒿茉莉酸合成途徑中的一個關鍵酶，採用基因工程手段，用關鍵酶基因AOC轉化青蒿，將打破青蒿中茉莉酸生物合成的限速瓶頸，獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供一條新途徑。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明建立了穩定提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用青蒿大規模生產青蒿素奠定堅實的基礎。本發明是通過以下技術方案實現的本發明從青蒿中克隆丙二烯氧化環化酶AOC基因，構建含AOC基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將AOC基因導入青蒿並再生出植株；PCR檢測外源目的基因AOC的整合情況，高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發明包括如下具體步驟(1)採用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因AOC ；(2)把AOC基因可操作性地連接於表達調控序列，形成含AOC基因的植物表達載體；(3)將含AOC基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化青蒿的含AOC基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青蒿植株；(5)對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿植株。所述的經PCR檢測的轉基因青蒿植株是指，分別設計合成AOC基因的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因青蒿植株。所述的HPLC-ELSD測定青蒿中青蒿素含量，方法為色譜柱C-18反相矽膠柱，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫30°C，流速1. OmL/min，進樣量10μ L，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大係數(gain)為7，載氣壓力^ar。本發明的轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，採用基因工程方法，將關鍵酶基因AOC導入青蒿植株中，獲得了青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿株系，在非轉化普通青蒿含量為1.5;3mg/gDW時，轉AOC基因青蒿中青蒿素的含量達到10. 17mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的6. 65倍，該發明對於為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。本發明涉及的根癌農桿菌是一種公開多年的生物材料，如中國專利文獻號 CN101665804，名稱培育根癌農桿菌介導的長春花轉基因植株的方法；中國專利文獻號 CN1778913，名稱根癌農桿菌介導的質粒對頂頭孢黴的轉化方法；等等。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1青蒿AOC基因的克隆1.青蒿基因組總RNA的提取取少量青蒿(採用產於重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)幼嫩葉片，用液氮速凍後，迅速用研缽研碎，加入盛有ImL TRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA)的 1. 5mL Eppendorf管中，充分振蕩後，於室溫下放置5min，加200 μ L氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-aiiin後，於4°C、12，OOOg離心15min ；將上清液(約600 μ L)吸入乾淨的1. 5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置IOmin後，於4°C、12，OOOg 離心IOmin ；棄上清，加ImL 75 %乙醇清洗，振蕩後，於4°C、7，500g離心5min ；室溫乾燥 15-20min後溶於適量(30-50 μ L) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量， 然後在分光光度計上測定RNA含量。2.青蒿AOC基因的RACE克隆根據擬南芥中相關基因所編碼的胺基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，採用 RACE (RapidAmp Iifi cat ion of cDNA Ends)方法(Clontech 公司 SMART RACE 試劑盒) 進行cDNA全長克隆，分三個階段進行①首鏈cDNA的合成利用SMART RACE試劑盒所提供的 5，-CDS primer A和 SMART II A oligo 引物， 以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成5，-RACE-Ready cDNA ； 利用Clontech試劑盒所提供的3』 -OTS primer A為引物，以所提取的總RNA為模板，在 PowerScript反轉錄酶的作用下合成3』 -RACE-Ready cDNA。②3，-RACE用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物2(GSP2) (SEQ ID NO 1)進行3，-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到PMD18-T載體上進行測序。③5，-RACE用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物I(GSPl) (SEQ ID NO 2)進行5，-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到PMD18-T載體上進行測序。將測序結果的重疊區拼接，得到該基因的完整編碼區序列。BLAST分析結果證明從青蒿中得到的基因確為一個丙二烯氧化環化酶的相關基因。通過上述步驟，獲得了青蒿中的丙二烯氧化環化酶蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO :3)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。實施例2含AOC基因的植物雙元表達載體的構建1.中間載體 pCAMBIA2300: :p!35S-gus-nos 的構建選用pBI121和pCAMBIA2300為基本元件，構建雙元植物表達載體 PCAMBIA2300: :p!35S-gus-nos。具體地，HindIII 和 EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA2300 質粒；回收PBI121的gus表達盒和pCAMBIA2300大片段；連接回收產物，轉化篩選，抽質粒酶切驗證。2.植物表達載體 pCAMBIA2300: :p!35S-AOC-nos 的構建以所述的pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos為表達載體，用實施例1中AOC 基因替換其上的gus基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pGEM Τ-easy+AOC和 PCAMBIA2300 p35S-gus-nos,回收 AOC 和 pCAMBIA2300 p35S-gus-nos 大片段，連接轉化， 挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。本實施例將青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因AOC可操作性地連接於表達調控序列，形成含AOC基因的植物表達載體，該表達載體可用於通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。實施例3根癌農桿菌介導AOC基因遺傳轉化青蒿獲得轉基因青蒿植株1.含AOC基因雙元植物表達載體根癌農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含AOC基因的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar 1)，並進行PCR驗證。結果表明，含AOC基因植物雙元表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中。2.根癌農桿菌介導AOC基因轉化青蒿2. 1.外植體的預培養青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20% NaCHO浸泡20min，無菌水衝洗3_4次， 用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於無激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養基中，25°C、16h/Sh (light/dark)光照培養，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右後，剪取無菌苗葉片外植體用於轉化。2. 2.農桿菌與外植體的共培養將所述的葉片外植體，轉到共培養培養基(1/2MS+AS 100ymol/L)中，滴加含活化好的所述含AOC基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。2. 3.抗性再生植株的篩選將所述的共培養3d的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基(MS+6-BA 0. 5mg/L+NAA 0. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上於25°C、16h/Sh光照培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代後即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基 (1/2MS+Cb 125mg/L)上培養至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。3.轉基因青蒿植株的PCR檢測根據目的基因所在表達盒p3k-A0C-nOS序列和AOC分別設計正向引物設計和反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出1193bp 的特異DNA片段。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化青蒿的含AOC基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR 檢測的轉基因青蒿植株。轉基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。實施例4利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量1. HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配製HPLC 採用water alliance 2695系統，色譜柱為C-18反相矽膠柱 (SymmetryShieldTM C18, 5 μ m, 250 X 4. 6m, Waters)，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫300C，流速1. OmL/min,進樣量10 μ L，靈敏度(AUFS = 1.0)，理論塔板數接青蒿素峰計算不低於2000。
ELSD 採用water alliance M20系統，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大係數(gain)為7，載氣壓力^ar ；精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存於_20°C備用。本發明中流動相為甲醇(methanol)水，比例為70% 30%時，青蒿素的保留時間為5. lmin，峰型良好。理論塔板數接青蒿素計算不低於2000。2.標準曲線的製作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 μ 1，4 μ 1，6 μ 1，8 μ 1，10 μ 1記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，μ g)進行回歸分析。通過研究，本發明中青蒿素在4-20 μ g範圍內呈現良好的log-log線性關係。青蒿素對照品的log-log 線性回歸方程為:Y = 1. 28e+000X+4. 71e+000, R = 0. 979546。3.樣品的製備和青蒿素含量的測定在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，於45°C烘箱中烘至恆重。然後從烘乾的稜條上敲下葉和花蕾，磨成粉末。稱取約0. Ig乾粉於2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心lOmin，取上清用0. 22 μ m濾膜過濾，即可用於HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。採用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 μ 1，根據峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉乾重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。在本發明中轉AOC基因顯著提高青蒿中青蒿素含量。在非轉化普通青蒿含量為 1. 53mg/g DW時，同時期轉AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高達到10. 17mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的6. 65倍本實施例採用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，採用轉化AOC基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供了一種理想方法。
權利要求
1.一種轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵在於，從青蒿中克隆丙二烯氧化環化酶AOC基因，構建含AOC基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將AOC基因導入青蒿並再生出植株；PCR檢測外源目的基因AOC的整合情況，HPLC-ELSD測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。
2.根據權利要求1所述的轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵是，包括如下步驟(1)採用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因AOC；(2)把AOC基因可操作性地連接於表達調控序列，形成含AOC基因的植物表達載體；(3)將含AOC基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用於轉化青蒿的含AOC基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青蒿植株；(5)對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素轉基因青蒿植株。
3.根據權利要求2所述的轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵是，所述的經PCR檢測的轉基因青蒿植株是指，分別設計合成AOC基因的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因青蒿植株。
4.根據權利要求2所述的轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵是，所述的HPLC-ELSD測定青蒿中青蒿素含量，其方法為色譜柱C-18反相矽膠柱，流動相為甲醇 水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫30°C，流速1. OmL/min，進樣量10 μ L，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大係數為7，載氣壓力^ar。
全文摘要
本發明是一種生物技術領域的轉AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明從青蒿中克隆丙二烯氧化環化酶AOC基因，構建含AOC基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將AOC基因轉入青蒿並再生出植株，PCR檢測外源目的基因AOC的整合情況，高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器測定轉基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發明獲得的轉基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，在非轉化普通青蒿含量為1.53mg/g DW時，同時期轉AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高達到10.17mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的6.65倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉基因青蒿大規模生產青蒿素打下了基礎。
文檔編號A01H5/00GK102242145SQ20111009941
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者吳韶龑, 唐克軒, 張凌, 張芳源, 江偉民, 沈乾, 王濤, 錢虹妹, 陸續, 陳韻斐 申請人:上海交通大學