使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖－3抗體的輔助療法的製作方法

2023-05-25 02:30:11 1

專利名稱：使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖－3抗體的輔助療法的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖在癌症治療之後的輔助療法。
背景技術：
據報告，磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在於細胞表面上的硫酸乙醯肝素蛋白多糖的新家族。迄今已報告有五種磷脂醯肌醇蛋白聚糖(磷脂醯肌醇蛋白聚糖1，磷脂醯肌醇蛋白聚糖2，磷脂醯肌醇蛋白聚糖3，磷脂醯肌醇蛋白聚糖4，和磷脂醯肌醇蛋白聚糖5)是磷脂醯肌醇蛋白聚糖家族的成員。該家族的成員有大小均一(約60kDa)的核心蛋白，共有特異、高度保守的半胱氨酸序列，並通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定結合到細胞膜上。
通過對中樞神經發育中細胞分裂形態異常的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)突變體進行基因篩選，識別出Dally(division abnormallydelayed，分裂異常延遲)基因。已經顯示出Dally的cDNA展示了開放閱讀框(ORF)，所述閱讀框所編碼的產物顯示出與脊椎動物膜整合蛋白聚糖(GRIPs)有序列同源性(24-26％同源)，所述GRIPs具有磷脂醯肌醇蛋白聚糖的全部特點。其後，這就提示了dally在調節dpp(decapentaplegia)受體的機制中發揮作用，由此，提示了哺乳動物的磷脂醯肌醇蛋白聚糖有可能調節TGF和BMP的信號轉導。即，這提示了磷脂醯肌醇蛋白聚糖可以作為一些肝素結合生長因子(如，EGF、PDGF、BMP2、FGFs等)的輔受體行使功能。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3作為發育調節轉錄產物從大鼠小腸中被分離(Filmus，J.，Church，J.G.，和Buick，R.N.(1988)Mol.Cell.Biol.8，4243-4249)，並在之後被識別為OCI-5，磷脂醯肌醇蛋白聚糖家族的GPI-結合型硫酸乙醯肝素蛋白多糖，具有分子量69kDa的核心蛋白(Filmus，J.，Shi，W.，Wong，Z.-M.，和Wong，M.J.(1995)Biochem.J.311，561-565)。在人類中，編碼磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的基因也從人胃癌細胞株中被分離，稱為MRX-7(Hermann Lage等，Gene 188(1997)151-156)。已經報告磷脂醯肌醇蛋白聚糖3與胰島素樣生長因子-2構成蛋白-蛋白複合體，並調節該生長因子的功能(Pilia，G.等，(1996)Nat.Genet.12，241-247)。該報告提示，磷脂醯肌醇蛋白聚糖3未必通過硫酸乙醯肝素鏈與生長因子相互作用。
利用磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為肝細胞癌標記物的可能性也已有報告(Hey-Chi Hsu等，Cancer Research 57，5179-5184(1997))，另外還有報告認為抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對肝癌細胞具有細胞毒性作用，作為抗癌劑是有用的(國際公開WO 03/00883)。
但是，對於應用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為肝癌治療後的輔助療法尚沒有報告。

發明內容
本發明人經反覆專心研究，結果發現抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對癌症治療之後的輔助療法有用，遂完成了本發明。另外，因為在癌症治療後觀察不到癌細胞的階段，給藥抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體能防止癌症復發，因此抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為預防癌症的藥物或作為預防癌症復發的藥物是有用的。


圖1是表示對肝內移植小鼠模型給藥本發明的抗癌劑後的效果圖。
圖2是表示早期對肝內移植小鼠模型給藥本發明的抗癌劑後的效果圖。
具體實施例方式
本發明提供了一種含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其特徵為在癌症治療後給藥。癌症治療後優選是指在肝癌治療後，其中肝癌的治療特別是指肝癌細胞切除術。本發明的抗癌劑優選應用於在切除的肝癌細胞表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的情況下。並且，抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體優選是單克隆抗體。
本發明的抗癌劑在輔助療法中尤為有用。即使在癌症治療、手術中認為癌細胞已被摘除或死亡的情況下，仍可能殘留觀察不到的癌細胞。當上述癌細胞仍殘留時，一定時間後，癌症就可能復發，因此癌症治療後必須進行繼續治療以預防癌症復發。該治療稱作輔助治法或術後輔助治法。
在本發明範圍內，癌症治療指以抑制癌細胞增殖或殺滅癌細胞或減少癌細胞為目的的任何一種治療，如癌切除術、用抗癌劑化療、放療、經皮乙醇注射療法、經皮射頻熱凝療法或經導管動脈栓塞療法。本發明中優選的癌症治療是癌切除術。「癌症治療後」是指在已經進行上述治療後。需要說明的是，「癌症治療後」在本發明中未必意味著癌症已經治癒。
本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可以在確認磷脂醯肌醇蛋白聚糖3是否表達後，給藥至癌症治療後的患者。可以用任何方法確認磷脂醯肌醇蛋白聚糖3是否表達，例如，可以用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體等確認磷脂醯肌醇蛋白聚糖3蛋白的表達，也可用PCR等方法確認磷脂醯肌醇蛋白聚糖3基因的表達。
癌症治療後可以在任何時間給藥抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，並且給藥可以在癌症治療後立即進行或間隔一些時間後進行。本發明中優選的給藥時間是從癌症治療後直至癌症復發的期間。在術後輔助療法中，通常在治療後12周內或6周內開始給藥。可以通過本領域技術人員已知的方法判斷癌症是否復發，例如，通過視覺所見或病理所見來確認腫瘤是否發生進行判斷。腫瘤可以通過本領域技術人員已知的方法確認，如成像法和以AFP等腫瘤標記物作為指標的方法。
使用本發明的抗癌劑可以治療癌症，可列舉如肝癌，肺癌，結腸癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，胰腺癌和膽管癌等，任何癌症都可以。本發明的抗癌劑特別適合用於治療的癌症是肝癌細胞。肝癌可以是原發或繼發性的，可舉例是肝細胞癌，肝內膽管癌，膽管囊腺癌，混合型肝癌，肝母細胞瘤，未分化癌，血管肉瘤，肝平滑肌肉瘤和未分化肉瘤。
應用本發明抗癌劑的輔助療法的實施方式特別優選是，在切除肝癌細胞後通過給藥抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，防止肝癌復發。
至於本發明所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的來源、類型(單克隆或多克隆)和形態，沒有要求。
本發明所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可以通過已知方法形成多克隆或單克隆抗體獲得。本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體特別優選源自哺乳動物的單克隆抗體。源自哺乳動物的單克隆抗體包括經雜交瘤細胞產生的抗體，和用含有抗體基因的表達載體經遺傳工程技術遺傳轉化後宿主所產生的抗體。
產生單克隆抗體的雜交瘤細胞使用已知技術，可以如下述進行製備。即，經如下步驟製備以磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為致敏抗原，將其依照通常的免疫方法進行免疫化，利用通常的細胞融合技術使形成的免疫細胞與公知的伴侶細胞融合，然後通過通常的篩選方法篩選出單克隆的抗體產生細胞。
具體而言，單克隆抗體如下述製備即可。首先，用作生產抗體致敏抗原的人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3，可以通過誘導由Lage H.等，Gene188(1997)，151-156公開的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因/胺基酸序列的表達獲得。磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的基因序列和胺基酸序列分別顯示於序列編號1和2。即，編碼磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入公知的表達載體系統，遺傳轉化適當的宿主細胞後，將來自宿主細胞或培養基上清液中的目標人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3蛋白通過公知方法進行純化。
接著，將該純化後的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3蛋白用作敏化抗原。或者，也可以用磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的肽片段作為敏化抗原。這時，所述肽片段可以由人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的胺基酸序列經化學合成而獲得。
抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體依靠細胞毒性如ADCC或CDC等體現抗癌活性，還在抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體與細胞毒性物質如放射性同位素、化療藥或菌源毒素等結合時體顯示抗癌活性。抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體識別的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上的表位不限於特定表位，只要抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可以識別的存在於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上的任何表位都可。因此，為了製備本發明抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原，任何存在於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上的含有表位的肽片段，都可以用作製備本發明抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原。
要用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有具體限制，並優選基於同在細胞融合中使用的伴侶細胞的兼容性的考慮來選擇。通常使用嚙齒類動物如小鼠、大鼠和倉鼠，或兔、猴等。
可根據已知技術用致敏抗原對動物進行免疫。例如，免疫可以通過一般方如向哺乳動物腹腔內或皮下注射致敏抗原。具體而言，將致敏抗原用適量的PBS(磷酸鹽緩衝液)、生理鹽水等稀釋或懸浮，根據需要向其中混合通常的佐劑如弗氏完全佐劑，乳化後，每4-21天多次對哺乳動物進行給藥。另外，以致敏抗原免疫期間，也能用適當的載體。
哺乳動物的骨髓瘤細胞用作與前述免疫細胞融合的伴侶細胞。各種已知的細胞株適合用作該骨髓瘤細胞，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)，P3x63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler，G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.等，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)，FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)，和R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)等。.
前述免疫細胞和骨髓瘤細胞之間的細胞融合基本上可根據已知的方法進行，例如，Kohler和Milstein等的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
更具體而言，所述細胞融合在例如細胞融合促進劑存在的條件下在通常的營養培養基中實施。例如，聚乙二醇(PEG)，仙臺病毒(HVJ)等可以用作細胞融合促進劑，根據需要，還可加入助劑如二甲基亞碸等，以便提高融合效率。
免疫細胞和骨髓瘤細胞使用比例可任意設定。舉例，優選免疫細胞的數量是雜交瘤細胞的1-10倍。用於上述細胞融合的培養基可以是，例如，特別適於上述雜交瘤細胞細胞株增殖的RPMI1640培養基或MEM培養基，或者其它用於培養該類型細胞的通常的培養基，此外，血清添加物如胎牛血清(FCS)等可以與之組合使用。
細胞融合通過在上述培養基中，充分混合規定量的上述免疫細胞和雜交瘤細胞，加入濃度通常為30-60％(w/v)、預加熱至大約37℃的PEG溶液(如，平均分子量約1000-約6000)，然後混合形成目標融合細胞(雜交瘤細胞)。接著通過反覆進行每次加入合適的培養基然後離心除去上清的程序，清除不利於雜交瘤細胞增殖的細胞融合劑等。
這樣得到的雜交瘤細胞，可以通過通常的選擇培養基如HAT培養基(含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養基)進行培養選擇。為使除了目標雜交瘤細胞以外的細胞(非融合細胞)死亡，就要使在所述HAT培養基上進行的培養持續足夠的時間(通常為數天至數周)。然後進行通常的限制稀釋法，之後篩選以及單克隆產生目標抗體的雜交瘤細胞。
除了通過用抗原免疫非人類動物得到上述雜交瘤細胞之外，也可以通過人淋巴細胞在體外對磷脂醯肌醇蛋白聚糖3敏化，並把敏化的淋巴細胞與具有永久分裂能力的人源骨髓瘤細胞融合獲得(見日本特公平1-59878號)所需的具有磷脂醯肌醇蛋白聚糖3結合活性的人類抗體。另外，將磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為抗原給藥具有完整的人抗體基因庫的轉基因動物後能得到產生抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞，也可以從將產生抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體細胞永生化的細胞中獲得(見國際專利申請公開編號WO 94/25585號公報，WO 93/12227號公報，WO92/03918號公報，和WO 94/02602號公報。
產生這樣製備得到的單克隆抗體的雜交瘤細胞能連續培養在通常的培養基上，或者可以長時間保存在液氮中。
為使單克隆抗體能從該雜交瘤細胞獲得，一般採用如下方法依照通常方法培養該雜交瘤細胞得到並在培養基上清液中回收單克隆抗體的方法，或者將雜交瘤細胞施用到與之相容的哺乳動物中並使之增殖，在腹水中得到單克隆抗體的方法等。前一個方法適於得到高純度抗體，而後一個方法適於抗體的大量產生。
本發明所用的單克隆抗體可以是重組的單克隆抗體，其製備是通過從雜交瘤細胞克隆抗體基因，將基因整合在適當的載體中，將其轉導到宿主中，並使宿主通過基因重組技術產生(例如，參見Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。
具體而言，編碼抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可變(V)區的mRNA，從生成抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的雜交瘤細胞中分離。所述mRNA可以通過已知的方法分離，例如，通過氨基甲脒超離心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等製備總RNA，之後用mRNA提純試劑盒(由Pharmacia製造)等製備目標mRNA。另外，mRNA也能用QuickPrep mRNA提純試劑盒(由Pharmacia製造)直接製備。
抗體V區的cDNA可以用逆轉錄酶由得到的mRNA合成。CDNA的合成可以用例如，AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(ReverseTranscriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(由生成化學工業公司製造)等。CDNA的合成和擴增還能用例如，5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(由Clontech製造)和使用了PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等。
將目標DNA片段從如此得到的PCR產物純化，然後連接到載體DNA上。另外，由此製備重組載體，然後將其導入大腸桿菌等，再選擇菌落製備所需的重組載體。接著目標DNA核苷酸序列用已知的方法證實，如雙脫氧核糖核酸鏈終止法。
得到編碼目標抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體V區的DNA後，該DNA被整合在含有編碼所期望的抗體恆定區(C區)的DNA的表達載體中。
為了製備用於本發明中的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，抗體基因整合在表達控制區例如，增強子和啟動子這樣的控制區，以表達的表達載體。接著用該表達載體遺傳轉化宿主細胞，並誘導抗體表達。
抗體基因表達可以通過編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達載體中，然後用這些載體同時轉化宿主細胞，或者也可以通過編碼H鏈和L鏈的DNA整合在單個表達載體中，用該載體轉化宿主細胞(參見WO 94/11523)。
不僅是以上列舉的宿主細胞，還有轉基因動物也能用於產生重組抗體。例如，融合基因的製備能通過將抗體基因插入在乳汁中產生的編碼蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中。然後將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段，注射到山羊胚胎中，該胚胎導入母山羊。所需的抗體可以從接受胚胎的山羊所生的轉基因山羊或其後代所產生的乳汁中得到。此外，可以給轉基因山羊施用適當的激素，以便增加轉基因山羊產生的含有所需抗體的乳汁量(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
除了上面列舉的抗體，本發明可以利用人工修飾的基因重組抗體，如嵌合抗體和人源化抗體，旨在降低對人類的異種抗原性。這些修飾的抗體可以通過已知的方法製備。
嵌合抗體的獲得是通過，編碼由上述方法得到的抗體V區的DNA與編碼人類抗體C區的DNA連接，將其整合在表達載體中，然後把載體導入宿主並誘導生產。對本發明有用的嵌合抗體能以該已知方法獲得。
人源化抗體，也稱為改型人類抗體，其是通過將非人類哺乳動物如小鼠抗體互補決定區(complementarity determining region，CDR)，移植到人類抗體的互補決定區，對此的常規基因重組技術也是已知的(見歐洲專利申請公開No.EP 125023號公報和WO 96/02576號公報)。
具體而言，以連接小鼠抗體CDR與人類抗體骨架區(FR)設計的DNA序列以PCR法合成，其是用與CDR和FR二者的末端區都具有重疊的區域而構建的數個寡核苷酸作為引物(參見WO 98/13388號公報中記載的方法)。
其中的互補決定區構成了良好的抗原結合部位的骨架區被選作跨CDR連接的人抗體骨架區。抗體可變區中骨架區的胺基酸必要時可被取代，以便改型的人類抗體的互補決定區能構成適當的抗原結合部位(Sato，K.等，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗體和人源化抗體的C區中可以使用人類抗體C區，例如，Cγ1，Cγ2，Cγ3和Cγ4可用作H鏈，Cκ和Cλ可用作L鏈。另外，可以修飾人類抗體C區以便改善抗體或其生成的穩定性。
嵌合抗體包含源自非人類哺乳動物的抗體可變區和源自人類的抗體恆定區。另一方面，人源化抗體包含源自非人類哺乳動物的抗體互補決定區和源自人類的抗體骨架區以及C區。由於人源化抗體在體內的抗原性降低，其可用作本發明的治療藥的有效成分。
本發明所用的抗體只要能與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3結合併且能抑制磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的活性，抗體片段或其修飾體即可，還可以含有二價抗體和單價抗體，並不限於整個抗體分子。抗體片段的實例如Fab、F(ab′)2、Fv、具有一個Fab和一個完整Fc的Fab/c，或H鏈或L鏈Fv由適當的接頭連接的單鏈Fv(scFv)。具體而言，抗體片段可以通過用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而產生，或者可以構建編碼所述抗體片段的基因，並將其導入表達載體，由適當的宿主細胞表達(參見，例如Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.，Plueckthun，A.Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，and Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
ScFv通過連接抗體的H鏈V區和L鏈V區得到。H鏈V區和L鏈V區通過接頭並優選肽接頭連接在scFv中(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。ScFv的H鏈V區和L鏈V區可以是源自本說明書所述的任何抗體。連接V區的肽接頭可使用例如，包含12-19個胺基酸殘基的任何單鏈肽。
編碼scFv的DNA可以按下述方法得到編碼上述抗體H鏈或H鏈V區的DNA，以及編碼L鏈或L鏈V區的DNA，以編碼前面所述序列的全部或所需的胺基酸序列的DNA部分作為模板，使用指定了末端的引物對經PCR進行擴增，接著重組指定的引物對，並進行擴增以使編碼肽接頭區的DNA和其兩端分別結合於H鏈和L鏈。
另外，一旦編碼scFv的DNA製備好，含有該DNA的表達載體和用該表達載體轉化的宿主可以依照常法獲得，並且通過應用所述宿主，依照常法可以得到scFv。
所述抗體片段可以通過和上述同樣方法，由宿主獲得和表達其基因並誘導生產。本發明的「抗體」也包括這些抗體的片段。
修飾抗體還可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種不同分子結合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖抗體。本發明的「抗體」也包括這些修飾抗體。所述修飾抗體可以通過實施化學修飾已得到的抗體而獲得。需要說明的是，修飾抗體的方法在本領域中已建立。
本發明所用的抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可以是具有識別磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原結合位點的雙特異性抗體，或一個可識別磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的抗原結合位點和另一個可識別細胞毒性物質如化療藥或細胞產生的毒素等的抗原結合位點。這時，使得細胞毒性物質能直接作用在表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的細胞上，從而特異性破壞腫瘤細胞和抑制腫瘤細胞增殖。雙特異性抗體可以通過結合兩種類型的抗體的H-L對來製備，也可以通過融合能產生不同的單克隆抗體的雜交瘤細胞，製成產生雙特異性抗體的融合細胞來獲取。雙特異性抗體也可以通過基因工程技術製備。
按上述所構建的抗體基因可通過公知的方法表達和獲得。為哺乳動物細胞時，基因可以通過常用的有效啟動子、要表達的抗體基因和在其3′下遊側的poly A信號的功能性連接來表達。啟動子/增強子舉例說明是人巨細胞病毒的早期啟動子/增強子。
可以用來表達本發明所用的抗體的其它啟動子/增強子的實例包括，來自例如源自逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒或猴病毒40(SV40)的病毒啟動子/增強子，或人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳動物細胞的啟動子/增強子等。
應用SV40啟動子/增強子時，基因表達易於以Mulligan等方法進行(Nature(1979)277，108)，應用HEF1α啟動子/增強子時，基因表達易於以Mizushima等方法進行(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)。
在使用大腸桿菌時，基因表達可以通過常用的有效啟動子、抗體分泌的信號序列和要表達的抗體基因的功能性連接來實現。舉例說明啟動子可以是lacz啟動子、araB啟動子。用lacz啟動子時，表達可以通過Ward等方法實現(Nature(1098)i341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)，而用araB啟動子時，表達可通過Better等方法實現(Science(1988)240，1041-1043)。
至於抗體分泌的信號序列，當抗體在大腸桿菌的外周胞質中產生時，可以用pelB信號序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。當外周胞質中產生的抗體被分離後，抗體結構被適當再摺疊並使用。
作為複製起點適用的是，舉例，源自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳頭瘤病毒(BPV)的複製起點。此外，為了擴增宿主細胞系統中的基因拷貝數，表達載體可以含有例如氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、或二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。
任何表達系統，例如真核細胞系統或原核細胞系統，都可以用於製備本發明所用的抗體。真核細胞的實例包括例如已建立的哺乳動物細胞系統或昆蟲細胞系統，以及絲狀真菌細胞和酵母細胞等的動物細胞等。原核細胞的實例包括細菌細胞如大腸桿菌細胞。
本發明所用的抗體優選在哺乳動物細胞中表達，如在CHO，COS，骨髓瘤，BHK，Vero，或HeLa細胞中。
然後轉化的宿主細胞在體外或體內培養，以誘導產生目標抗體。宿主細胞可以根據已知方法培養。例如，可用DMEM，、MEM、RPMI1640或IMDM作為培養基，也可合用血清添加物如胎牛血清(FCS)等。
使用已知的方法可測定本發明所用抗體的抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)和其配體-受體結合抑制活性(Harada，A.等，International Immunology(1993)5，681-690)。
測定本發明所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原結合活性，可以用ELISA(酶聯免疫吸附分析)、EIA(酶免分析)、RIA(放免分析)或螢光抗體技術來測定。舉例，用酶免分析時，將含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體的樣本，如抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體生成細胞的培養上清液或純化的抗體，加至塗有磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的板上。加入以酶如鹼性磷酸酶標記的第二抗體，對板進行培養，清洗後加入酶底物如對硝基苯磷酸鹽，通過測定吸光度來評價抗原結合活性。本發明所用抗體的細胞毒性可以通過本領域技術人員公知的方法測定。
可以通過混合效應細胞、靶細胞和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體測定，檢查ADCC的程度來測定ADCC的活性。例如，小鼠脾細胞或者從骨髓或人外周血分離的單核細胞等可以用作效應細胞，可以用人類建立的細胞株如人肝細胞株HuH-7等作為靶細胞。預先用51Cr標記靶細胞，向該細胞中加入抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，之後培養，然後加入與靶細胞成適當比例的效應細胞，進行培養。ADCC活性可以用通過收集培養後的上清，計算上清中的放射活性進行測定。
CDC活性可以通過混合上述標記的靶細胞和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，然後加入補足物進行培養，在培養後計算上清中的放射活性來測定。
由於Fc區通常對於抗體發揮細胞毒性是必需的，在本發明的細胞生長抑制劑利用了抗體細胞毒活性的那些情況下，本發明所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體優選含有Fc區。
本發明的抗癌劑用於預防癌症或預防癌症治療後的癌症復發。本發明的抗癌劑特別優選用於預防肝癌細胞切除術後的肝癌復發。
有效劑量選自每次給藥0.001mg-1000mg/kg體重的範圍。或者，劑量可以選自每名患者0.01-100000mg/個體。但是，本發明的含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑不受所述劑量的限制。
本發明的抗癌劑通常以非口服途徑給藥，例如，注射(如皮下，靜脈內，肌內，腹膜內)或經皮、經黏膜、經鼻或經肺等途徑，但是，口服給藥也是可能的。
至於本發明的抗癌劑的給藥時間，可以在疾病臨床症狀出現之前或之後給藥。根據特別優選的本發明的實施方案，本發明的抗癌劑可以在肝癌細胞切除術後作為輔助治療給藥。
含有本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的治療藥可以依照常法配製(Remington′s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A.)並且還可以同時含有藥用載體和添加劑。
所述載體和藥用添加劑的實例是，水、藥用有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性右旋糖苷、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙烯醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和適合作為藥物添加劑的表面活性劑。
根據本發明的治療藥劑型，實際的添加劑可以是上述中的一種或多種進行適當組合，當然也不受其限制。例如，可注射製劑的製備如下在溶劑如生理鹽水、緩衝液或葡萄糖溶液中溶解純化的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，然後在溶液中加入防吸附劑如Tween 80、Tween20、明膠、或人血清白蛋白。或者，在使用前通過溶解重構的劑型，可以是凍幹製劑，用於凍幹的賦形劑可以用如甘露醇和葡萄糖等的糖醇或糖類。
本說明書特意引用的所有專利和參考文獻的內容，整體合併作為本說明書的一部分。此外，日本專利申請2004-244273和2005-90945的說明書和附圖的內容，是構成本發明持有的優先權基礎的申請，整體合併作為本說明書的一部分。
實施例本發明通過下面提供的實施例更具體地描述，但這些實施例不限制本發明的範圍。
實施例1小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內移植的小鼠模型中的藥效試驗(1)甲胎蛋白(AFP)的測定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司製造)，測定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標記物。ELISA的檢測限約1ng/mL，低於檢測限的樣本作為1ng/mL。為了獲取血清，在Separapit S(由セキスイ化學製造)中通過眼窩採血收集血液，室溫下靜置15分鐘後，以1200×g離心分離20分鐘。
(2)製備肝內移植小鼠模型肝內移植小鼠模型的製備如下HepG2細胞(ATCC)用Hanks培養基(由Sigma製造)配製到1×108個/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50μL的HepG2細胞懸液(5×106個/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內。移植後第21天測定血清中AFP濃度，在10-100ng/mL範圍內的個體被分成兩組(n＝4)。在該時間點，肝癌細胞(瘤塊)還沒有視覺可見，將其用作肝臟切除術後微肝內移植存活模型。
(3)抗體給藥給藥當天通過用生理鹽水(由大製薬製造)配製小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33(參考下面的參考例)達0.5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植後的第21天和28天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。
(4)抗腫瘤作用的評價抗腫瘤作用根據腫瘤移植後第35天的AFP濃度評價。其結果顯示在圖1中，GC33給藥組與媒介給藥組相比，腫瘤移植後第35天的AFP濃度較低，從而證實了本發明抗體的抗腫瘤作用。
如前所顯示，GC33在肝內移植模型中表現出具有抗腫瘤的作用，可見本發明抗體能用在輔助治療中。
實施例2小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內移植的小鼠模型中的早期給藥試驗(1)甲胎蛋白(AFP)的測定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司製造)，測定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標記物。ELISA的檢測限約1ng/mL，低於檢測限的樣本作為1ng/mL。為了獲取血清，在Separapit S(由セキスイ化學製造)中通過眼窩採血收集血液，室溫下靜置15分鐘後，以1200×g離心分離20分鐘。
(2)製備肝內移植小鼠模型肝內移植小鼠模型的製備如下HepG2細胞(ATCC)用Hanks培養基(由Sigma製造)配製到1×108個/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50μL的HepG2細胞懸液(5×106個/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內。移植後的第2天，隨機分成兩組(n＝10)。雖然HepG2在移植後的第二天的時間點就存在於小鼠肝內，但此時小鼠血清中測不到人AFP，這可用作在臨床上更接近於肝臟切除術後殘餘的微肝內移植的模型。
(3)抗體給藥給藥當天通過用生理鹽水(由大製薬製造)配製小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33(參考下面的參考例)達0.5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植後的第2天和第7天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。
(4)抗腫瘤作用的評價抗腫瘤作用根據腫瘤移植後第15天和第40天的AFP濃度評價。其結果顯示在圖2中，媒介組中觀察到AFP濃度升高，而GC33給藥組兩個測定時間都沒有看到AFP濃度升高。
如前所顯示，在肝癌細胞肝內移植的模型中，通過在AFP尚檢測不到的早期給與小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33，可以抑制腫瘤增殖，從而提示本發明抗體能用在輔助治療中。
參考實施例製備小鼠抗人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體GC33用來自GST和來自磷脂醯肌醇蛋白聚糖3中524位丙氨酸至563位賴氨酸的肽形成的融合蛋白作為免疫原，免疫三隻Balb/c小鼠(購自Charles River Japan)和三隻MRL/lpr小鼠。在初次免疫中，皮下給與乳劑，所述乳劑用FCA製備並調節使之能提供每隻(per head)100μgGC-3。兩周後，皮下給藥乳劑，所述乳劑用FIA製備並調節使之能提供每隻50μg。第五次免疫後，每隻最後免疫(50μg)在所有小鼠的尾靜脈中進行，並進行細胞融合。用固定有已去除C端側的疏水區(564至580的胺基酸)的可溶性GPC3核心蛋白的免疫板，通過ELISA進行篩選。對於陰性對照，用限制性稀釋法進行單克隆化。結果是獲得了具有對GPC3的較強結合活性的GC33抗體。GC33H鏈可變區的胺基酸序列顯示在序列編號3中，而L鏈可變區的胺基酸序列顯示在序列編號4中。
工業實用性本發明的抗癌劑適用於預防癌症和預防癌症復發。
序列表110中外製藥株式會社(Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha)120使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3抗體的輔助療法(Adjuvant Therapy using Anti-Glypican 3 Antibodies)130SCT070625-47150JP2005-909451512005-03-28150JP2004-2442731512004-08-241604170PatentIn version 3.121012111743212DNA213homo sapiens4001atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc120ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca180gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa240taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc300aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc360catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa420gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac480atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc540cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga600gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc660aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc720aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg780tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg840gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt900ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg960cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag1020ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct1080tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat1140gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc1200ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc1260ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga1320atgaaaaacc agttcaatct ccatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt1380caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa1440ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat1500gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc1560cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag1620caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc1680ccgctgaagc ttctcaccag catggccatc tcggtggtgt gcttcttctt cctggtgcac1740tga 17432102211580212PRT
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權利要求
1.一種含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其中所述抗癌劑在癌症治療後給藥。
2.根據權利要求1所述的抗癌劑，其中癌症治療後是肝癌治療後。
3.根據權利要求2所述的抗癌劑，其中肝癌治療是肝癌細胞切除術。
4.根據權利要求2或3所述的抗癌劑，其中所述抗癌劑在切除的肝癌細胞中表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3時使用。
5.根據權利要求1至4任一項所述的抗癌劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.一種預防癌症復發的方法，所述方法是在癌症治療後對患者給藥含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑。
7.根據權利要求6所述的方法，其中癌症治療後是肝癌治療後。
8.根據權利要求7所述的方法，其中肝癌治療是肝癌細胞切除術。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在切除的肝細胞中表達。
10.根據權利要求6-9任一項所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其中所述抗癌劑在癌症治療後給藥。癌症治療後優選是指在肝癌治療後，其中肝癌的治療特別是指肝癌細胞切除術。本發明的抗癌劑優選在切除的肝癌細胞中表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3時使用。抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體優選是單克隆抗體。本發明的抗癌劑適用於預防癌症或預防癌症復發。
文檔編號A61P35/00GK101014367SQ200580028610
公開日2007年8月8日 申請日期2005年8月23日 優先權日2004年8月24日
發明者木下恭子, 杉本正道, 岡部尚文 申請人:中外製藥株式會社