唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用的製作方法

2023-05-25 09:45:01 2

專利名稱：：唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程領域，具體地說涉及唐魚生長激素基因、含有該基因的重組表達載體、用該載體轉化的唐魚以及對該轉基因唐魚的外源基因檢測。
背景技術：
：轉基因魚是目前國內外獲得最成功的轉基因動物之一。轉基因魚的構建主要包括以下幾個方面l.目的基因的獲得；2.基因克隆與表達載體的構建；3.受體魚(受精卵)的獲得；4.注射基因。轉基因魚的應用潛力l.快速育種。傳統的品種選育需經過多代反覆選種交配才能育成優良品種。轉基因技術有可能在很短時間內超越自然界億萬年生物進化歷程，創造自然界原來沒有的品種或品系，這是常規育種難以辦到的，故此引誘力極強。2.改良養殖性能，如加快受體魚的生長、提高餌料利用率及抗逆性等。不少實驗表明，轉基因魚生長速度可提高11%-30%，即所謂"超級魚"。但這些結果多為實驗室環境所得，尚待養殖生產環境的檢驗。有的轉基因魚可提高餌料利用率，有的則表現出耐寒或耐熱、耐低鹽度或高鹽度、耐高濃度重金屬、耐汙染物以及乃缺氧等，產生抗逆性較強的魚。3.生產醫藥生物製品。通過轉基因魚生產生物活性物質以滿足醫藥需要，生產對外來物質成陽性的反應器的魚以滿足醫療的需要，研製攜帶人類胰島素的轉基因魚以提供胰島素的研究也開始引起了人們的重視。唐魚(ram'c/^/^a仿om/^s)屬鯉形目、鯉科、唐魚屬。它體形細小，長而側扁。體高約等於頭長，腹部圓、吻鈍而短，口上位.口裂向下傾斜，幾乎與體鈾垂直。上頜長於下頜，前端無突起。口無須，眼大，側上位。背鰭短，起點顯著在腹鰭起點之後，胸縮短，末端不達腹部起點，腹縮末端可達肛門，肛門緊靠臀鰭起點。臀鰭較長，約與背鰭相對。尾鰭叉形，末端尖，上下葉約等長。體被中等大小圓鱗，體側鱗片上無側線。體側顏色鮮豔，體側從鰓孔上角至尾柄基部有一條金黃色的條紋.條紋上下各有幾條黑色線條。尾柄基部有一紅色大圓斑，背鰭和尾鰭基部有許多紅色小斑點。背鰭和臀鰭呈黃綠色，邊緣透明。唐魚分布在廣東省廣州附近的小山溪中，具有很高的觀賞價值。唐魚現已列為國家二級保護動物。唐魚是對生存環境要求極高的魚種，可成為測定環境品質的"指標魚"，是用生物方法監測環境水質汙染的一個極好的魚類生物標記物，所以對它的生長發育進行轉基因研究，對環境資源和生物資源的保護，具有極大的科學意義。轉基因魚具有表達量高、世代周期短、成本低、不帶哺乳類病毒等優點，且作為生物反應器更易被接受，因此通過轉基因獲得較大體型、生長快的轉基因唐魚，及該轉基因體系方法的建立對後續的研究(如培育可生產重要的蛋白的轉基因魚等)具有重要的意義。
發明內容本發明的目的在於提供一種唐魚生長激素基因。本發明的另一目的在於提供包含上述唐魚生長激素基因的重組表達載體。本發明的另一目的在於提供包含上述唐魚生長激素基因的基因工程菌。本發明的進一歩目的在於提供上述唐魚生長激素基因在促進魚類生長中的應用。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案本發明根據GENBANK上已登陸的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區內設計了一對引物(pl和p2)，然後提取唐魚總RNA，以總RNA為模板，Pl和P2為引物，RT-PCR得到唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)，再根據該ORF設計引物，以唐魚總RNA為模板，分別進行5'RACE和3'RACE，擴增得到5'末端序列和3'末端序列，然後將5'和3'端序列及核心序列ORF用Vector軟體拼接獲得了唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp。本發明根據唐魚生長激素基因ORF設計一對引物P6和P7，再以唐魚生長激素基因ORF為模板，用引物P6和P7進行PCR改造，然後將PCR產物雙酶切純化；同時雙酶切轉基因表達載體pTLA-DsRed，並回收含有啟動子的載體；T4連接酶按照摩爾數比1:3，連接酶切純化後的唐魚生長激素基因ORF和含有啟動子的載體。本發明將上述T4連接酶得到的連接產物轉化大腸桿菌後通過菌落PCR，並提取質粒進行雙酶切初步篩選重組質粒，該重組質粒測序列證實，重組轉基因表達載體構建正確，命名為pTLA-GH。本發明將轉基因表達載體pTLA-GH酶切使其線性化，純化後測定OD值，調整濃度，將pTLA-GH顯微注射到唐魚受精卵中。本發明根據轉基因表達載體pTLA-GH設計一對引物PP-SF和GP-SR;將實驗魚與對照魚培育至0.4g左右後，剪取鰭條提取基因組DNA，用引物PP-SF和GP-SR進行PCR擴增檢測轉植基因，結果在兩尾個體最大的轉基因魚(1#和2#魚)中檢測到轉植基因pTLA-GH;以Southernblot方法檢測轉植基因pTLA-GH己整合到唐魚基因組上；以RT-PCR和Westernblotting方法檢測到轉植基因pTLA-GH在唐魚組織器官中的表達；同時觀察實驗組唐魚和對照組唐魚的表型變化，結果證實重組表達載體pTLA-GH已成功地轉化到唐魚體內，並且在唐魚體內發揮了生長激素的促生長生理功能。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1、本發明從唐魚總RNA中獲得了唐魚生長激素基因及編碼的胺基酸序列，這極大地擴充了轉基因魚類的基因庫；2、本發明將唐魚生長激素基因連接到轉基因表達載體pTLA-DsRed上，構建了新的重組表達載體pTLA-GH,並且成功在轉基因唐魚內穩定表達，該重組表達載體對改善其他魚類的生長發育性狀具有極大的生物學和生物工程學意義。3、本發明得到的轉基因唐魚，生長快、體型大，可以用於生物反應器等其他生物學領域。圖1為轉基因表達載體pTLA-GH的構建圖；圖2為轉基因唐魚PCR擴增初步篩選結果；其中，1為MarkerIII;2為空白(ddH20);3為用於注射的DNApTLA-GH;415為實驗唐魚，其中6是1#魚的鰭條，9和15是2#魚的肌肉和眼睛，其佘是其它實驗魚的鰭條；1618，分別為對照唐魚的鰭條、肌肉、眼睛。圖3為轉基因唐魚基因組DNApTLA-GH基因的Southernblot雜交；其中，1為陽性對照pTLA-GH;2為鰭條組織基因組DNA酶切產物。圖4為Westernblotting檢測生長激素的表達情況的結果；其中，l為陽性對照組(重組鯉魚GH);2為野生型唐魚；3為試驗唐魚。具體實施方式實施例1唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)的克隆1.引物設計參照GenBank中已登錄的鯉(Cyprz'ra'iwc^77k)、青魚woWfo)、團頭魴(A/eg(3/oZ7ramaa附6fy，/ia/a)、泥鰍(Af/紹wrn^a/zgw/〃z'cat^/ato)等生長激素基因cDNA序列在同源保守區內設計一對引物(pl和p2)擴增該基因的開放閱讀框(ORF)序列。Pl:5'-ATGGCTAGAGCATTRGTGC-3';P2:5'-CTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2.反轉錄反應取出膜後5d幼體唐魚20尾，提取唐魚全魚的總RNA，具體步驟嚴格參照試劑盒SVTotalRNAIsolationSystem。提取的RNA用0.8%瓊脂糖電泳檢測，--20。C保存備用。反轉錄參照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒的方法，以唐魚全魚總RNA為模板進行第一鏈合成。反應體系如表1所示表1.反轉錄反應體系唐魚全魚總RNA1MgCl22jxLOligodT-AdaptorPrimer0，10XRTBuffer1&dNTPMixture1RNaseInhibitorAMVReverseTranscriptase0.5^RNaseFreedH203.754Total10反轉錄反應條件為48°C30min;95°C5min;5°C5min。3.PCR擴增以上述反轉錄產物為模板，用pl、P2擴增唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)。PCR反應體系如表2:表2.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage7PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94卩變性30s，54'C復性30s，72'C延伸lmin，共30個循環。最後一次循環結束時72"C延伸7min。反應結束後取5pLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。4.PCR產物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產物，其TaqDNAPolymerase擴增的PCR產物DNA雙鏈前後末端都有一個游離的A鹼基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T鹼基互補形成環狀重組T質粒。按T載體說明書進行膠回收產物與pMD18-Tvector連接，體系如表3:表3.連接體系tableseeoriginaldocumentpage7反應產物混勻後於16'C下連接2小時。5.重組菌的菌液PCR檢測將PCR產物與pMD18-TVector的連接產物轉化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養過夜。菌液PCR篩選轉化子用牙籤挑取菌落放入加有3mlLB液體培養基(含Amp)的離心管中，37'C培養10小時後進行菌液PCR來挑選重組轉化子。PCR反應體系如下表4:表4.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage8PCR擴增反應條件反應前先94。C變性3min,每個循環包括9fC變性30s，57'C復性30s，72t:延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束時72'C延伸7min。反應結束後取5PCR產物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。瓊脂糖凝膠電泳結果，12個重組菌落中有11個可以擴增出633bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。6.酶切鑑定從菌液PCR結果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質粒。用￡coRI和A7n^HI進行雙酶切質粒DNA鑑定，酶切結果有預期兩條帶(2630bp和700bp)，確認該重組質粒插入了目的片段。將該重組質粒的菌株送上海英駿生物技術有限公司進行測序，作進一步的鑑定，防止插入片段發生變異或移碼現象。實施例2唐魚生長激素全長cDNA的克隆l.引物設計根據上述生長激素基因ORF序列設計了一對下遊引物(p3和p4)，上遊引物使用SMARTRACEcDNAAmplificationkit的通用引物UPM和NUP。在已測得的生長激素基因ORF序列上設計了一條上遊引物(p5)，下遊引物為TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0的通用引物Ml3PrimerM4。p3:5'-CAATGAGGCGGAAAGAGATG-3';p4:5'-GGTTGTCCTCAAAGTCGTTAATC-3'。p5:5'-GTCAACCAAACATGGACGACAATGAC-3';M13PrimerM4:5'-GTnTCCCAGTCACGAC-3';UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';NUP:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。2.5、-RACE用p3和UPM進行5'RACE擴增，經電泳檢測有預期帶出現，再以擴增的產物為模板，以p4和NUP做套式擴增後獲得單一的特異條帶，該片段回收測序，具體步驟如下採用BD公司的SMARTRACEcDNAAmplificationkit，按照試劑盒說明書進行唐魚生長激素基因cDNA5'RACE擴增，方法如下a)5'-RACE-ReadycDNA的製備(1)分別在0.5ml離心管中加入以下溶液，溶液具體見表5:表5.所加入溶液RNA樣品35'-CDSPrimerl[iLSMARTIIAoligoTotal5|iL(2)每管加滅菌水至終體積為5^L，用槍頭混合均勻，低速離心至管底；(3)7(TC溫浴2分鐘，置冰上冷卻2分鐘，輕微離心，收集溶液於管底，並加入組分，具體見表6:表6.所加組分5xFirst-strandBuffer2jxLDTT(20mM)l^LdNTPMix(10mM)lpLPowerscriptreversetranscriptase1jjL(4)用槍頭輕輕混勻，輕微離心，收集溶液於管底；(5)42。C溫浴1.5小時，力卩1OOpLTricine-EDTABuffer稀釋First-strand反應產物；(6)72r溫浴7分鐘，樣品保存於一2(TC冰箱備用。b)PCR擴增以5'-RACE-ReadycDNA為模板，p3和試劑盒中的UPM為引物，按以下反應體系進行PCR擴增，反應體系見表7:表7.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage10PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，54匸復性30s，72'C延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束時72'C延伸7min。反應結束後取5pLPCR產物，1免瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。然後以第一次PCR產物為模板，用引物p4和NUP進行套式PCR擴增，反應體系見表8:表8.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage10PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，54'C復性30s，72t:延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束時72'C延伸7min。反應結束後取5pLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。c)PCR產物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產物，其TaqDNAPolymerase擴增的PCR產物DNA雙鏈前後末端都有一個游離的A鹼基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T鹼基互補形成環狀重組T質粒。按T載體說明書進行膠回收產物與pMD18-Tvector連接，體系如表9:表9.連接體系LigationSolution2.5|iL線性化T載體膠回收產物2(jLTotal5(jL反應產物混勻後於16'C下連接2小時。d)重組菌的菌液PCR檢測將PCR產物與pMD18-TVector的連接產物轉化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養過夜。菌液PCR篩選轉化子用牙籤挑取菌落放入加有3mlLB液體培養基(含Amp)的離心管中，37。C培養10小時後進行菌液PCR來挑選重組轉化子。PCR反應體系如下表10:表10.PCR反應體系ddH2016.55(iL1OxPCRBuffer(plusMgCl2)2dNTPMixture0.4pL7h^0.15)jl,UPMO單P4O單_5^_0.1|xL_Total_20pLPCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，57°C復性30s，72°C延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束時72°C延伸7min。反應結束後取5PCR產物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。瓊脂糖凝膠電泳結果，12個重組菌落中有ll個可以擴增出64bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。e)酶切鑑定從菌液PCR結果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質粒。用￡coRI和H/m;ni進行雙酶切質粒DNA鑑定，酶切結果有預期兩條帶(2630bp和126bp),確認該重組質粒插入了目的片段。將該重組質粒的菌株送上海英駿生物技術有限公司進行測序，作進一步的鑑定，防止插入片段發生變異或移碼現象。3.3、-RACEa)唐魚全魚總RNA經上述相同反轉錄後，以p5和M13PrimerM4為引物進行擴增唐魚生長激素基因cDNA的3'端。PCR反應體系如表11:表1L3、-RACE反應體系tableseeoriginaldocumentpage1250PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94"變性30s，54'C復性30s，72t:延伸lmin，共30個循環。最後一次循環結束時72'C延伸7min。反應結束後取5pLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。b)PCR產物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產物，其TaqDNAPolymerase擴增的PCR產物DNA雙鏈前後末端都有一個游離的A鹼基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T鹼基互補形成環狀重組T質粒。按T載體說明書進行膠回收產物與pMD18-Tvector連接，連接體系如表12:表12.連接體系tableseeoriginaldocumentpage12反應產物混勻後於16。C連接2小時。c)重組菌的菌液PCR檢測將PCR產物與pMD18-TVector的連接產物轉化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養過夜。菌液PCR篩選轉化子用牙籤挑取菌落放入加有3mlLB液體培養基(含Amp)的離心管中，37r培養10小時後進行菌液PCR來挑選重組轉化子。PCR反應體系如表13:表13.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage13PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，57t:復性30s，72r延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束時72r延伸7min。反應結束後取5pLPCR產物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。瓊脂糖凝膠電泳結果，12個重組菌落中有ll個可以擴增出448bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。d)酶切鑑定從菌液PCR結果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質粒。用￡coRI和H/m/III進行雙酶切質粒DNA鑑定，酶切結果有預期兩條帶(2630bp和510bp)，確認該重組質粒插入了目的片段。將該重組質粒的菌株送上海英駿生物技術有限公司進行測序，作進一步的鑑定，防止插入片段發生變異或移碼現象。4.唐魚生長激素基因cDNA全序列的獲得將5'和3'端序列及核心序列用Vector軟體拼接得到唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp，序列見SEQIDN0:1。經ExPASy軟體在線分析，該基因的5'非編碼區為64bp，開放閱讀框(ORF)長633bp，3'非編碼區為448bp，共編碼210個胺基酸，序列見SEQIDN0:2，其中包括22個胺基酸的信號肽和188個胺基酸的成熟肽。所編碼的胺基酸與近緣魚種(草魚、青魚、鱅魚、鯉魚、金魚、斑馬魚、團頭魴、泥鰍)生長激素胺基酸有很高的同源性，其中與草魚和鱅魚的同源性高達97.6%。實施例3轉基因表達載體的構建1、弓1物設計:根據上述唐魚生長激素基因ORF序列，設計一對引物p6和p7。P6:5'-ATGGATCCACCGGTCGCCACCATGGCTAGAGCATTGG-3';P7:5'-ATGCGGCCGCCTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2、PCR基因改造將PCR產物，PCR反應體系如表14:表14.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage14PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，54'C復性30s，72匸延伸50s，共30個循環。最後一次循環結束時72'C延伸7min。反應結束後取5nLPCR產物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。用膠回收試劑盒回收PCR產物，用限制性內切酶fiamHI和I將其酶切純化。3、用5amHI和WWI酶切轉基因表達載體pTLA-DsRed，並回收含有啟動子的載體。用T4連接酶將酶切純化後的唐魚唐魚生長激素基因ORF和含有啟動子的載體進行連接。按載體和目的片斷的DNA摩爾數比為l:3進行連接，其餘條件參照T4連接酶說明書。轉基因表達載體的詳細構建過程見圖1。實施例4轉基因唐魚的外源基因檢測將上述構建的重組表達載體轉入魚受精卵，孵化培育90d，以PCR方法和Southernblot檢測轉植基因的整合情況，以KT-PCR和Westernblotting檢測轉植基因pTLA-GH在唐魚組織器官中的表達。同時觀察實驗組唐魚和對照組唐魚的表型變化，結果證實重組表達載體pTLA-GH已成功地轉化到唐魚體內，並且在唐魚體內發揮了生長激素的促生長生理功能。具體步驟如下1、重組表達載體pTLA-GH的轉入用I酶切重組質粒pTLA-GH，使其線性化。酶切產物經純化後測其OD值，調整濃度至30ng4iL，然後將線性化後的重組表達載體顯微注射到受精卵'l'。試驗共注射了204顆卵，受精卵於25'C孵化培育。72h後孵化出膜，有85顆卵出膜，成活的有37尾。2、PCR方法檢測根據重組表達載體pTLA-GH的序列，設計一對上下遊引物PP-SF禾卩GP-SR。PP-SF:5'-CGGTAGAATGCAGCACGAAAC-3';GP-SR:5'-CGGCCAGCTTCTCAGTGATC-3';提取11尾轉植基因唐魚的基因組DNA，分別進行PCR擴增，PCR反應體系如下表15:表15.PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage15PCR擴增反應條件反應前先94'C變性3min，每個循環包括94'C變性30s，54'C復性30s，72"延伸30s，共30個循環。最後一次循環結束吋72"C延仲7min。反應結束後取5^LPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。PCR擴增產物回收後測序，結果證實所擴增的片段為轉植基因pTLA-GH，且兩尾個體最大的實驗魚(1#和2#魚)都檢測到轉植基因pTLA-GH(圖2)。3、SouthernBlot檢測轉植基因pTLA-GH的整合情況回收上一歩驟PCR擴增產物，用分光光度計測定其OD值，並對此片段進行地高辛標記，Dig探針標記和檢測試劑盒DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit購自RocheAppliedScience(Germany)公司。方法如下a)探針標記l)取3~10嗎探針DNA，加入雙蒸水至總體積為16^L;2)沸水浴10min，徹底使DNA變性；3)迅速置於冰上冷卻，加入4pLVia11(試劑盒所帶)，短暫離心；4)37。C放置溫育20h;5)加入2pL0.2mol/LEDTA，65。C預熱10min，終止反應。b)標記後探針靈敏度檢測標記後的探針按1:1、1:10、1:50、1:100、1:500稀釋，點膜檢測效率，步驟如下1)取各稀釋液lpL分別點於已做好記號帶正電的尼龍膜上；2)254nm紫外交聯3min將探針固定在膜上；3)用一個培養皿裝入20mLMaleicacidbuffer,然後將交聯後的膜轉入馬來酸中，於1525'C孵育2min;4)將膜轉入lOmLBlockingsolution中孵育30min;5)將膜轉入10邁LAntibobysolution中孵育30min;6)將膜轉入10mLWashingbuffer中孵育15min;7)重複上一步操作；8)將膜於10mLDetectionbuffer,平衡2-5min;9)在膜滴力卩2mL新配colorsubstratesolution,避光顯色2~16h;10)當顯色的點密度達到要求後，用無菌雙蒸水或TEbuffer洗脫5min，終止顯色反應。c)轉基因唐魚基因組DNA的SouthernBlot檢測取3月齡轉pTLA-GH基因唐魚，提取鰭條組織基因組DNA，經￡c0RI酶切，反應體系如下表16:表16.酶切體系tableseeoriginaldocumentpage16酶切產物經純化(V-geneCleanUpKit)後，同時以質粒pTLA-GH作為陽性對照。不加EB的瓊脂糖凝膠於10V電泳24h後，採用半乾轉移法進行DNA轉膜，後用標記探針進行Southernblot雜交，具體操作方法如下1)瓊脂糖凝膠電泳將酶切產物經普通瓊脂糖凝膠電泳(不加EB)後，經含EB的TBE緩衝液染色5min，照相，在UV下切下含目的條帶的膠條並將膠的一角切下作為標記，將凝膠浸泡在0.5XTBEbuffer中待用(15min);2)膜準備剪下大小合適的尼龍膜並在膜的適當位置做好正面標記(與膠相對應)，將膜以及2張ExtraThickBlotPaper(加厚濾紙)，4張3M濾紙在0.5xTBEbuffer中浸泡15min;3)電轉化按照從正極到負極的順序將ExtraThickBlotPaper、2張3M濾紙、膜、膠、2張3M濾紙、ExtraThickBlotPaper依次在相應位置疊好，並保證每層樣品間無氣泡。疊好後從頂部添加適量的0.5xTBEbuffer,用紙巾吸走殘留在正極板上多餘的buffer;4)插好電源，保證正負極方向正確。電轉電流不超過3.55niA/cm2，電壓設為10V，30minlh，可通過EB染色後在UV下觀察凝膠來檢測轉膜情況；5)電轉完畢後，取出樣品，關閉電源，將尼龍膜在0.4NNaOH中浸泡5min後，2xSSC洗膜〈5min;6)紫外交聯將膜在乾淨的3M濾紙上放平進行UV-crossing，254nm，3min，2次；7)預雜交將交聯後的膜放入大小合適的三面封口的袋中，加入4mL(10ml7100cm2)的DIGEasyHyb，保證其間無氣泡，然後將另一邊用封口機封上；8)在5(TC進行預雜交，30min;9)在雜交的同時，取2pLDNAprobe(25ng/mL)煮沸5min，使探針變性，並立即在冰上冷卻5min;10)雜交取出預雜交好的膜放入一個新的封口袋中，加入2邁LDIGEasyHyb+2pLDenatureDNAprobe，混和均勻，保證袋中無氣泡並封口；11)將雜交袋放入雜交瓶中，於雜交爐中雜交過夜(12~18h)。12)洗膜雜交完成後，取出膜用2xSSC，0.1%SDS溶液漂洗，室溫2X5min(15-25°C);13)用預熱到68。C的0.5xSSC，0.1%SDS溶液漂洗膜，68°C，2x15min;14)適量Washingbuffer室溫清洗5min;15)適量Blockingsolution(vial6，1:10inMaleicacidbuffer)封閉30min~lh;16)適量Antibobysolution(vial4，1:5000inBlockingsolution)溫育30min;17)適量Washingbuffer,室溫清洗2x15min;18)適量Detectionbuffer,平衡2~5min;19)顯色將膜放在乾淨的3M濾紙上稍經空氣乾燥後，放入乾淨的培養皿中，力卩入4mL新配的colorsubstratesolution(vial5，1:50inDetectionbuffer)，避光顯色。(顯色反應立即開始到16h後基本結束)顯色過程中勿動，但可打開蓋子觀察顯色情況；20)顯色結束後，用50mL的滅菌dH20洗脫5min，終止顯色反應。Southern雜交的結果，如圖3所示孔道1為陽性對照(pTLA-GH質粒:)；孔道2為實驗魚基因組DNA經酶切、電泳轉膜後，與探針結合呈陽性條帶；陰性孔道則沒有條帶(圖中未顯示)。實驗結果說明轉植的GH基因已整合到唐魚基因組上。4、RT-PCR方法檢測pTLA-GH在轉基因唐魚組織器官中的表達a)總RNA的提取分別提取轉基因唐魚和野生型的肌肉和內臟組織的總RNA，提取方法如下1)將組織加入到預冷的研缽中迅速敲打數次並加入Trizol(Invitroen)溶液，勻漿後轉入1.5mLEP管中；2)15'C-25'C放置5min，使細胞充分裂解；3)加入20(^iLCH4C13，用手劇烈振蕩15s，使溶液呈淡粉白色，室溫放置2~3min使其分層；4)4。C12000rpm離心15min;5)取上清小心轉入到無菌1.5mLRNase-FreeEP管中，加入150|iL無水乙醇混勻；6)將混合液全部轉移到UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000rpm離心lmin;7)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450pLRPESolution,lOOOOrpm離心30s;8)重複第7步；9)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中10000rpm離心15s;10)小心取出柱子，放入新的無菌L5mLRNase-FreeEP管中，在膜中央小心加入50nLDEPC—H20，55。080。C放置2min。10000rpm離心lmin。一70°C保存備用。b)RNA的反轉錄取少於lpg的轉基因唐魚和野生型唐魚樣品總RNA進行反轉錄，根據ReverTraAce-a-TM(TOYOBO，Japan)所提供的方法進行反轉錄，反應體系如表17:表17.RT反應體系成分體積RNase-FrecddH2011-取5xRTbufferdNTPMixtureRNaseInhibitorl^LOligo(dT)20l|iLRNAXpiL(海g)RevcrTraAcsl^L總體積20|aL反應條件42°C30min，99°C5min，4°C5min;反應完成後，冰浴5min後瞬時離心，一20'C保存備用。c)PCR擴增①pTLA-GH片段的擴增以轉基因唐魚和尾野生型唐魚的組織器官的RT產物為模板，以pi和p2為引物進行PCR擴增，PCR體系見表18:表18.PCR反應體系成分體積ddH2016.25|iL10xPCRBuffer2萃TaqPIP2反轉錄液總體積25(iL反應條件如下表PCR擴增反應條件94"預變性3min;然後進行30個循環，循環條件為94。C變性30s，54。C退火30s，72。C延伸30s;循環結束後72°C再延伸7min。取5pLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。②P-actin基因片段的擴增以RT產物為模板，以p-acitnF(5'-GTGCCCATCTACGAGGGTTACGC-3')和P-acitoR(5'-TGGTCTCGTGGATACCGCAAG-3')為引物進行PCR擴增，反應體系如表19:表19.PCR反應體系成分體積ddH2016.25jiL醇PCRBuffer2.5pLTaq0.25jiLbeta-acitoFbeta-acitnR反轉錄液總體積25PCR擴增反應條件94t:預變性3min;然後進行30個循環反應，94°。變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min;循環結束後72。C再延伸7min。取5pLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明轉基因唐魚和野生型唐魚的肌和內臟均能擴增出預期大小的特異帶，轉基因唐魚的肌肉和內臟組織的mRNA分別比野生型唐魚的高34.3%和40.7%。實驗結果說明轉植的GH基因在唐魚體內獲得表達，且轉基因唐魚的GHmRNA高於野生唐魚。5、Westernblotting檢測生長激素的表達情況a)唐魚肌肉蛋白的提取①分別取轉基因唐魚(PCR、Southern雜交和KT-PCR結果為陽性)和野生型唐魚lOOmg肌肉，加入lmlRlPA和10ulPMSF(不能預先加入到RIPA中，否則PMSF會失去效能)，在冰裡用勻漿器將組織勻漿；②將樣品轉移到1.5ml離心管，4。C20000g離心30min;③將上清小心轉移到乾淨無菌離心管中，一20。C保存。b)WesternblottingWesternblotting使用的溶液，見表2025:tableseeoriginaldocumentpage21註上述成分預溶於600mLddH20，用鹽酸調pH至7.4後，再用ddH20定容至1L。tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22注轉移緩衝液預冷至4'C。表24.封閉液tableseeoriginaldocumentpage22注1)10ml底物溶液加入10nl30免的H202，混勻後立即使用；2)或直接使用武漢博士德生物工程公司的DAB顯色試劑盒顯色。Westernblotting操作1)SDS-PAGE①聚丙烯醯胺凝膠的製備電泳前，將電泳槽等用具擦洗乾淨，晾乾，按要求裝配電泳槽；配製12%的分離膠注入玻璃板夾層中，馬上加ddH20於表面，使膠面保持平整；待分離膠凝聚後，倒去並吸乾分離膠表面的水分，配製5%的濃縮膠灌入玻璃板夾層中，插入點樣梳。12%分離膠和5%濃縮膠配置如表26:表26.12%和5%凝膠的配製tableseeoriginaldocumentpage22②上樣將提取的轉基因唐魚和非轉基因唐魚的肌肉蛋白分別加入等體積的2xSDS-PAGE上樣緩衝液，IO(TC水浴煮沸5min,每個泳道上樣20^L;③電泳起始電壓為100V，待樣品進入分離膠後，加大i乜壓至150V，當溴酚藍剛好跑出凝膠時，停止電泳。2)電轉移a.切取大小與凝膠一致的硝酸纖維素濾膜(NC膜)l張、普通濾紙8張，並在NC膜的右上角做切口記號；b.把硝酸纖維素濾膜漂浮於去離子水的水面.匕借毛細管作用使之從下往上溼潤後，將之浸沒於水中，浸泡5min以上，直到濾膜上沒有氣泡；c.把濾紙、墊膜(filterpad)浸泡於少量轉移緩衝液中使之充分浸溼；d.SDS-PAGE結束後從玻璃上取下凝膠，去離子水中略作漂洗；e.按下列順序逐張疊放、精確對齊灰色板在最下方，其上依次放置墊膜、4張濾紙、凝膠、NC膜、4張濾紙、墊膜。小心趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；f.小心地合上轉移槽的膠板，並立即放入轉移槽'I'。注意不要移動凝膠和濾紙；g.加入轉移緩衝液，至轉移膠板浸沒。同時加入冰盒避免電泳過程緩衝液溫度過高；h.接通電源，注意正負極方向。凝膠位於負極，NC膜位於正極。50V，2h;i.轉移結束後打開膠板取出NC膜，室溫乾燥30min。根據預染蛋白Marker的條帶清晰狀況判斷轉膜效果。3)封閉a.按濾膜面積O.lml/cm2的量加入封閉液，儘可能排除裡面的氣泡，然後密閉袋口，平放，室溫搖床孵育l2h或4t:過夜；1)1>85溶液洗膜3次，10111111/次。加入含一抗的封閉液(稀釋比例為1:1000)，4。C平緩搖23h;c.TBST溶液(含0.40.5%T\veen20的TBS)漂洗3次,10min/次。再用TBS漂洗3次，10min/次。4)與二抗反應a.二抗(辣根過氧化酶標記的IgG羊抗兔)用封閉液按1:400的比例稀釋，室溫緩慢搖動lh;b.PBS洗NC膜3次，10min/次。再用TBS漂洗3次,10min/次。5)顯色按DAB顯色試劑盒的使用說叨，分別加入A、B、C液各1滴至lmlddH20中，1030min顯色，待蛋白帶顏色深度達到耍求後用水終止反應，掃描NC膜。Westernblotting的結果如圖4所示轉基因唐魚和野生型唐魚的肌肉巾均可檢測到大小與生長激素蛋白相當(21KD)的特異性條帶，陽性對照(重組鯉魚GH)條帶最清晰(第1泳道)，實驗魚(第三泳道)的條帶比野生型的明顯性(第二泳道)。6、培育70d和100d，分別測定對轉植基因和非轉基因唐魚進行了全長和體重，數據見表27。培育70d的實驗魚中有3尾大體型魚，其中最大個體的體重是對照組魚最大個體體重的1.7倍，是對照組魚平均體重的2.5倍；培育100d，實驗組最大個體體重1.120g，是對照組最大個體體重的2.1倍，是對照組平均體重的3.0倍。表27.實驗組與對照組魚全長與體重平均值70d100d實驗魚平均全長(mm)平均體重(g)平均全長(mm)平均體重(g)轉基因唐魚28.66±5.270.242±0.09233.71±4.970.401±0.087(共37尾)非轉基因唐魚27.41±5.000.203士0.04232.22±4.300.373±0.041(共32尾)綜合PCR、Southern雜交、RT-PCR和Westernblotting雜交結果，以及體長體重的數值比較，說明轉植的GH基因整合到了實驗唐魚體中並進行了有效的GHmRNA的轉錄,表達了GH蛋白，發揮了GH的促生長功能。唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用序列表.t.xtSEQUENCELIST頂G<110〉中國水產科學研究院珠江水產研究所〈120〉唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用〈130〉<160〉2<170〉Paterrtlnversion3.2<210〉1<211〉1145<212〉DMA<213〉唐魚(Tanichthysalbonubes)〈220〉CDS<222〉(65)..(694)<400〉1acgcggggaaaccttcacagcaagccttcaactaagaacacaagagttggcaacccagag60caaaatggetagagcattggtgctgtttteggtggttctggttagtttg109MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeu151015ttggtgaaccaggggagagccteagagaaccageggetcateaacaat157LeuAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsn202530getgtcatecgt.gttcaacacctgcaccagctggetgcaaaaatgatt205AlaVallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlie354045aacgactttgaggacaacctgttgcctgaggaacgcagacagctgag"t253AsnA_spPhe6luAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSer505560aaaatttttcct.ctgtctttctgcaactctgactecattgaggcgccc301LysliePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaPro657075actggaaaagatgaaacgcagaagaget.ct.atgt.tgaagetccttcgc349ThrGlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArg80859095atetctttccgcetcattgagtectgggagtttcccagecagaccctg397lieSerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeu100105110agtggaaccgtctctaacagectgaccgtcgggaaccccaaccagate445SerGlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlvAsnProAsnGinlie115120125actgagaagctggccgacttgaaagtgggcateagegtgetcateaag493ThrGluLysLeuAlaAspLeuLysValGlvlieSerValLeulieLys130135140ggatgtctggatggtcaaccaaacatggacgacaatgactecctgccg541GlvCysLeuAspGlyGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuPro145150155ctgcctttcgaggatttctacttgaccatgggggagaacageetcaga589LeuProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArg160165170175gagagetttcgtcttctggettgcttcaagaaggacatgcacaaggtg637GluSerPheArgLeuLeuAlaCysPheLvsLysAspMetHisLysVal180lbOgaaacttacctgagggttgcaetattgcaggagatecctggatteaaac685GluThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsn唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用序列表.txt195200205tgcaccctgt鄰a.gggcgccaaagtattgctagtcatagcctgtaacac734CysThrLeu210gtgtgct.tcgct.t.aattaal:tatctggtcttacatacccagaaaaggtcaagcaggct.gg794gtt3gtmgt.tctatatttccctcaccct.ttt.gtntttttcttctattttg,attg854cccattatttatggtgggatctgattaaacatttaaaagtattttatggc914ataat.attttaaaat.ttgcccttttcactt.t.ggcttattatg3CCCC333aagggttaag974犯tgctt.ttggccaa犯c^agtgtttgaatggtgggtttcccccccsatggttgggatg1034cttaataccaatggt.gttttaattgttagatcgggttttt1094ct.ggtgt.gattttccccaaaaaattttaaaacggc3ca^1145PRT唐魚2MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeuLeu151015ValAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsnAla202530VallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlieAsn354045AspPheGluAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSerLys505560liePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaProThr65707580GlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArglie859095SerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeuSer100105110GlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlyAsnProAsnGinlieThr115120125GluLysLeuAlaAspLeuLysValGlylieSerValLeulieLysGly130135140CysLeuAspGlvGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuProLeu145150155160ProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArgGlu165170175SerPheArgLeuLeuAlaCvsPheLysLysAspMetHisLysValGlu180185190唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用序列表.txtThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsnCys195200205ThrLeu210權利要求1.唐魚生長激素基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、根據權利要求1所述的多功能燃煤催化劑，特徵在於，所述的鹼金屬氧化物為Na20、LO或Cs20;所述的鹼土金屬氧化物為CaO、MgO或BaO;所述的過渡金屬氧化物為FeO、MnO、NiO、CuO、CoO、SbO、HgO、VO、WO、MoO或Ti。2。3、根據權利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特徵在於，所述的鹼金屬滷化物為NaX、KX或CsX;所述的鹼土金屬卣化物為CaXz、MgX2或BaX2;所述的過渡金屬卣化物為FeX2、MnX2、CuX2或HgX;其中X為氟、氯、溴或者碘。4、根據權利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特徵在於，所述的鹼金屬氫氧化合物為NaOH、KOH或CsOH;所述的鹼土金屬氫氧化合物為Ca(OH)2、Mg(OH)2或Ba(OH)2;所述的過渡金屬氫氧化合物為Fe(0H)2或A1(0H)3。5、根據權利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特徵在於，所述的過渡金屬有機化合物為醋酸鋅、醋酸銅、醋酸鐵或醋酸鎳。6、根據權利要求l-5任一項所述燃煤催化劑，其特徵在於該催化劑在溫度為IOO(TC時，失重30-50%。7、權利要求1-5任一項所述多功能燃煤催化劑的製備方法，其特徵在於，以摩爾份數計，將氧化物1~25份、滷化物2~10份、氫氧化合物1~25份、有機金屬化合物1~IO份和鹼金屬的鹽1~25份混合，過篩，得燃煤催化劑；所述氧化物為鹼金屬氧化物、鹼全文摘要本發明公開了唐魚生長激素基因及其真核表達載體與應用。本發明根據GenBank上已登陸的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區內設計了一對引物(p1和p2)，然後提取唐魚總RNA，以總RNA為模板，P1和P2為引物，獲得了唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp。本發明將唐魚生長激素基因連接到轉基因表達載體，構建了新的重組表達載體，並且成功在轉基因唐魚內穩定表達。本發明的唐魚生長激素基因能應用於唐魚等魚類的生長促進，應用前景廣闊。文檔編號C12N15/16GK101220362SQ200710031440公開日2008年7月16日申請日期2007年11月16日優先權日2007年11月16日發明者勞海華,星葉,夏仕玲,王海英,白俊傑,清簡,鬱二蒙申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所