包含痘苗病毒載體和仙臺病毒載體的初免-加強疫苗用病毒載體的製作方法

2023-05-25 19:51:31

專利名稱：包含痘苗病毒載體和仙臺病毒載體的初免-加強疫苗用病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及初免-加強疫苗用病毒載體，特別是涉及能夠用於使細胞免疫和體液免疫的任一個均可激活的初免-加強(prime-boost)疫苗的初免-加強疫苗用病毒載體。
背景技術：
人類是暴露於由於病毒、細菌、真菌及其他各種各樣的生物的感染以及由其引起的傳染病的危險之中的。克服這些傳染病的一種方法是接種疫苗。疫苗大致分為使用減毒細菌、病毒等病原微生物本身的活疫苗和使用通過化學處理等死去的病原微生物或者表現抗原性的其一部分的滅活疫苗。從賦予強的免疫力這點而言，期望疫苗能夠激活細胞免疫和體液免疫兩方，活疫苗能夠激活該兩方而在獲得免疫力強、免疫持續時間也長等方面是有效的，但由於作為減毒病原的病原微生物本身被給予生物體，難以完全消除由病原微生物的感染引起的副反應、由於減毒病原微生物的回覆(reversion)而強毒化(回復突變或者返祖)等隱患。因此，對於像人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類肝炎病毒(HCV)等那樣，一旦感染則會患上極為嚴重的疾病那種病原微生物，利用滅活疫苗，特別是在對人類安全性高的感染性病毒的基因組中，通過基因重組方法重組編碼來自病原微生物的抗原蛋白質的基因的病毒載體疫苗。對於這種病毒載體疫苗，必須為具備對生物體的高度安全性與重組基因的高表達性的病毒載體。作為這樣的病毒載體，利用具有在哺乳動物中不能增殖性質的病毒、改變基因組使其雖然感染但在宿主中不產生子代病毒的病毒等，具體地，已利用金絲雀痘病毒、痘苗病毒 MVA(Modif ied Vaccinia virus Ankara)、痕苗病毒 LC16m8 株、痕苗病毒 LC16m8 株的B5R基因缺失而不產生具有正常功能的B5R基因產物的痘苗病毒m8 A B5R株(專利文獻I)、載體亞型5的El基因和E3基因缺失的腺病毒、仙臺病毒等。另外，作為病毒載體疫苗，除了以痘苗病毒LC16m8株為載體的人類B型肝炎疫苗(非專利文獻I)以外，正在多方開發在痘苗病毒LC16m8株中重組有HIV包膜蛋白質gpl60(GenBank編號U21135)的HIV疫苗(專利文獻2)、在仙臺病毒載體中重組有HIV的gag蛋白質的HIV疫苗(專利文獻3)等各種在病毒載體(腺病毒載體、仙臺病毒載體(sendal virusvector)、痘苗病毒載體(vaccinia virus vector)、金絲雀痘病毒載體等)中重組有HIV-1的組成蛋白質基因的HIV疫苗。主流正在從一種免疫方法僅使用一種疫苗的方法，向使用組合兩種以上的疫苗的初免-加強疫苗的方法轉變。作為初免-加強疫苗，除了大量正在嘗試的組合重組有抗原蛋白質基因的質粒(DNA 疫苗)與各種病毒載體的初免-加強疫苗以外，正在開發用在安全性高的BCG中插入有HIV-1的gag基因的rBCG/HIV-1 gag E疫苗進行初免、用在作為在人類體內不增殖的弱毒痘苗病毒的痘苗病毒DIs株中插入有HIV-1的gag蛋白質基因的痘苗DIs/HIV-lgag E疫苗進行加強的初免-加強HIV疫苗(專利文獻4)、組合金絲雀痘病毒載體與HIV包膜蛋白質gpl20的初免-加強HIV疫苗(非專利文獻2)。另一方面，由於活化⑶4陽性T細胞、活化⑶8陽性T細胞等免疫細胞表達的⑶40配體(⑶40L)是使樹突狀細胞活化的因子，因此有報導用其激活免疫的方法，還報導了給予可溶性CD40L蛋白質而激活免疫的方法，使用導入CD40L表達載體而活化的樹突狀細胞的惡性腫瘤的免疫療法,將可溶性CD40L蛋白質和質粒、非增殖性痘苗病毒載體混合給予而激活免疫的方法(非專利文獻3)，使⑶40配體(⑶40L)、以及其非切斷型突變體⑶40Lm在重組細胞中表達從而改變該細胞的免疫反應性的方法(專利文獻5)等。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:國際公開第2005/054451號專利文獻2:日本特開2003-321391號專利文獻3:國際公開第2001/072340號專利文獻4:日本特開2006-149234號專利文獻5:國際公開第2005/100558號非專利文獻非專利文獻1:橋爪壯，新的弱毒痘菌株LC16m8株的基礎，臨床與病毒，第3卷，第3號，第229頁，1975年非專利文獻2 =Perks-Ngarm S.等，N.Engl.J.Med.，第 361 卷，第 2209-2220 頁，2009 年 非專利文獻3:C.E.Gomez 等，Vaccine，第 27 卷，第 3165-3174 頁，2009 年

發明內容
發明要解決的問題可是，在各種病毒載體中重組有HIV-1的組成蛋白質基因的HIV疫苗雖然激活細胞免疫，但對體液免疫的激活微弱。另外，臨床試驗表明，使用激活細胞免疫的腺病毒載體的HIV疫苗沒有抑制HIV-1的感染的效果(Science，第321卷，第530頁，2008年)。進一步地，非專利文獻3中記載的、將可溶性CD40L蛋白質和質粒、非增殖性痘苗病毒載體混合給予而激活免疫的方法也是激活細胞免疫，而體液免疫的激活效果有限。另一方面，以往的組合質粒與各種病毒載體的初免-加強疫苗也是激活細胞免疫，而抗體誘導能力微弱。臨床試驗表明，非專利文獻2中記載的組合金絲雀痘病毒載體和HIV包膜蛋白質gpl20的初免-加強H IV疫苗使HIV-1的感染率在某種程度上(30%)減少，但難以說是充分的感染抑制效果。也就是說，尚未完成對HIV、HCV等嚴重的疾病能夠決定性地激活體液免疫和細胞免疫兩方的載體疫苗、初免-加強疫苗。特別是對於HIV而言，當激活體液免疫和細胞免疫兩方被認為是必需時，現有的HIV用載體疫苗產生的中和抗體效價低，難以說是實用水平，因此期待開發誘導體液免疫和細胞免疫兩方的載體疫苗。另外，初免-加強疫苗免疫激活效果根據各種各樣的載體疫苗的組合、用哪一個進行初免用哪一個進行加強的順序、免疫原性蛋白質的種類、表達量的調節等而不同，因此其選擇、決定，也就是疫苗設計依然是不得不經過試驗錯誤而進行的狀況。
進一步地，除了病毒等的傳染病以外，在作為人類的主要死亡原因之一的惡性腫瘤的治療中，也正在開發腫瘤抗原相關疫苗、所謂癌症疫苗的利用。癌症疫苗療法是確定在惡性腫瘤組織或者腫瘤細胞中特異性或者顯著表達的抗原性物質，通過提高患者自身對該抗原性物質的免疫力而治療惡性腫瘤的嘗試。在惡性腫瘤的情況下，由於實際上不能將惡性腫瘤直接作為活疫苗，因此期待開發滅活疫苗、特別是能夠使腫瘤抗原在生物體內表達的載體疫苗、尤其是針對惡性腫瘤的初免-加強疫苗。本發明的課題是，提供可以用於能夠激活細胞免疫和體液免疫兩方、對一般的疫苗療法存在困難的由病原微生物引起的傳染病、惡性腫瘤有效的初免-加強疫苗的製造的病毒載體。解決問題的手段本發明人在為了製造針對病原微生物的初免-加強疫苗的疫苗設計中發現，通過用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體進行初免、用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體進行加強，能夠激活細胞免疫和體液免疫兩方，並且通過在進行初免時使CD40Lm與抗原蛋白質一起表達，免疫激活效果增強，從而完成了下述各發明。( I)包含下述(a)和(b)的初免-加強疫苗用病毒載體:·
(a)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，(b)可表達地攜帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體。(2) (I)中記載的初免-加強疫苗用病毒載體，含有下述(C):(c)可表達地攜帶編碼⑶40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。(3) (I)中記載的初免-加強疫苗用病毒載體，可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體是可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因以及編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。(4) (I)至(3)中任一項記載的初免-加強疫苗用病毒載體，進行初免用病毒載體為(a)或者(a)和(C)，並且加強用病毒載體為(b)。(5) (I)至(4)中任一項記載的初免-加強疫苗用病毒載體,痘苗病毒載體是痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lcl6m0株，並且是B5R基因中I個或者多個核苷酸替換、添加、插入和/或缺失的不產生具有正常功能的B5R基因產物的痘苗病毒載體。(6) (I)至(5)中任一項記載的初免-加強疫苗用病毒載體，具有免疫原性的多肽是針對人類的病原微生物的抗原蛋白質或其部分肽、或者人類腫瘤抗原蛋白質或其部分肽。(7) (6)中記載的初免-加強疫苗用病毒載體，病原微生物是從由人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、伊波拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質炎病毒、聖路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結核桿菌、白喉桿菌、傷寒沙門氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風菌、分支桿菌以及瘧原蟲組成的組中選擇的病原微生物。發明效果根據本發明的初免-加強疫苗用病毒載體，除了病原微生物特異性的細胞因子的產生等細胞免疫的激活以外，還能夠進行病原微生物特異性的抗體的產生等體液免疫的激活，因此能夠在初免-加強疫苗中使用。也就是說，根據使用本發明的初免-加強疫苗用病毒載體的初免-加強疫苗，能夠抑制以往不能進行充分的感染抑制的HIV等病原微生物的感染。進一步地，通過將本發明的初免-加強疫苗用病毒載體攜帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因適當變更為來自各種病原微生物、惡性腫瘤的基因，能夠製造對各種傳染病、惡性腫瘤的預防、治療有效的初免-加強疫苗。


圖1 是表不在 m8A-〈高 pro〉-env、m8A-〈低 pro〉_hCD40Lm、m8 A -〈高pro) -env-hCD40Lm以及m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm的基因組中插入的基因和啟動子的構成的示意圖。圖2 是表不在分別感染 m8 A -〈高 pro〉_env、m8 A -〈低 pro〉-hCD40Lm、m8 A -〈高pro) -env-hCD40Lm以及m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm的源自兔腎的細胞(RKl3細胞)中，通過蛋白質免疫印記(Western blot)檢測env和hOMOLm的表達的結果的圖。圖3是表示在用表達抗原蛋白質的質粒(DNA-env)初免後，各自用痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉)加強的小鼠(對照組)、用共表達抗原蛋白質和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env_hCD40Lm)加強的小鼠(A組)、以及用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-enV)加強的小鼠(B組)的脾臟中，⑶8陽性IFN-Y產生細胞數的測定結果的圖。圖4是表示在用表達抗原蛋白質的質粒(DNA-env)初免後，通過雙叉針刺種法用共表達抗原蛋白質和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env-hCD40Lm)(小鼠A)、以及通過皮內注射用共表達抗原 蛋白質和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro) -env-hCD40Lm)(小鼠B)加強的小鼠的脾臟中，⑶8陽性IFN-Y產生細胞數的測定結果的圖。圖5是表示在用表達抗原蛋白質的質粒(DNA-env)初免後、用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)加強的小鼠(小鼠A)的血清中的抗env抗體的結合活性的測定結果的圖(左圖)，以及表示用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)進行初免後、用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(小鼠B)的血清中的抗env抗體的結合活性的測定結果的圖(右圖)。圖6是表示在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(A組)、用共表達抗原蛋白質和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env-hCD40Lm)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(B組)、以及沒有接種任何物質的小鼠(對照組)的脾臟中，⑶8陽性IFN-Y產生細胞數的測定結果的圖。圖7是表示在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(A組)、以及用共表達抗原蛋白質和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env-hCD40Lm)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(B組)的血清中，抗env抗體的結合活性的圖(右圖)，以及表示A組和B組的血清中，抗env抗體的中和活性的測定結果的圖(左圖)。圖8是表示在用表達抗原蛋白質的質粒(DNA-env)初免後，各自用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達痘苗病毒載體(m8 A -〈低pro) -h⑶40Lm)加強的小鼠(A組)、用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro) -env)和CD40Lm高表達痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm)加強的小鼠(B組)、以及用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-enV)和痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉)加強的小鼠(對照組)的脾臟中，⑶8陽性IFN-Y產生細胞數的測定結果的圖。圖9是表不用表達抗原蛋白質的質粒(DNA-env)初免後，用表達抗原蛋白質的痕苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env)和CD40Lm高表達痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm)加強的小鼠(A組)的血清中，抗env抗體的結合活性的測定結果中代表性的結果的圖。圖10是表示在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉_env)和OMOLm低表達痘苗病毒載體(m8 A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(A組)、用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(B組)、以及沒有接種任何物質的小鼠(對照組)的脾臟中，⑶8陽性IFN-Y產生細胞數的測定結果的圖。圖11是表示在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達痘苗病毒載體(m8A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(A組)、以及用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro) -env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(B組)的血清中，抗env抗體的結合活性(右圖)，以及A組和B組的血清中的抗env抗體的中和活性(左圖)的測定結果的圖。圖12是表示在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達痘苗病毒載體(m8A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(A組)、用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro) -env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(B組)、用共表達抗原蛋白質和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro) -env-hOMOLm)初免 後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(C組)、用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體(Sev-env)加強的小鼠(D組)、以及沒有接種任何物質的小鼠(對照組)的脾臟中，⑶4陽性IFN-Y產生細胞數以及⑶4陽性IL-4產生細胞的平均螢光強度的測定結果的圖(分別為左圖和右圖)。
具體實施例方式以下對本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體進行詳細說明。本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體，是包含(a)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體以及(b)可表達地編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體的初免-加強疫苗用病毒載體。初免-加強疫苗是指由包含初次免疫(初免，prime, priming)中使用的疫苗與追加免疫(加強，boost，boosting)中使用的疫苗的兩種以上的疫苗形成的疫苗，通常，初次免疫中使用的疫苗與追加免疫中使用的疫苗是各不相同的疫苗。
本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體包含可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體。痘苗病毒載體除了其安全性以外，在對於人類誘發合適的免疫反應這點上也是優異的載體。作為在本發明中能夠使用的痘苗病毒載體，可以列舉例如LC16株、LC16m8株、LC16m0株、DIs株、MVA株等，特別優選使用這些載體的B5R基因中I個或者多個核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而不產生具有正常的功能的B5R基因產物的痘苗病毒載體(上述專利文獻I)。通過不產生具有正常功能的B5R基因產物，能夠消除由於痘苗病毒的回覆而產生的強毒化，即回復突變、所謂返祖等問題。這樣的不產生具有正常功能的B5R基因產物的痘苗病毒載體，有B5R基因缺失的LC16株、m8 A B5R(LC16m8 A株)、m0 A B5R (LC16mOA株)、m8proB5RdTM、m0proB5RdTM等，其中特別優選使用B5R基因缺失的LC16株、m8AB5R (LC16m8 A株)以及mOAB5R (LC16mOA株)。其中，專利文獻I記載了不產生具有正常功能的B5R基因產物的痘苗病毒載體的詳細信息。用於種痘的LC16m8株接種了約10萬人的嬰幼兒和約3千人的成人，但沒有嚴重的副作用的報導。可是，由於LC16m8株具有遺傳不穩定而產生強毒回復突變株的缺點，本發明人因此製備了不產生回復突變株的LC16m8 A株。LC16m8 A株與作為不能增殖的痘苗病毒株的DIs株、MVA株相比較，具有優異的免疫誘導(M.Kidokoro等，Proc.Natl.Acad.Sc1.，第 102 卷，第 4152-4157 頁，2005 年；H.Suzuki 等，Vaccine，第 27 卷，第 966-971 頁，2009)，在猴子中也報導了預防高病原性的猴痘的感染(2006年日本病毒學會)。根據以上情況，期待LC16m8 A株能夠誘導對人類安全且優異的免疫力。這裡，在本發明中，提及「 I個或者多個核苷酸替換、添加、插入和/或缺失」時的缺失、替換、插入和/或 添加的核苷酸的個數，只要在轉錄和翻譯時不產生具有正常功能的B5R基因產物，則沒有特殊限制，但可以列舉例如I 997個，優選100 997個，更優選300 997個，進一步優選500 997個，更進一步優選700 997個的任意個數。本發明涉及的可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，也可以是同時可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40配體非切斷型突變體(CD40Lm)的基因的痘苗病毒載體(共表達痘苗病毒載體)。其中，在專利文獻4中記載了⑶40Lm的功能、⑶40Lm基因的序列信息等的詳細信息。在本發明中，所謂具有免疫原性的多肽，是指在給予生物體時能夠在給予的生物體中誘導細胞免疫和/或體液免疫的免疫反應的多肽，作為這種多肽，可以列舉例如針對人類的病原微生物的抗原蛋白質、人類腫瘤抗原蛋白質、或者這些蛋白質的部分肽等。這裡，在本發明中「激活」可以與「誘導」或者「活化」交換使用。另外，本發明中所謂多肽是指2個以上的胺基酸通過肽鍵連接而成的化合物，構成的胺基酸數沒有特殊限制，包含例如由2個胺基酸形成的二肽、由3個胺基酸形成的三肽、由4個胺基酸形成的四肽、由10個左右的胺基酸形成的寡肽、由20個以上的胺基酸形成的肽、蛋白質。在本發明中，作為針對人類的病原微生物，可以列舉例如人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、伊波拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質炎病毒、聖路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結核桿菌、白喉桿菌、傷寒沙門氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風菌、分支桿菌以及瘧原蟲、A組P型溶血性鏈球菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、李斯特菌、腦膜炎球菌、淋菌、病原性大腸桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、沙雷氏菌、朽1檬酸桿菌、不動桿菌、腸桿菌、支原體、衣原體、梭狀芽孢桿菌等，作為針對人類的病原微生物的抗原蛋白質，可以列舉例如人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白質gpl60和gpl20 (env)、gp41、pol蛋白質逆轉錄酶、nef蛋白質、tat蛋白質、gag前體p55、p24蛋白質、流感病毒的血凝素、神經氨酸酶、M2、C肝病毒的包膜蛋白質El、E2、B肝病毒的HBs抗原等。另外，作為人類腫瘤抗原蛋白質，可以列舉例如作為黑素細胞組織特異性蛋白質的gpl00(Bakker等,J.Exp.Med.，第179卷,第1005頁，1994年)、宮頸癌的人類乳頭瘤病毒E6 蛋白質、E7 蛋白質、MART-1 (Kawakami 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.，第 91 卷，第 3515 頁，1994年)、酪氨酸酶(Brichard等,J.Exp.Med.,第178卷,第489頁，1993年)等黑素小體相關抗原，HER2/neu (Fisk B.等，J.Exp.Med ，第 181 卷，第 2109 頁，1995 年)、CEA (TsangK.Y.等，J.Natl.Cancer Inst ,第 87 卷，第 982 頁，1995 年)，PSA( Correale P.等，J.Natl.Cancer Inst.,第 89 卷,第 293 頁，1997 年)等。在本發明中，可表 達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體能夠通過如下步驟製備:製備適於導入的連結有編碼具有免疫原性的多肽的基因的質粒(轉移載體，transfer vector),將其導入感染痘苗病毒的細胞中,在該細胞中發生同源重組。另外作為其他方法，也可以通過如下步驟製備:將適於導入的編碼具有免疫原性的多肽的基因片段以適當的限制酶消化，直接連結入用同樣的酶消化的痘苗病毒基因組，將該重組痘苗病毒基因組導入病毒感染細胞。作為能夠在可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的製備中使用的質粒，可以列舉例如 pSFJl-10、pSFJ2-16、pMM4、pGS20、pSCll、pMJ601、p2001、pBCBOl-3, 06、pTKgpt-Fl-3s、pTMl、pTM3、pPR34, 35、pgpt-ATA18-2、pHESl_3、pJW322、pVRl、pCA、pBHAR 等。編碼具有免疫原性的多肽的基因的導入區域為痘苗病毒的生命周期的非必需基因區域，可以列舉例如血凝素(HA)基因、胸苷激酶(TK)基因、B5R基因(B4R基因與B6R基因之間)、F片段等區域。例如，在HA基因中導入有編碼具有免疫原性的多肽的基因的重組子中，HA基因被導入的外源基因打斷而失去功能。因此，噬斑由於不吸附雞紅細胞而呈現白色，從而能夠容易地篩選重組子。另外，在TK基因中導入有編碼具有免疫原性的多肽的基因的重組子中，TK基因的功能缺失，5-溴脫氧尿酐(BudR)沒有致死性作用，因而能夠通過BudR進行篩選。另外，在B5R基因中導入有編碼具有免疫原性的多肽的基因時，重組子的噬斑變小，因而能夠通過噬斑的大小進行篩選。這裡，導入部分的基因優選由於I個或者多個核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而病毒的性狀變化、重組子的選擇變得容易的基因。作為可以感染痘苗病毒載體的細胞，可以使用Vero細胞、HeLa細胞、CVl細胞、COS細胞、RK13細胞、BHK細胞、原代兔腎細胞、BSC-1細胞、HTK-143細胞、H印2細胞、MDCK細胞等痘苗病毒能感染的細胞。將編碼具有免疫原性的多肽的基因導入時，能夠在編碼具有免疫原性的多肽的基因的上遊將適當的啟動子以能夠發揮功能的方式連接。這種啟動子沒有特殊限制，例如能夠使用ATl啟動子、PSFJl-10、PSFJ2-16、p7.5啟動子、p7.5啟動子的改良型啟動子(7.5E)、PllK啟動子、T7.10啟動子、CPX啟動子、HF啟動子、H6啟動子、T7雜合啟動子等。
在痘苗病毒載體中導入編碼具有免疫原性的多肽的基因的方法，能夠按照構建重組痘苗病毒載體的公知方法進行，例如能夠按照「《補充實驗醫學，方法系列，基因轉移與表達分析實驗方法》(Supplement Experimental Medicine, The Protocol Series,Experimental Protocols for Gene Transfer&Expression Analysis)(齋藤泉等編，羊土社，1997年9月I日發行)」或者「《DNA克隆4-哺乳動物系統，第2版》(D.M.Glover等編，加藤鬱之進監譯，寶生物)」、「The EMBO Journal，第6卷，第3379-3384頁，1987年」等的記載進行。然後，本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體包含可表達地攜帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體。這裡，「上述免疫原性」是指本發明涉及的痘苗病毒載體可表達地攜帶的多肽所具有的免疫原性。也就是說，本發明涉及的仙臺病毒載體可表達地攜帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因可以與本發明涉及的痘苗病毒載體攜帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因相同，只要具有同樣的免疫原性，也可以是不同的基因。仙臺病毒不與宿主的基因組相互作用地複製，並且沒有對人類的病原性，因此作為載體而被利用，可以認為它是應用於人類時安全性高的病毒。在本發明中，仙臺病毒載體可以具有與野生型同樣的複製能力，也可以是沒有複製能力的缺陷型載體。另外，本發明中涉及的仙臺病毒載體，也可以是野生型仙臺病毒的基因配置、基因組的鹼基序列被改變了的載體。進而，使用源自包膜蛋白質、外殼蛋白質中含有減毒突變、溫度敏感性突變的仙臺病毒突變株的仙臺病毒載體也沒有關係。在本發明中，可表達地攜帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體，除了能夠通過在與上述可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的製備方法相同的方法 中，按照專利文獻3的記載，用仙臺病毒代替痘苗病毒，作為感染病毒載體的細胞用LLC-MK2細胞、CVl細胞、BHK細胞、來自人類的細胞等仙臺病毒能夠感染的細胞進行，從而製備以外，作為其他方法，還可以通過將適於導入的編碼具有免疫原性的多肽的基因片段用適當的限制酶消化，直接連接入添加了相同的酶識別位點的仙臺病毒基因組中，將該重組仙臺病毒基因組與適當的輔助質粒一起導入仙臺病毒能夠感染的細胞中而製備。另外，F蛋白質缺失的仙臺病毒載體的製備能夠按照已有報導(國際公開第2000/70055號、國際公開第2000/70070號)進行。然後，本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體的不同形態為包含(a)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體、(b)可表達地攜帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體以及(C)可表達地攜帶編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體的初免-加強疫苗用病毒載體。在本發明中，可表達地攜帶編碼⑶40Lm的基因的痘苗病毒載體能夠通過在與上述可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的製備方法相同的方法中，將編碼具有免疫原性的多肽的基因用CD40Lm基因代替進行而製備。這裡，在本發明涉及的可表達地攜帶編碼CD40Lm的基因的痘苗病毒載體中，誘導CD40Lm的表達的啟動子優選使用P7.5啟動子等賦予比較中等表達量的啟動子。在本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體中，可以用任一個病毒載體進行初免，用任一個病毒載體加強而使用，但優選將(i )可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體、(ii)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40Lm的基因的痘苗病毒載體、或者(iii)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體和可表達地攜帶編碼⑶40Lm的基因的痘苗病毒載體的(i)至(iii)中任一個作為初免用，將可表達地攜帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體作為加強用。這裡，當然地，只要是屬於本發明的技術領域的技術人員就能夠理解:作為用本發明涉及的初免-加強疫苗用病毒載體使哺乳動物、特別是使人類免疫的方法、免疫激活方法，將上述載體作為疫苗使用的方法(包括作為疫苗的使用)，將上述載體用於醫藥的製造的方法，含有上述載體與藥學上允許的賦形劑的醫藥組合物等而表示的發明也被本說明書的記載、特別是下述實施例的記載公開。以下基於實施例對本發明涉及的包含痘苗病毒載體和仙臺病毒載體的初免-加強疫苗用病毒載體進行說明。這裡，本發明的技術範圍不受通過這些實施例顯示的特徵的限制。實施例(I)攜帶編碼人類免疫缺陷病毒包膜蛋白質的基因的痘苗病毒載體的製備[1-1]m8 A -〈高 pro〉-env 的製備〈1-1-1〉env 基因的製備通過將編碼人類免疫缺陷病毒HIV-1JR-CSF株的包膜蛋白質gpl60和gpl20(env)的基因(登錄號M38429 )插入p JW322的Avr 11/Xho I位點，得到p JW322_env。然後，為了使env高效表達，在env基因中使存在於第6751位至第6757位、第7367位至第7373位、以及第8305位至第8311位的痘苗病毒的轉錄終止序列通過體外誘變(in vitro mutagenesis)方法，發生如下所述突變，將其作為pJW322-env2。這裡，通過該突變env的胺基酸序列沒有變化。第6751位至第6757位突變前:TTTTTAT (序列編號I)突變後:TTTCTAT (序列編號2)第7367位至第7373位突變前:TTTTTCT (序列編號3)突變後:TTCTTCT (序列編號4)第8305位至第8311位突變前:TTTTTCT (序列編號5)突變後:TTTCTCT (序列編號6)接著，以pJW322_env2為模板,用下述引物進行PCR,擴增並分離env基因。正向引物:5』-TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGG-3』(序列編號 7)，反向引物:5』-ATAGGCCGGCCTTATAGCA AAGCCCTTTCCAAGC-3』(序列編號 8)。將得到的PC R產物純化後，用限制酶Fse I和Rsr II消化。〈1-1-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入將攜帶插入有ATl啟動子、10個連續的改良型p7.5啟動子(7.5E)以及多克隆位點(MCS)的基因組的痘苗病毒LC16m8 A株(m8A-〈高pro〉)(Suzuki H.等，Vaccine,第27卷，第966-971頁，2009年)，通過使用20-40%蔗糖梯度的超速離心純化。ATl啟動子以及10個重複的7.5E為使存在於其下遊的基因高效表達的啟動子(高表達啟動子)。接著，通過苯酹/氯仿/異戍醇法從純化的m8 A-〈高pro〉抽提基因組DNA,通過乙醇沉澱而濃縮。在該基因組DNA的Fse I/Rsr II位點，插入本實施例(I) [1_1]〈 1_1_1〉的env基因，得到攜帶插入有高表達啟動子和env基因的基因組的痘苗病毒載體m8 A-〈高pro) -env的基因組。〈1-1-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化在IOOmm培養皿中，用2.4X IO5個地鼠幼鼠腎臟細胞(BHK細胞)鋪板，過夜培養後,加入培養基以使金絲雀痘病毒的感染複數(Multiplicity of infection, MOI) =10的量，在33°C培養I小時。接著，將未吸附的金絲雀痘病毒洗淨後，添加按照所附說明書將IipofectamineLTX plus (Invitrogen 公司)與本實施例(I) [1-1]〈1-1-2〉的 m8 A-〈高 pro〉-env 的基因組混合的混合物，過夜培養。隨後，將使培養的BHK細胞凍融而得的溶解液稀釋，加入在24孔板上培養的源自兔腎的細胞(RK13細胞)中，在33°C培養，形成單個噬斑。得到的單個噬斑再次凍融而得到溶解液後，將其稀釋，加入在24孔板上培養的RK13細胞中，在33°C培養，形成單個噬斑。回收單個噬斑，將其作為攜帶插入有高表達啟動子和env基因的基因組的痘苗病毒載體m8 A -〈高pro〉-env。〈1-1-4〉env表達的確認:噬斑酶聯免疫吸附實驗(Plaque ELISA)將本實施例(I) [1-1]〈1-1-3〉中回收的m8 A -〈高pro〉-env的卩遼斑用2% (w/v)多聚甲醛/PBS溶液固定後，用PBS洗滌，進一步用5% (w/w)脫脂奶粉/PBS溶液封閉後，用PBS洗滌。接著，用人類抗env抗體作為一抗、用偶聯鹼性磷酸酶的抗人類IgG抗體作為二抗，按照常規方法進行酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，確認到噬斑中env的表達。〈1-1-5〉env表達的確認:蛋白質免疫印記將本實施例(I)[1-1]〈1-1-3〉的 m8 A -(高 pro)-env 以 MOI=IO 加入 RK13 細胞中，在33°C吸附I小時。接著，將未吸附的病毒洗淨後，加入培養基過夜培養。接著，將約I ii g該RK13細胞用10%聚丙烯醯胺凝膠電泳，用HIV-1感染者血清，按照常規方法進行蛋白質免疫印記，確認到env的表達。其結果示於圖2。〈1-1-6〉痘苗病毒載體的大量培養將本實施例(I) [1-1]〈1-1-3〉的m8 A-〈高pro〉-env在RK13細胞中大量培養後，通過使用36% (w/v)蔗糖墊層的超速離心純化濃縮，測定RK13細胞中的病毒效價。[l-2]m8 A -〈低 pro〉_hCD40Lm 的製備〈1-2-1〉質粒的製備以插入有人類⑶40配體非切斷型突變體(h⑶40Lm)基因的pCA_h⑶40Lm3為模板，用下述引物進行PCR，擴增並分離p7.5啟動子和h⑶40Lm基因。p7.5啟動子是一般經常使用的來自痘苗病毒的啟動子，使存在於其下遊的基因表達，但與上述高表達啟動子相比較，是下遊基因的表達量小的啟動子。正向引物:5』-AGTGGATCCGCCAGCATGATCGAAACATACAACCAA-3』(序列編號 9)，

反向引物:5，-AGACCCGAGTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGGA-3，(序列編號10)。
將得到的PCR產物純化後，用限制酶Bam HI和Ava I消化，插入質粒pVRl(ShidaH.等，EMB0.J.，第 6 卷，第 3379-3384 頁，1987 年)的血凝素(Hemagglutinin，HA)基因中的 Bam HI/Ava I 位點，從而得到 pVRl_hCD40Lm。〈1-2-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入在60mm培養皿中培養至80%匯合(confluence)的BHK細胞中，加入痘苗病毒LC16m8 A株以使MOl=0.05，在33°C培養I小時。接著，加入按照所附說明書將lipofectamine LTX plus (Invitrogen公司)和本實施例(I) [1-2]〈1-2-1〉的pVRl-hCD40Lm混合的混合物，通過在33°C培養24小時，使痘苗病毒LC16m8 A株攜帶的基因組的血凝素(HA)基因與pVRl_hCD40Lm的p7.5啟動子和h⑶40Lm基因的插入位點之間發生同源重組。〈1-2-3〉插入有基因的痘苗病毒的粗純化將使本實施例(I) [1-2]〈1-2-2〉的BHK細胞凍融而得到的溶解液加入RK13細胞中，在33 °C培養3天形成噬斑。接著，在含有鈣離子和鎂離子的PBS (Ca2+-Mg2+-PBS)中以0.5-2.0% (w/v)的量懸浮雞紅細胞，製備紅細胞吸附試驗(HAD Test)溶液。用HAD Test溶液替換形成噬斑的RK13細胞的培養基，室溫下靜置I小時後，用Ca2+-Mg2+-PBS洗漆，刮取回收未見紅細胞的凝集的無色噬斑。〈1-2-4〉插入有基因的痘苗病毒的純化對於在本實施例(I) [1-2]〈1-2-3〉中回收的噬斑，通過進一步進行2次本實施例(I) [1-2]〈1-2-3〉的操作，純化攜帶在HA基因部位插入有p7.5啟動子和h⑶40Lm基因的基因組的痘苗病毒，將其作為m8 A -〈低pro〉-hCD40Lm。〈1-2-5〉CD40Lm表達的確認:蛋白質免疫印記對於本實施例(I) [1-2]〈1-2-4〉的m8A-〈低pro〉_hCD40Lm，通過本實施例(I)[1-1]〈1-1-5〉中記載的方法進行蛋白質免疫印記，確認到hCD40Lm的表達。只是用於電泳的細胞是用10 y g代替I y g，在h⑶40Lm的檢測中，代替HIV-1感染者血清，使用抗⑶40L小鼠單克隆抗體。其結果示於圖2。〈1-2-6〉痘苗病毒載體的大量培養通過本實施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法，大量培養本實施例(I)〈1-2-4〉的m8 A -〈低pro〉-hOMOLm並純化濃縮,測定病毒效價。[l-3]m8 A -〈高 pro〉-env_hCD40Lm 的製備〈1-3-1〉質粒的製備以本實施例(I) [1-1]〈1-1-1〉的pJW322_env2為模板，用下述引物進行PCR，擴增並分離env基因。`正向引物:5』 -CTAGAAITCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG-3』(序列編號 11)，反向引物:5』-CGTGAGCTCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC-3』(序列編號 12)。將得到的PCR產物純化後，用限制酶Eco RI和Sac I消化。另外，以本實施例(I) [1-2]〈1-2-1〉的pVRl_hCD40Lm為模板，用下述引物進行PCR,擴增並分離p7.5啟動子和h⑶40Lm基因。
正向引物: 5』 -CTAGAGCTCGCCACCATATACTATATAGTAATACCAATA-3』(序列編號 13)，反向引物:5』-GTACCCGGGTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGG-3』(序列編號 14)。將得到的PCR產物純化後，用限制酶Sac I和Xma I消化。接著，將該env基因的PCR產物以及p7.5啟動子和h⑶40Lm基因的PCR產物插入PJW322 的 Eco RI/Xma I 位點，得到 pJW322-env_hCD40Lm。然後，以pJW322-env-hQ)40Lm為模板,用下述引物進行PCR,擴增並分離env基因、p7.5啟動子以及h⑶40Lm基因的區域。正向引物:5』 -TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG-3』(序列編號 15)，反向引物:5，-AGAGGCCGGCCTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGGA-3，(序列編號16)。將得到的PCR產物純化後，用限制酶Fse I和Rsr II消化。〈1-3-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入通過本實施例(I) [1-1]〈1-1-2〉中記載的方法，在m8A-〈高pro〉攜帶的基因組DNA的Fse I/Rsr II位點，插入本實施例(I) [1-3]〈1-3-1〉的env基因、ρ7.5啟動子以及hCD40Lm基因的區域，得到攜帶插入有高表達啟動子、env基因以及hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8 Λ -〈高pro〉-env-hCD40Lm的基因組。〈1-3-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化通過本實施例(I) [1-1]〈1-1-3〉中記載的方法，純化攜帶插入有高表達啟動子、env基因以及hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8A-〈高pro〉-env_hCD40Lm。〈1-3-4〉env表達的確認:噬斑酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白質免疫印記對於本實施例(I)[1-3]〈1-3-3〉的 ηι8Δ-〈高 pro〉-env-hOMOLm,通過本實施例
(I)[1-1]〈1-1-4〉中記載的方法進行酶聯免疫吸附實驗，在噬斑中確認到env的表達。另夕卜，對於本實施例(I) [1-3]〈1-3-3〉的ηι8Δ-〈高pro〉-env-hOMOLm,通過本實施例(I)[1-1]〈1-1-5〉和本實施例(I) [1-2]〈1-2-5〉中記載的方法進行蛋白質免疫印記，確認到env和h⑶40Lm的表達。其結果示於圖2。〈1-3-5〉痘苗病毒載體的大量培養通過本實施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法，大量培養本實施例(I) [1-3]〈1-3-3〉的ηι8Δ-〈高pro〉-env-hOMOLm並純化濃縮,測定病毒效價。[l-4]m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm 的製作〈1-4-1〉質粒的製備以插入有hOMOLm基因的pCA_hO)40Lm3為模板,用下述引物進行PCR,擴增並分離hCD40Lm 基因。正向引物:5』-AAACCCGGGCATGATCGAAACATACAACCAAA-3』(序列編號 17)，反向引物:5』-CCATCTAGATCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCA-3』(序列編號 18)。將得到的PCR產物純化並用限制酶Xma I和Not I消化後，插入具有AT1啟動子和
10個連續 7.5E(高表達啟動子)的 pBHAR(Jin N-Y.等，Arch.Virol.，第 138 卷，第 315-330頁，1994 年)的 Xma I/Not I 位點，得到 pBHAR_hCD40Lm。〈1-4-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入
通過本實施例(I) [1-2]〈1-2-2〉中記載的方法，在痘苗病毒LC16m8 Λ株攜帶的基因組中，插入本實施例(I) [1-4]〈1-4-1〉的高表達啟動子和h⑶40Lm基因的區域。〈1-4-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化通過本實施例(I) [1-2]〈1-2-3〉和〈1_2_4〉中記載的方法，純化攜帶插入有高表達啟動子和hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8 Λ -〈高pro〉_hCD40Lm。〈1-4-4〉hOMOLm表達的確認:蛋白質免疫印記對於本實施例(I) [1-4]〈1-4-3〉的m8A-〈高pro〉_hCD40Lm，通過本實施例(I)[1-2]〈1-2-5〉中記載的方法進行蛋白質免疫印記，確認到h⑶40Lm的表達。其結果示於圖
Δι O如圖2所示，確認到感染m8 Λ -〈高pro〉_hCD40Lm的細胞的hCD40Lm的表達量，比感染m8A-〈高pro〉-enV-hCD40Lm的細胞的hCD40Lm的表達量以及感染m8A-〈低pro) -hOMOLm的細胞的 hOMOLm的表達量大。〈1-4-5〉痘苗病毒載體的大量培養通過本實施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法,大量培養本實施例(I) [1-4]〈1-4-3〉的m8A-〈高pro〉_hCD40Lm並純化濃縮，測定病毒效價。以上本實施例(I)的m8 Δ -〈高 pro〉-env、m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm、m8 Δ -〈高pro〉-env-hQ)40Lm以及m8 Δ -〈高pro〉-hQ)40Lm中插入的基因和啟動子的構成示於圖1。(2)攜帶env的 仙臺病毒載體(SeV_env)的製作[2-1]質粒的製備將兩端添加了 Not I識別序列的env基因插入pBluescript的Not I位點,得到pBluescript—env。接著，由於在env基因中存在3處在仙臺病毒的基因表達中作為轉錄終止序列的A和T的連續序列，通過用下述引物進行PCR，在該序列中導入突變，從而得到插入有導入了突變的 env 基因(env-mut 基因)的 pBluescript-env-mut。用於突變導入的引物突變1:正向引物:5』 -CCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAGGGGATCCAGAAATTG-3』(序列編號 19)反向引物:5』 -GAATAACACTTTAAAACAGATAGTTGAGAAGCTCCGCGAGCAGTTCA ACAACA AGACCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAG-3』(序列編號 20)突變2:正向引物:5』 -GTGAAGATCGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAG-3』(序列編號 21)反向引物:5』 -GAGACATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAGCTCTACAAGTACAAGGTCGTGAAGATCGAACCATTAGGAGTA-3 』(序列編號 22 )突變3:正向引物:
5，-CGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGG-3』(序列編號 23)反向引物:5』-GTTTGACATAACAAAATGGCTGTGGTACATCAAGATCTTCATCATGATC GTGGGAGGCCTGATCGGTCTCCGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAG-3』(序列編號 24)[2-2]基因向仙臺病毒基因組的插入將本實施例(2) [2_1]的 pBluescript-env-mut 用 Not I 消化，切出 env_mut 基因片段，將其插入具有在仙臺病毒基因組的3』末端添加了 Not I識別序列的序列、並且不具有編碼仙臺病毒的表面蛋白質fusion的基因(F)的質粒pSeV/AF的Not I位點，從而得到 pSeV-env-mut/Δ F0[2-3]插入有基因的仙臺病毒的純化將本實施例(2 ) [2-2]的pSeV-env-mut/ Λ F與作為輔助質粒的pCAGGS_NP、pCAGGS-P, pCAGGS-L以及pCAGGS_T7混合，轉染293T細胞並培養。接著，將培養的293T細胞的上清加入作為F表達細胞的LLC_MK2/F/Ad細胞中並培養，回收培養上清。然後，將回收的培養上清進行有限稀釋，用96孔板感染LLC_MK2/F/Ad細胞，克隆具有 pSeV-env-mut/ Δ F 的病毒。將克隆化的病毒作為攜帶插入有env基因的基因組的仙臺病毒載體SeV-env。這裡，確認SeV-env具有的env基因的鹼基序列時，第450位的A突變為G，在胺基酸序列中天冬醯胺突變為天冬氨酸。SeV-env感染LLC_MK2/F/Ad細胞而增殖。[2-4]仙臺病毒載體的大量培養在培養了 LLC-MK2/F/Ad細胞的、36個培養面積225cm2的培養瓶中加入實施例(2)[2-3]的SeV-env並培養24小時，更換培養基，進一步培養48小時。隨後，回收培養上清並過濾，用超濾濾器濃縮。(3)攜帶env基因的質粒(DNA-env)的製作[3-1]基因向質粒中的插入以本實施例(I) [1-1]〈1-1-1〉的pJW322_env2為模板，用下述引物進行PCR，擴增並分離env基因。正向引物:5』-CTAGAATTCGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3』(序列編號 25)，反向引物:5』-CGTGAATTCACCCATCTTATAGCAAAGCCCTT-3』(序列編號 26)。將得到的PCR產物純化後，用限制酶Eco RI消化後，插入哺乳動物細胞表達載體質粒pCAGGS的Eco RI位點，得到攜帶env基因的pCAGGS質粒(DNA-env)。[3-2] env表達的確認將本實施例(3) [3-1]的DNA-env與聚乙烯亞胺(PEI, Polyscience公司)混合，轉染293T細胞後，將該細胞培養2天。接著，通過實施例(I) [1-1]〈1-1-5〉中記載的方法進行蛋白質免疫印記，確認到env的表達。[3-3] DNA-env 的大量培養用本實施例(3) [3-1]的DNA-env轉化大腸桿菌XLl-blue並大量培養後，用EndoFree Plasmid Purification (Qiagen 公司)純化。細胞免疫激活效果的確認:初免，DNA-env/加強，痘苗病毒載體的共表達痘苗病毒載體接種(I)初次免疫(初免)將實施例1(3) [3-3]的DNA-env溶解於PBS中使得成為I μ g/ml，製備DNA-env溶液。按照常規方法對9隻C57BL/6小鼠各自肌肉注射50 yL(50y g)上述溶液(初免)後，飼養2周。接著，再次按照常規方法各自肌肉注射50 μ L (SOyg)DNA-env溶液(初免)後，飼養8周。(2)追加免疫(加強)將實施例1 (I) [1-1]〈1-1-2〉的 m8A-〈高 pro〉、實施例1 (I) [1-1]〈1+6〉的 m8 Δ -〈高 pro〉_env 以及實施例1 (I) [1-3]〈1-3-5〉的ηι8Δ-〈高 pro〉-env_hCD40Lm，分別以I X 108PFU/mL的量溶解於PBS，製備m8 Λ -〈高pro〉溶液、m8 Λ -〈高pro〉-env溶液以及 πι8Δ-〈高 pro〉-env_hCD40Lm 溶液。接著，將本實施例(I)的小鼠分為3組，每組3隻，作為對照組、A組和B組。分別按照常規方法各自皮內注射IOOy·L (IX IO7PFU)如下溶液(加強)，對照組的小鼠為m8A -〈高pro〉溶液，A組小鼠為m8 Δ -〈高pro)-env溶液,B組小鼠為m8 Δ -〈高pro〉_env_hOMOLm溶液，然後詞養2周。(3) T細胞的採集按照常規方法，從本實施例(2)的各組小鼠摘出脾臟而採集脾臟細胞。將採集的脾臟細胞懸浮於RPMI1640培養基後，在200 X g、室溫條件下進行10分鐘離心分離，除去上清，添加0.8% (w/v)氯化銨水溶液而溶血，從而將紅細胞除去。將留下的脾臟細胞懸浮於RPMI1640培養基，通過尼龍網使T細胞濃縮後，按照常規方法對細胞數進行計數。(4)細胞內細胞因子染色使用HlV-lConsensus Subtype B Env (15-mer) Peptides (愛滋病研究與參照試劑計劃，AIDS Research and Reference Reagent Program),根據所附說明書刺激本實施例(3)的T細胞。接著，作為標記抗體，使用APC標記的抗小鼠IFN-Y (APC-1abeledant1-mouse IFN-Y , eBioscience 公司)和 PE 標記的抗小鼠 CD8 (PE-labeled ant1-mouseCD8, eBioscience 公司)、以及 Fixation and Permeabilization Solution Kit with BDGolgiStop (日本BD公司)，根據所附說明書將T細胞中的⑶8陽性IFN-γ產生細胞染色。(5)使用FACS對染色細胞數的測定用FACS CantoII (日本BD公司)測定在本實施例(4)中染色的⑶8陽性IFN-Y產生細胞數。對於測定的結果，求各組的平均值，用圖形表示。其結果示於圖3。如圖3所示，⑶8陽性IFN-Y產生細胞在對照組中未檢出，另一方面，在A組中作為平均值約為1.25%、在B組中作為平均值約為1%。從這些結果可知，通過用表達抗原蛋白質的質粒初免後用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體加強，細胞免疫被激活。另外表明，使此時的痘苗病毒載體除了抗原蛋白質以外，還共表達CD40Lm時，幾乎沒有見到細胞免疫激活的增強效果。細胞免疫激活效果的確認:初免:DNA-env/加強:痘苗病毒載體的共表達痘苗病毒載體的刺種接種(I)初免與加強將2隻C57BL/6小鼠分別作為小鼠A和小鼠B，對於這些小鼠，通過實施例2(1)和(2)中記載的方法，進行初免和加強。只是在加強時，製備使實施例1 (1)[1_3]〈1-3-5〉的 m8 Λ -〈高 pro〉-env_hCD40Lm 在 PBS 中以成為 I X 109PFU/mL 的量溶解的 m8 Λ -〈高pro) -enV-hCD40Lm溶液，在小鼠A中，將10 μ L (IX IO7PFU)該溶液通過雙叉針刺種接種，在小鼠 B 中將實施例 2 (2)的 I X 108PFU/mL 的 m8 Λ -〈高 pro) -envhCD40Lm 溶液 100 μ L(I X IO7PFU)通過皮內注射接種。(2) T細胞的採集、細胞內細胞因子染色以及使用FACS對染色細胞數的測定對於本實施例(1的小鼠A和小鼠B，通過實施例2 (3)至(5)中記載的方法進行T細胞的採集、細胞內細胞因子染色以及使用FACS對染色細胞數的測定。其結果示於圖4。如圖4所示，⑶8陽性IFN- Y產生細胞在小鼠B中約為1.25%，與此相對，在小鼠A中約為3.25%。從該結果可知，在用表達抗原蛋白質的質粒進行初免後用共表達抗原蛋白質和hCD40Lm的痘苗病毒載體加強而激活細胞免疫的情況下，通過將加強的接種方法用雙叉針刺種代替皮內注射，可增強細胞免疫激活效果。體液免疫激活效果的確認:初免:DNA-env/加強:痘苗病毒載體與初免:痘苗病毒載體/加強:與仙臺病毒載體的比較( 1)初免

將2隻C57BL/6小鼠作為小鼠A和小鼠B。在小鼠A中通過實施例2 (I)中記載的方法接種，在小鼠B中，製備使實施例1 (I) [1-1]〈1-1-6〉的m8A-〈高pro〉_env在PBS 中以成為 1 X 109PFU/mL 的量溶解的 m8 Λ -〈高 pro〉-env 溶液，將 10 μ L (IX IO7PFU)該溶液用雙叉針刺種(初免)，然後飼養8周。(2)加強在本實施例(I)的小鼠A中，將本實施例(I)的m8 Λ -〈高pro) -env溶液10 μ L(I X IO7PFU)用雙叉針刺種(加強)後，飼養2周。另一方面，在本實施例(I)的小鼠B中，將使實施例1(2) [2-4]的SeV-env在PBS中以成為4X 109CFU/mL的量溶解而得到的SeV-env溶液IOyL (4X IO7CFU)經鼻注射(加強)後，飼養2周。(3)血清的採集根據常規方法，從本實施例(2)的小鼠A和小鼠B採血，從而分離血清。(4)酶聯免疫吸附實驗[4-1] env固定平板的製備製備含有Tris-HCl (pH7.4) 10mmol/L、MgCl23mmol/L、NP400.5% (v/v)的 TMN緩衝液。在100mm培養皿中培養至80%匯合的293T細胞中，轉染實施例1 (3) [3_3]的DNA-env並培養2天。將該293T細胞在TMN緩衝液中溶解後，用於超濾，製備除去了分子量小於IOOkDa的蛋白質的蛋白質溶液。通過將其加入酶聯免疫吸附實驗用96孔板並溫育，得到固定有含env的抗原蛋白質的env固定平板。[4-2]使用env固定平板的酶聯免疫吸附實驗作為一抗，使用將本實施例(3)的血清分別稀釋100倍(1/100)、300倍(1/300)、900倍(1/900)、2700倍(1/2700)的稀釋液以及HIV-1感染者血清(陽性對照)，作為二抗，使用偶聯辣根過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體或者偶聯辣根過氧化物酶的抗人類IgG抗體，以及作為顯色試劑，使用TMB ELISA Substrate Solution (eBioscience公司)，按照常規方法進行酶聯免疫吸附實驗，在波長450nm下測定吸光度。其結果示於圖5。如圖5左圖所示，小鼠A的吸光度在1/100、1/300、1/900以及1/2700的任一個中均為0，未確認到抗env抗體的結合活性。與此相對，如圖5右圖所示，小鼠B的吸光度在1/100和1/300約為2.4、在1/900約為2.25、在1/2700約為1.5，由此確認到抗env抗體
的結合活性。從這些結果可知，在用表達抗原蛋白質的質粒初免後用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體加強的情況下，體液免疫未被激活，與此相對，在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強的情況下，體液免疫被激活。免疫激活效果的確認:初免:DNA-env/加強:痘苗病毒載體的共表達載體接種( )初免將15隻C57BL/6小鼠分為3組，每組各5隻，分別作為對照組、A組和B組。在A組小鼠中用實施例4 (I)的m8A-〈高pro〉_env溶液、在B組小鼠中用實施例3 (I)的m8 Λ -〈高pro) -env-hCD40Lm溶液各10 μ L (IX IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)後，飼養8周。這裡，在對照組小鼠中未接種任何物質。(2)加強在本實施例(I)的A組和B組小鼠中，分別將實施例4(2)的SeV-env溶液各10 μ L(4X IO7CFU)經鼻注射(加強)後，飼養2周。(3) T細胞和血清的採集從本實施例(2)的各組小鼠採集血清，通過實施例2 (3)中記載的方法採集T細胞。(4)細胞內細胞因子染色和使用FACS對染色細胞數的測定對於在本實施例(3)中採集的T細胞，通過實施例2 (4)和(5)中記載的方法進行細胞內細胞因子染色以及使用FACS對染色細胞數的測定。另外，對於測定的結果，在A組和B組之間進行檢驗。其結果示於圖6。如圖6所示，⑶8陽性IFN-Y產生細胞在對照組中未檢出，在A組中作為平均值約為7.2%，在B組中作為平均值約為6%。另外，A組的測定值與B組的測定值之間沒有顯
著差異。從這些結果可知，在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體或者共表達抗原蛋白質和hCD40Lm的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強的情況下，細胞免疫被激活。另外，使此時的痘苗病毒載體為共表達抗原蛋白質和CD40Lm的病毒載體時，未見細胞免疫激活的增強效果。(5)酶聯免疫吸附實驗在本實施例(3)採集的血清中，對於A組和B組的血清通過實施例4 (4)中記載的方法進行酶聯免疫吸附實驗。另外，對於得到的結果，求得各組的平均值。其結果示於圖7左圖。如圖7左圖所示，A組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.2，在1/2700約為1.4。另一方面，B組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.3，在1/2700約為1.95。因此，在A組和B組的任一個中，均確認到抗env抗體的結合活性。另外，確認到與A組相比較，B組的抗env抗體的結合活性大。(6)TZM_bI 實驗對於在本實施例(3)中採集的各組血清，按照已有報導(J.Vrol.，第79卷，第10108-10125頁，2005年)進行TZM-bl實驗，測定血清中含有的抗env抗體的中和活性。具體的，首先，在IOOmm培養皿中培養至80%匯合的293T細胞中，轉染pCAGGS_SF162env3.3 μ g以及攜帶env基因缺失的HIV-1基因組的質粒pSG3_ Λ Env6.6 μ g並培養48小時後，回收上清，從而得到含有被env的包膜覆蓋的假型病毒的假型病毒液。使該病毒液通過0.45 μ m濾器，在？80°C保存。接著，在96孔板上培養的TZM-bl細胞中，加入將假型病毒液5倍系列稀釋的液體，培養48小時後,通過用BrightGlo reagent (普洛麥格公司)測定突光素酶的發光,求得假型病毒液的TCID5tl。然後，製備在本實施例(3)中採集的血清的稀釋系列，分別加入200TCID5(i的假型病毒液，從而各製備100 μ I混合液，在37°C溫育I小時。隨後，在96孔板上培養至80%匯合的TZM-bl細胞中加入製備的混合液，培養72小時後，通過用BrightGlo reagent (普洛麥格公司)測定螢光素酶的發光，求得假型病毒對TZM-bl細胞的感染被50%阻斷的血清的稀釋倍數(ID5tlX其結果示於圖7右圖。如圖7右圖所示，ID5tl在A組平均值為300，與此相對，在B組平均值為8022，確認到B組的抗env抗體的中和活性明顯比A組大。

從這些結果可知，在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體或者共表達抗原蛋白質和hCD40Lm的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強的情況下，體液免疫被激活。另外可知，使此時的痘苗病毒載體共表達抗原蛋白質和CD40Lm時，可增強體液免疫的激活。免疫激活效果的確認:初免:DNA-env/加強:痘苗病毒載體的病毒載體混合接種( I)初免對於9隻C57BL/6小鼠，通過實施例2(1)中記載的方法進行初免。(2)加強將本實施例(I)的小鼠分為3組，每組各3隻，作為A組、B組以及對照組。另外，將實施例1 Cl) [1-2]〈1-2-6〉的 m8A-〈低 pro〉_hCD40Lm、實施例1 (I) [1-4]〈1-4-5〉的m8 Δ -〈高 pro〉-h OMOLm 以及實施例1 (I) [1-1]〈1-1-2〉的 ηι8Δ-〈高 pro〉，分別在 PBS中溶解以成為 I X 109PFU/mL,製備 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液、m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm溶液以及m8A-〈高pro〉溶液。在A組、B組以及對照組小鼠中，將本實施例(2)中製備的m8 Δ -〈低pro〉-hCD40Lm溶液、m8A-〈高pro〉-hCD40Lm溶液和m8A-〈高pro〉溶液、以及實施例4 (1)的1118厶-〈高pro)-env溶液按照如下組合而混合的混合物、各10 μ L (I X IO7PFU)分別用雙叉針刺種(力口強)後，詞養2周。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液B 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm 溶液對照組:m8 Δ -〈高pro〉-env溶液和m8 Δ -〈高pro〉溶液
(3) T細胞和血清的採集根據常規方法從本實施例(2)的各組小鼠採集血清，通過實施例2 (3)中記載的方法採集T細胞。(4)細胞內細胞因子染色以及使用FACS對染色細胞數的測定對於在本實施例(3)中採集的T細胞，通過實施例2 (4)和(5)中記載的方法進行細胞內細胞因子染色以及使用FACS對染色細胞數的測定。其結果示於圖8。如圖8所示，⑶8陽性IFN- Y產生細胞在A組中作為平均值約為7%、B組中作為平均值約為3.5%、對照組中作為平均值約為3.2%。從這些結果可知，在通過用表達抗原蛋白質的質粒初免後用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體加強而使細胞免疫激活的情況下，如果在加強中混合表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體和表達CD40Lm的痘苗病毒載體而接種，則細胞免疫的激活增強。進一步可知，該細胞免疫激活的增強效果，在CD40Lm表達量較高時不能獲得，在CD40Lm表達量較低時能夠獲得。(5)酶聯免疫吸附實驗對於在本實施例(3)中採集的血清，通過實施例4 (4)中記載的方法進行酶聯免疫吸附實驗。A組血清的結果中代表性的結果示於圖9。如圖9的代表性的結果所示，A組的吸光度在任一個稀釋倍率均為0，未確認到抗env抗體的結合活性。另外,在B組以及對照組也未確認到抗env抗體的結合活性(未圖示)。(6) TZM-bl 實驗 對於在本實施例(3)中採集的血清，通過實施例5 (6)中記載的方法進行TZM-bl實驗時，在A組、B組以及對照組的任一個的血清中，均未確認到抗env抗體的中和活性(未圖示)。從這些結果可知，在用表達抗原蛋白質的質粒初免後，將表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體和表達⑶40Lm的痘苗病毒載體混合而加強的情況下，體液免疫未被激活。免疫激活效果的確認:初免:痘苗病毒載體/加強:仙臺病毒載體的病毒載體混合接種( I)初免將15隻C57BL/6小鼠分為3組，每組各5隻，分別作為對照組、A組和B組。在A組和B組小鼠中，將實施例4 (1)的1118八-〈高pro〉-env溶液、實施例6 (2)的m8A-〈高pro)溶液以及實施例6 (2)的ηι8Δ-〈低pro〉_h⑶40Lm溶液按照如下組合而混合的混合物各10 μ L (IX IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)後，飼養8周。這裡，對照組小鼠沒有接種任何物質。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液B 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉溶液(2)加強在本實施例(I)的A組和B組小鼠中，將實施例4 (2)的SeV-env溶液各10 μ L(4Χ IO7CFU)分別經鼻注射(加強)後，飼養2周。(3) T細胞以及血清的採集從本實施例(I)的各組小鼠採集血清，通過實施例2 (3)中記載的方法採集T細胞。(4)細胞內細胞因子染色和使用FACS對染色細胞數的測定對於在本實施例(3)中採集的T細胞，通過實施例2 (4)和(5)中記載的方法進行細胞內細胞因子染色和使用FACS對染色細胞數的測定。另外，對於測定的結果，在A組和B組之間進行檢驗。其結果示於圖10。如圖10所示，⑶8陽性IFN- Y產生細胞在A組中作為平均值約為12%，在B組中作為平均值約為6%，另一方面，對照組中未檢出。另外，確認到A組的測定值與B組的測定值相比明顯大。從這些結果可知，在通過用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強而使細胞免疫激活的情況下，如果在初免中將表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體和表達CD40Lm的痘苗病毒載體混合而接種，則細胞免疫的激活增強。(5)酶聯免疫吸附實驗在本實施例(3)採集的血清中，對於A組和B組的血清，通過實施例4 (4)中記載的方法進行酶聯免疫吸附實驗。另外，對於得到的結果，求得各組的平均值。其結果示於圖11左圖。如圖11左圖所示，A組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.25，在1/2700約為1.6。另一方面，B組的吸光度在1/100約為2.3，在1/300約為2.1，在1/900約為1.6，在1/2700約為0.75。因此，確認到A組比B組的抗env抗體的結合活性大。(6) TZM-bl 實驗在本實施例(3)採集的血清中，對於A組和B組的血清，通過實施例5 (6)中記載的方法進行TZM-bl實驗。另外，對於得到的結果，求得各組的平均值。其結果示於圖11右圖。如圖11右圖所示，ID5tl在A組中作為平均值為1542.6，與此相對，在B組中作為平均值為1581.6，確認到A組和B組的抗env抗體的中和活性大致相同。從這些結果可知，在通過用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強而使體液免疫激活的情況下，如果在初免中將表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體和表達CD40Lm的痘苗病毒載體混合而接種，則體液免疫的激活增強。免疫激活效果的確認:初免:痘苗病毒載體/加強:仙臺病毒載體的共表達載體接種以及病毒載體混合接種( I)初免將25隻C57BL/6小鼠分為5組，每組各5隻，分別作為對照組、A組、B組、C組以及D組。在A組、B組、C組以及D組小鼠中，將實施例4 (1)的1118八-〈高pro〉-env溶液、實施例6 (2)的ηι8Δ-〈高pro〉溶液、實施例3 (1)的1118厶-〈高pro〉-env-hOMOLm溶液以及實施例6 (2)的m8 Δ -〈低pro〉_h⑶40Lm溶液按照如下組合混合的混合物各10 μ L(I X IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)後，飼養8周。這裡，對照組小鼠沒有接種任何物質。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40LmB 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉C 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env_hCD4 0Lm 溶液D 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液
(2)加強在本實施例(I) [1-1]的A組、B組、C組以及D組小鼠中，將實施例4(2)的SeV-env溶液各10 μ L (4X IO7CFU)分別經鼻注射(加強)後，飼養2周。(3) T細胞和血清的採集從本實施例(1)[1_1]的各組小鼠採集血清，通過實施例2 (3)中記載的方法採集T細胞。(4)細胞內細胞因子染色和使用FACS對染色細胞數的測定將本實施例[1-3]採集的各組的T細胞各自分為2組。對於其中一組，用作為標記抗體的 APC 標記的抗小鼠 IFN-Y (APC-labeled ant1-mouse IFN-Y , eBioscience 公司)以及V450大鼠抗小鼠CD4 (V450Rat ant1-mouse CD4，日本BD公司)通過實施例2 (4)中記載的方法將⑶4陽性IFN-Y產生細胞染色，對於另一組，用作為標記抗體的PE-Cy7大鼠抗小鼠IL-4 (PE-Cy7Rat ant1-mouse IL-4，日本BD公司)以及V450大鼠抗小鼠CD4(V450Rat ant1-mouse CD4，日本BD公司)通過實施例2 (4)中記載的方法將CD4陽性IL-4產生細胞染色。接著，通過實施例2 (5)中記載的方法，用FACS進行染色細胞數的測定。這裡，對於⑶4陽性IFN- Y產生細胞的測定結果在A組和B組、以及C組和D組之間，對於⑶4陽性IL-4產生細胞的測定結果在各組與對照組之間，分別進行檢驗。其結果示於圖12。如圖12左圖所示，⑶4陽性IFN-Y產生細胞數在對照組中未檢出，另一方面，檢出在A組中作為平均值約 0.2%，在B組中作為平均值約0.4%，在C組中作為平均值約0.22%，在D組中作為平均值約0.35%。另外，如圖12右圖所示，⑶4陽性IL-4產生細胞的平均螢光強度在A組中作為平均值約為23，在B組中作為平均值約為19，在C組中作為平均值約為29，在D組中作為平均值約為17，在對照組中作為平均值約為10。從這些結果可知，在用表達抗原蛋白質的痘苗病毒載體初免後用表達抗原蛋白質的仙臺病毒載體加強的情況下，如果在初免中通過混合接種或者共表達而表達CD40Lm時，與不表達⑶40Lm時相比，⑶4陽性IFN- Y產生細胞減少，而⑶4陽性IL-4產生細胞有所增加。
權利要求
1.初免-加強疫苗用病毒載體，其包含下述(a)和(b)， (a)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體， (b)可表達地攜帶編碼具有所述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體。
2.根據權利要求1所述的初免-加強疫苗用病毒載體，含有下述(C)， (C)可表達地攜帶編碼⑶40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。
3.根據權利要求1所述的初免-加強疫苗用病毒載體，可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體為可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的初免-加強疫苗用病毒載體，初免用病毒載體為(a)或者(a)和(C)，並且加強用病毒載體為(b)。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的初免-加強疫苗用病毒載體，痘苗病毒載體為痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lcl6mO株，並且為在B5R基因中I個或者多個核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而不產生具有正常功能的B5R基因產物的痘苗病毒載體。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的初免-加強疫苗用病毒載體，具有免疫原性的多肽為針對人類的病原微生物的抗原蛋白質或其部分肽、或者人類腫瘤抗原蛋白質或其部分肽。
7.根據權利要求6所述的初免-加強疫苗用病毒載體，病原微生物為從由人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴重急性呼吸症候群病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、伊波拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質炎病毒、聖路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結核桿菌、白喉桿菌、傷寒沙門氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風菌、分支桿菌以及瘧原蟲組成的組中選擇的病原微生物。
全文摘要
本發明提供一種病毒載體，所述病毒載體能夠使細胞免疫和體液免疫兩方激活，能夠用於對通常難以使用疫苗療法的由病原微生物引起的傳染病、惡性腫瘤有效的初免-加強疫苗的製造。所述病毒載體為包含下述(a)和(b)的初免-加強疫苗用病毒載體，(a)可表達地攜帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，(b)可表達地攜帶編碼具有所述免疫原性的多肽的基因的仙臺病毒載體。
文檔編號C12N15/09GK103189506SQ20118005084
公開日2013年7月3日 申請日期2011年10月21日 優先權日2010年10月22日
發明者志田壽利, 祖父江友好, 加藤和則, 井上誠, 長谷川護 申請人:國立大學法人北海道大學, 北海道公立大學法人札幌醫科大學, 生物載體株式會社