一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶及其製備方法

2023-05-25 05:31:31

專利名稱：：一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶及其製備方法。
背景技術：
：穀胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,EC1.11.1.9，簡稱GPx)是生物機體組織中存在的三種重要的抗氧化酶之一，也是一種重要的含硒酶，硒是該酶活性中心的構成成分。它可以消除機體內的過氧化氫及脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，是生物體內重要的活性氧自由基清除劑，它以硒代半胱氨酸(Sec)的形式發揮作用，以穀胱甘肽(GSH)為還原劑分解體內的脂質過氧化物，因而可防止細胞膜和其它生物組織免受過氧化作用的損傷；它與體內的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)一起構成了機體的抗氧化防禦體系。醫學研究表明它與人類許多疾病有關，對腫瘤、心血管疾病、老年性疾病、不孕症等多種疾病有著良好的預防和治療作用，是一種有廣泛應用和市場前景的醫藥用酶。但該酶在常溫條件下其巰基易氧化而使酶失活、半衰期非常短、穩定性差等特性限制了該酶的以常態形式使用的實用性。對該類酶進行化學修飾以提高其物理、化學和生物學穩定性是成功開發並推出市場的關鍵性技術。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種酶活性高、穩定性強的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。本發明的另一個目的在於提供製備該修飾性豬穀胱甘肽過氧化物酶的方法。本發明公開了一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶，由穀胱甘肽過氧化物酶的氨基與活化的單甲氧基聚乙二醇連接，其結構式為formulaseeoriginaldocumentpage3其中GPX表示穀胱甘肽過氧化酶。本發明同時公開了該修飾性穀胱甘肽過氧化物酶的製備方法，採用活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇作為修飾劑，與穀胱甘肽過氧化物酶反應，將單鏈單甲氧基聚乙二醇(mPEGD通過游離氯原子與穀胱甘肽過氧化物酶的氨基發生反應，使mPEh與穀胱甘肽過氧化物酶連接。反應式為穀胱甘肽過mPEGi修飾穀胱甘氧化物酶mPEGi肽過氧化物酶本發明同時也公開了該修飾性穀胱甘肽過氧化物酶的製備方法，包括以下步驟採用活化的單鏈單甲氧基聚二醇作為修飾劑，與穀胱甘肽過氧化物酶在4-37°C、pH7.0-10.0下反應，其中單鏈單甲氧基聚二醇與穀胱甘肽過氧化物酶的質量比為20-1001。反應15-60min後，加入終止劑GSH結束反應，超濾去除終止劑，獲得所述的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。其中，優選的方案為單鏈單甲氧基聚二醇與穀胱甘肽過氧化物酶的質量比為801；反應條件為溫度15°C、pH9.0、時間45min。其中的活化的單鏈單甲氧基聚二醇，可以通過以下方法獲得取5.5g二次重結晶的三聚氰氯(先用無水苯重結晶兩次)溶解於400mL含10g無水碳酸鈉的無水苯中，加入50gmPEG-5000,室溫下攪拌過夜，過濾，取濾液約400mL攪拌下緩慢加入600mL乙醚，沉澱出白色產物後繼續攪拌20min，抽濾，沉澱再用400mL無水苯溶解，如此沉澱、溶解重複多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止。將活化的mPEh置於真空乾燥器中抽乾，得到白色粉末，即獲得活化mPEGpformulaseeoriginaldocumentpage4與現有技術相比，本發明具有以下有益效果(1)本發明首次採用單鏈單甲氧基聚乙二醇(mPEG》修飾穀胱甘肽過氧化物酶，經過測定殘餘氨基修飾率(DTNB法)鑑定，其氨基修飾率為44.55%;由於氨基修飾率達40%以上時進入體內就可完全消除異體蛋白的抗原抗體反應，因此本發明的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶具有消除酶蛋白抗原抗體反應的優點。(2)本發明所獲得的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶，酶活力保持率高達104.66%，即修飾酶活力比天然酶的活力更高。(3)酶的pH穩定性與熱穩定性提高。與天然酶相比，修飾酶的pH穩定性要寬一些，在pH4.0和pH10.0的條件下放置1.5h，天然酶的相對活力分別為0%和38.83%，而修飾酶的相對活力分別為21.08%和68.79%；熱穩定性也比天然酶高一些，在50°C時未修飾GPx的相對活力為0%，而修飾GPx保持了37%的活力。(4)修飾酶的半衰期比天然酶延長了。修飾酶的半衰期為180.77h，天然酶的半衰期為76.28h，修飾酶的半衰期是原酶的2.37倍(5)抗抑制劑的能力提高。天然酶經胰蛋白酶處理150min後活力回收為21.24%，修飾酶為89.27%，處理450min後天然酶完全無活力，修飾活力回收仍然達64.43%。(6)修飾酶的抗衰老能力比天然酶效果好。具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例11.活化mPEGi的獲取取5.5g二次重結晶的三聚氰氯(先用無水苯重結晶兩次)溶解於400mL含10g無水碳酸鈉的無水苯中，加入50gmPEG-5000,室溫下攪拌過夜，過濾，取濾液約400mL攪拌下緩慢加入600mL乙醚，沉澱出白色產物後繼續攪拌20min，抽濾，沉澱再用400mL無水苯溶解，如此沉澱、溶解重複多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止。將活化的mPEG置於真空乾燥器中抽乾，得到白色粉末，即獲得活化mPEh。2.穀胱甘肽過氧化物酶的修飾在反應溫度15°C，pH9.0，反應物配比為1毫克酶加入0.08克修飾劑進行反應，45min後加入GSH作為GPx修飾反應的終止劑結束反應，超濾去除終止劑後獲得修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。實施例21.活化mPEGi的獲取如實施例12.穀胱甘肽過氧化物酶的修飾在反應溫度36°C，pH7.0，反應物配比為1毫克酶加入0.04克修飾劑進行反應，30min後加入GSH作為GPx修飾反應的終止劑結束反應，超濾去除終止劑後獲得修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。實施例31.活化mPEGi的獲取如實施例12.穀胱甘肽過氧化物酶的修飾在反應溫度5°C，pH10.0，反應物配比為1毫克酶加入0.02克修飾劑進行反應，60min後加入GSH作為GPx修飾反應的終止劑結束反應，超濾去除終止劑後獲得修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。實施例41.活化mPEGi的獲取如實施例12.穀胱甘肽過氧化物酶的修飾在反應溫度37°C，pH9，反應物配比為1毫克酶加入0.95克修飾劑進行反應，45min後加入GSH作為GPx修飾反應的終止劑結束反應，超濾去除終止劑後獲得修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。實施例5修飾性穀胱甘肽過氧化物酶性能的評價對實施例1所製備的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶進行評價，其氨基修飾率為44.55%，酶活力保持率為104.66%;修飾酶的最適反應pH值(7.0)和反應溫度(37°C)未發生改變；PH穩定性比天然酶寬1個pH值，耐熱性比天然酶高5°C;半衰期是天然酶的2.37倍；抗胰蛋白酶的能力大大提高，用胰蛋白酶處理450min後天然酶完全無活力，而修飾酶活力仍為最初時的64.43%。實施例6以致衰老小鼠為模型研究其抗衰老能力，評價修飾酶的抗衰老效果。D-半乳糖致衰老小鼠為模型動物，通過小鼠腹腔注射給藥，研究修飾前後GPx對小鼠血清和肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、GPx和丙二醛(MDA)等生化指標含量。方法如下用D-半乳糖致小鼠衰老，即使小鼠血清和肝臟S0D、GPx活力降低，MDA含量上升。同時用天然酶和修飾酶治療，其處理分別如表1所示。天然酶60U/mL，比活力60U/mgprotein；修飾酶活力60U/mL，氨基修飾率40%。表1試驗動物的分組及處理tableseeoriginaldocumentpage6實驗結果不同酶處理對血清和肝臟SOD活力、對血清和肝臟GPx活力、對血清和肝臟MDA活力的影響分別如表2、表3、表4所示。表2不同處理對小鼠血清和肝臟SOD活力的影響tableseeoriginaldocumentpage7上述結果表明，修飾酶抗衰老的效果比天然酶效果好。a權利要求一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶，其特徵在於穀胱甘肽過氧化物酶的氨基與活化的單甲氧基聚乙二醇連接，其結構式為其中GPx表示穀胱甘肽過氧化酶。FSA00000130542600011.tif2.一種如權利要求1所述的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶的製備方法，其特徵在於採用活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇作為修飾劑，與穀胱甘肽過氧化物酶反應，反應式為其中GPx表示穀胱甘肽過氧化酶。3.—種如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於反應結束時還再加入終止劑穀胱甘肽終止反應。4.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇與穀胱甘肽過氧化物酶的質量比為20-1001。5.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇與穀胱甘肽過氧化物酶的質量比為801。6.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的反應條件為溫度4-37°C、pH7.0-10.0。7.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的加入終止劑的時間為反應15_60min後。8.如權利要求6或7所述的製備方法，其特徵在於所述的反應條件為溫度15°C、pH9.0；加入終止劑的時間為反應45min後。9.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的終止劑為穀胱甘肽，按穀胱甘肽與單鏈單甲氧基聚乙二醇的摩爾比為11的添加量加入。10.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇是通過將單鏈單甲氧基聚乙二醇與三聚氰氯反應，並進一步純化乾燥獲得。全文摘要本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種修飾性穀胱甘肽過氧化物酶及其製備方法。該修飾性穀胱甘肽過氧化物酶是將單鏈單甲氧基聚乙二醇(mPEG1)通過游離氯原子與穀胱甘肽過氧化物酶的氨基反應，將mPEG1連接到穀胱甘肽過氧化物酶上。通過採用活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇作為修飾劑，與穀胱甘肽過氧化物酶在4-37℃、pH7.0-10.0反應，其中單鏈單甲氧基聚乙二醇與穀胱甘肽過氧化物酶的質量比為20-100∶1，反應15-60min後，按修飾劑與終止劑穀胱甘肽(GSH)為1∶1的比例加入GSH終止反應，然後用3萬超濾膜超濾去除終止劑，獲得所述的修飾性穀胱甘肽過氧化物酶。該修飾性穀胱甘肽過氧化物酶其氨基修飾率控制在40-45％，酶活力保持率超過100％。文檔編號C12N9/96GK101831413SQ20101017906公開日2010年9月15日申請日期2010年5月14日優先權日2010年5月14日發明者馮定遠,王林川,陳芳豔申請人:華南農業大學