一種液態纖維素酶的製備方法
2023-05-25 22:59:56
專利名稱：一種液態纖維素酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及在生物發酵技術領域，特別是涉及一種液體纖維素酶的製備方法。
背景技術：
纖維素酶(cellulase)是指能降解纖維素3 _1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維 二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協同作用的多組分酶系。纖維素酶在我國每年有幾十 億元的市場銷售額，在紡織、酒精、飼料等工業具有廣泛的應用，但目前國內90%以上的市 場份額被國外產品所佔領，因此開展纖維素酶發酵技術的研究，降低生產成本具有很重要 的現實意義。纖維素酶的生產和其它酶製劑一樣，主要有固體發酵和液體深層發酵兩種，固體 發酵法的投資少，工藝簡單，產品價格低廉，但是固體發酵法的自動化程度低，勞動強度大， 產品質量不穩定。因此，隨著液體發酵酶工藝的發展及菌種性能的提高，採用液體發酵法生 產纖維酶素是必然趨勢。現有的液體發酵法生產纖維酶素主要採用機械攪拌罐或氣升式發酵罐。當使用 機械攪拌罐發酵生產纖維素酶時，在綠色木黴的呼吸高峰期，溶氧急劇下降，經常會跌倒零 以下，因此必須提高溶氧，在發酵過程中提高發酵液中溶氧的方法主要是提高通氣量、增加 罐壓、提高攪拌轉速。為了提高綠色木黴發酵生產纖維素酶呼吸高峰期醪液中的溶氧水平， 可以分別提高通氣量、增加罐壓、提高攪拌轉速。但是實際應用中發現，通氣量的提高達到 1 1.5已是上限，而且增加通氣量對溶氧的提高有限。提高罐壓到0.8kg/cm3也已是普通 發酵罐的承壓的上限。發酵過程中通過攪拌可以促進混合、傳熱與傳質，對醪液中溶氧水平 提高也較大，但攪拌轉速的提高對絲狀菌的菌體產生剪切作用，從而影響菌的生長、形態和 產物的合成。發酵過程中可以很明顯的發現，當轉速提高到一定時，菌絲體明顯被打斷，醪 液中出現大量的菌絲體碎片。因此，僅僅通過上述方式，很難滿足綠色木黴在呼吸高峰對溶 氧的需求。如果直接用氣升式發酵罐生產纖維素酶時，由於發酵醪液中有純纖維素、微晶纖 維素和碳酸鈣等不溶性物質，在發酵開始階段，物料混合效果不好。尤其在發酵的8 20 小時，由於綠色木黴菌絲體的快速增長，發酵醪液出現粘稠現象，氣升式發酵罐無法完成物 料的充分混合，菌絲出現缺氧狀態，過早出現菌絲結節，大大降低液體纖維素酶的產量。因此，有必要提出一種高效製備纖維素酶的方法。
發明內容
本發明目的是針對纖維素酶現有發酵技術的不足，提供一種操作簡便，成本低，酶 活力穩定的利用綠色木黴大量製備纖維素酶的方法。綠色木黴發酵生產纖維素酶過程主要分為三個階段一、綠色木黴利用培養基中 較易利用的碳源，菌體細胞快速增長，菌絲長，蔓延生長，呼吸強度明顯，溶氧消耗很快，此 時不分泌或少量分泌纖維素酶；二、綠色木黴利用培養基中較難利用碳源，菌體細胞濃度基本保持穩定，菌絲長，細胞中有不均勻顆粒，此時大量分泌纖維素酶；三、培養基中的碳源和 氮源基本被消耗，菌絲體變粗，出現結節，開始衰老與死亡，分泌纖維素酶速率明顯下降。為保證綠色木黴能夠以其最大能力生產液態纖維素酶，就有必要根據其發酵特 點，控制發酵過程中的各參數，促進綠色木黴的發酵進程，因此提出本發明所述的製備纖維 素酶的方法。本發明所述的製備纖維素酶的方法，是利用機械攪拌罐和氣升式發酵罐聯合培養 綠色木黴。具體的說，本發明所述的製備纖維素酶的方法包括下述步驟(1)先將綠色木黴接種到裝有發酵培養基的機械攪拌罐中，保溫培養；(2)當機械攪拌罐中發酵液中葡萄糖消耗至含量小於0. 01 %，且菌絲體重達到 0. 8g/100ml，轉入氣升式發酵罐進行發酵培養，整個發酵周期為90 100小時。機械攪拌罐的參數控制也可以根據具體菌種的需要進行選擇，一般可控制攪拌轉 速為100 260r/min，風量為1 0. 2 0. 5vvm,罐壓為0. 02 0. 05Mpa ；優選攪拌轉速 為 150 230r/min，風量為 1 0. 3 0. 4vvm,罐壓為 0. 03Mpa。氣升式發酵罐的參數控制也可以根據具體菌種的需要進行選擇，一般可控制罐面 壓差為0. 025 0. 045Mpa,通風為0. 7 1. Ovvm,罐壓為0. 04 0. 06Mpa ；優選的罐面壓 差為0. 04Mpa,通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。機械攪拌罐中所述發酵培養基的裝液量為機械攪拌罐容積的70% 90%。綠色木黴的接種量為發酵培養基總體積的5% 12%。發酵過程中培養溫度為28_32°C，優選30°C。本發明所述的方法中，步驟1)和2)之間，還包括步驟1』)培養期間每隔3 5小 時取樣測葡萄糖含量、測菌絲體重、鏡檢；步驟2)之後，還包括步驟2』 )培養期間每隔6 10小時取樣測纖維素酶含量。其中，纖維素酶的測定方法為用0. lg濾紙作為底物，加0. 9mLpH4. 8檸檬酸緩衝 液，再加0. lmL粗酶離心上清液，50°C恆溫水浴搖床反應30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測 定生成的還原糖，以葡萄糖為標準糖，以每分鐘生成1 P mol還原糖所需的酶量定義成一個 纖維素酶酶活力單位(IU)。液體發酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩衝液為 21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。葡萄糖測定方法為採用DNS法，以葡萄糖為標準。菌絲體重的測定方法為取100ml發酵液，5000轉/分鐘離心10分鐘，對離心下 的固體稱溼重即為每100ml中菌絲體溼重。所述綠色木黴可選擇本領域常用的製備液體纖維素酶的菌株，優選保藏編號為 CICC13052的綠色木黴，根據上述條件，利用該菌株製備的纖維素酶的產量可達13 36IU/ ml。所述發酵培養基是綠色木黴發酵生產液體纖維素酶常用的培養基各成分含量為 微晶纖維素3 5 %、玉米漿1 2 %、葡萄糖1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2%和磷酸氫二鉀0. 05 0. 1%，優選的發酵培養基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、 葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。所述步驟2)中還包括發酵70-80小時後流加新鮮的發酵培養基。
所述新鮮的發酵培養基的成分可與發酵培養基相同或不同，優選以下成分的新 鮮培養基微晶纖維素3-5%、玉米漿1-3%、豆粕粉1_2%、硫酸銨0. 1_1%、磷酸氫二鉀 0. 1-0. 5% ；更優選以下成分的新鮮培養基微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、硫酸 銨0.5%、磷酸氫二鉀0.2%。將綠色木黴種子接種到裝有含纖維誘導物微晶纖維素和營養鹽的培養基的機械 攪拌罐中。當葡萄糖消耗完畢，菌濃達到標準後，轉入氣升式發酵罐進行發酵培養。所述方法中，在步驟1)之前，還包括以下步驟斜面培養在無菌操作條件下，將綠色木黴原種接入PDA試管斜面培養基中，30°C 培養5 7天；種子培養在無菌條件下，將斜面菌種接入三角瓶中，置搖瓶機上振蕩28 32°C 培養20 24小時；然後將搖瓶種子轉接種子罐繼續28 32°C培養20 24小時；種子培 養基成分為葡萄糖1 2 %，玉米漿1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2 %，磷酸 二氫鉀0. 1 0.2%，硫酸鎂0. 05 0. ；三角瓶與種子罐培養基成分相同。優選的種子培養基成分為葡萄糖1 %，玉米漿1 %、尿素0. 1 %、硫酸銨0. 2%，磷酸 二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。本發明所述的利用綠色木黴生產液體纖維素酶的方法，通過機械攪拌罐和氣升 式發酵罐聯用，既可以促進綠色木黴菌體細胞生長，同時又避免了發酵過程中當溶氧不足 時提高攪拌轉速對菌絲體的剪切力，可以高效率的製備纖維素酶，與只用機械攪拌罐或只 用氣升式發酵罐生產纖維素酶相比，用這種方法生產纖維素酶可以使濾紙酶活提高50 150%,特別適合在工業生產中推廣應用。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。如無特別指明，實施例 中採用的綠色木黴購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CICC13052。實施例1作為對照例，只採用機械攪拌發酵罐製備液體纖維素酶。用綠色木黴(CICC13052)在裝液量為35m3的50m3機械攪拌發酵罐中發酵生產纖 維素酶，攪拌轉速為150r/min，通風為1 0. 5vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發酵培養基中含有 微晶纖維素3%、玉米漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。發酵過程中溫度控制在30°C，發酵周期為94小時。發酵每8小時測樣一次，每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘葡萄 糖。結果表明，使用機械攪拌罐產纖維素酶的濾紙酶活力最高為15.42IU/ml。發酵終 體積為33m3。實施例2作為對照例，只採用氣升式發酵罐製備液體纖維素酶。用綠色木黴在裝液量為35m3的50m3氣升式發酵罐中發酵生產纖維素酶，罐面壓差 為0. 04Mpa，通風為0. 8vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發酵培養基中含有微晶纖維素3%、玉米 漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。
發酵過程中溫度控制在30°C，發酵周期為92小時。發酵每8小時測樣一次，每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘糖。結果表明，使用微晶纖維素濾紙酶活力最高為13. 24IU/ml。發酵終體積為33m3。實施例3將綠色木黴(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為35m3的50m3機械攪拌發酵 罐中保溫培養，攪拌轉速為150r/min，通風為1 0. 5vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發酵培養 基中含有微晶纖維素3%、玉米漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發酵每4小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小於0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml後轉入氣升式發酵 罐進行發酵培養，罐面壓差為0. 04Mpa,通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。發酵每8小時測樣 一次，每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力。發酵過程中溫度控制在30°C，整個發酵周期為94小時。結果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發酵罐耦合發酵，纖維素酶濾紙酶活力最高 為25. 30IU/ml。發酵終體積為33m3。實施例4將綠色木黴(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為30m3的50m3機械攪拌發酵 罐中保溫培養，攪拌轉速為220r/min，通風為1 0. 3vvm，罐壓為0. 02Mpa。其中發酵培養 基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發酵每4小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小於0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml後轉入氣升式發酵 罐進行發酵培養，罐面壓差為0. 025Mpa，通風為0. 96vvm，罐壓為0. 04Mpa。發酵每8小時測樣一次，每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力。發酵70 小時後流加新鮮培養基。流加的培養基中成分為微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、 硫酸銨0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%。每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘糖。發酵過程中溫度控制在30°C，整個發酵周期為96小時。結果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發酵罐耦合流加發酵生產纖維素酶，濾紙酶 活力最高為35. 21IU/ml。發酵終體積為33m3。實施例5將綠色木黴(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為30m3的50m3機械攪拌發酵 罐中保溫培養，攪拌轉速為260r/min，通風為1 0. 2vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發酵培養 基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發酵每5小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小於0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml後轉入氣升式發酵 罐進行發酵培養，罐面壓差為0. 045Mpa，通風為0. 7vvm，罐壓為0. 06Mpa。發酵每10小時測樣一次，每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力。發酵75 小時後流加新鮮培養基。流加的培養基中成分為微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、硫酸銨0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%。每次放出的發酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘糖。發酵過程中溫度控制在30°C，整個發酵周期為100小時。結果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發酵罐耦合流加發酵生產纖維素酶，濾紙酶 活力最高為34.253U/ml。發酵終體積為33m3。
權利要求
一種利用綠色木黴製備纖維素酶的方法，其特徵在於，是利用機械攪拌罐和氣升式發酵罐聯合培養綠色木黴。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括下述步驟(1)先將綠色木黴接種到裝有發酵培養基的機械攪拌罐中，保溫培養；(2)當機械攪拌罐中發酵液中葡萄糖消耗至含量小於0.01%，且菌絲體重達到 0. 8g/100ml以上，轉入氣升式發酵罐進行發酵培養，整個發酵周期為90 100小時。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述機械攪拌罐的攪拌轉速為100 260r/min,風量為 1 0. 2 0. 5vvm,罐壓為 0. 02 0. 05Mpa。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述機械攪拌罐的攪拌轉速為150 230r/ min,風量為 1 0. 3 0. 4vvm,罐壓為 0. 03Mpa。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述氣升式發酵罐的罐面壓差為 0. 025 0. 045Mpa,通風為 0. 7 1. Ovvm,罐壓為 0. 04 0. 06Mpa。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述氣升式發酵罐的罐面壓差為0.04Mpa, 通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟2)中還包括發酵70 80小時 後流加發酵培養基。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)和2)之間，還包括步驟1』)培養期 間每隔3 5小時取樣測葡萄糖含量、測菌絲體重、鏡檢；步驟2)之後，還包括步驟2』)培 養期間每隔6 10小時取樣測纖維素酶含量。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟1)之前，還包括以下步驟a)斜面培養在無菌操作條件下，將綠色木黴原種接入PDA試管斜面培養基中，30°C培 養5 7天；b)種子培養在無菌條件下，將斜面菌種接入三角瓶中，置搖瓶機上振蕩28 32°C培 養20 24小時；然後將搖瓶種子轉接種子罐繼續28 32°C培養20 24小時；種子培養 基成分為葡萄糖1 2 %，玉米漿1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2 %，磷酸二 氫鉀0. 1 0.2%，硫酸鎂0. 05 0. ；三角瓶與種子罐培養基成分相同。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述綠色木黴為菌種保藏編號CICC13052 的綠色木黴。
全文摘要
本發明涉及一種利用綠色木黴製備液體纖維素酶的方法。本發明所述的方法為首先利用機械攪拌罐進行綠色木黴菌絲體的培養，在葡萄糖消耗完畢，菌絲濃度達到標準後轉入氣升式發酵罐進行培養。本發明所述的方法通過機械攪拌罐和氣升式發酵罐聯用，既可以促進綠色木黴菌體細胞生長，同時又避免了發酵過程中當溶氧不足時提高攪拌轉速對菌絲體的剪切力，可以高效率的製備纖維素酶，與只用機械攪拌罐或只用氣升式發酵罐生產纖維素酶相比，用這種方法生產纖維素酶可以使濾紙酶活提高50～150％，特別適合在工業生產中推廣應用。
文檔編號C12R1/885GK101875926SQ20091025967
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者尚海濤, 李維理, 李榮傑, 段緒果, 穆曉玲, 符秀迪, 薛培儉 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司