一種非解乳糖鏈球菌及其應用的製作方法

2023-05-25 21:56:41

專利名稱：一種非解乳糖鏈球菌及其應用的製作方法
一種非解乳糖鏈球菌及其應用技術領域
本發明首次發現了一株非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9，該菌株的拉丁文分類命名為Streptococcus alactolyticus ,該菌株已於2010年10月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏單位簡稱<6110，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 4227。本發明涉及發酵領域，具體地，涉及一種非解乳糖鏈球菌{Streptococcusalactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 及其應用。
背景技術：
對非解乳糖鏈球菌的相關研究還較少，《伯傑氏細菌鑑定手冊》也沒有收錄非解乳糖鏈球菌，1984年由Farraw等首次發現。1984年，Farrow等人利用遺傳學分類方法將馬腸鏈球菌/牛鏈球菌複合群(Streptococcus bovis/Streptococcus equinuscomplex)劃分為6個不同的DNA群，其中，DNA群I包含馬腸鏈球菌和牛鏈球菌。馬腸鏈球菌與牛鏈球菌的全基因組和16SrDNA序列高度同源，屬於同一個種。但命名上卻難以統一，因為馬腸鏈球菌的命名較早，而在醫學中廣泛用於代表這類菌株的是牛鏈球菌。DNA群2、3、4則對應於三個不同的未命名的基因種。DNA群5命名為解糖鏈球菌，DNA群6命名為非解乳糖鏈球菌。Schlegel等人將馬腸鏈球菌/牛鏈球菌複合群進行了重新劃分，認為該複合群包括7個不同的種和亞種，即馬腸鏈球菌(S. equinus)、解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種(S. gallolyticus subsp. gallolyticus)、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種(S. gallolyticus subsp. pasteurianus)、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種(S.gallolyticus subsp . macedonicus)、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種(S. infantarius subsp.infantarius)、嬰兒鏈球菌結腸亞種(S. infantariussubsp. coli)和非解乳鏈球菌(S.alactolyticus)。而對於非解乳鏈球菌的變異種及應用則少之又少。黃芪多糖是中藥黃芪有效成分，由a-糖甙鍵連接而成的分子量為37 500左右的植物多糖，水解後可檢出葡萄糖、豐乳糖和阿拉伯糖，三種糖克分子比為1:0. 95:0. 70。黃芪多糖是一種有效免疫增強劑，並能誘導機體益生菌增殖，促進機體微生態平衡。研究報導表明黃芪多糖還具有增強細胞新陳代謝、促進血液循環、抗病毒、抗腫瘤、抗應激等保健功效，已被廣泛應用作功能性配料或直接服用。目前，國內外市場上的黃芪多糖均靠提取而來，據資料查新可知的黃芪多糖提取方法有8種，包括傳統的水提醇沉法、超微粉碎法、超聲細胞粉碎法、超濾法、微波提取法、纖維素酶法、鹼水提取法、醇鹼提取法。傳統水提醇沉法是目前最常用的提取方法，黃芪多糖的提取率平均為5. 34%左右；超微粉碎法，超微粉中黃芪多糖的提取率為4. 69%左右，而粗粉中黃芪多糖的提取率僅為2. 16%左右；超聲細胞粉碎法黃芪多糖的提取率為7. 6%左右；微波提取法黃芪多糖的提取率為6. 55%左右；超濾法提黃芪多糖得率低於水提醇沉法，但產物中多糖含量高；鹼水提取法得黃芪多糖的提取率在4. 7-19. 2%之間，穩定性較差；醇喊提取法得黃苗多糖的提取率最聞可達19. 15% ;纖維素酶法的黃苗多糖提取率聞於水提醇沉法，提取物多糖含量高，但因提取不穩定而沒有科學的提取率參考數據。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種非解乳糖鏈球菌及生產用的包含該菌株的發酵菌劑
一種非解乳糖鏈球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227。一種包含非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alactoIyti cus) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發酵菌劑，所述發酵菌劑經以下步驟製得
(1)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培養基斜面進行培養，接種量為IO3Cfu ；
(2)將步驟(I)得到的培養物接入一級或二級種子培養基，培養後得到發酵菌劑，接種量為 103cfu。具體地，所述步驟(I)的培養條件為時間16-20小時；環境厭氧發酵 』溫度:36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。具體地，所述步驟(2)的培養條件為時間16-20小時；環境厭氧發酵 』溫度:
36.5-37. 50C ;初始 pH :5. 5-5. 9。非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 在提取黃芪多糖中的應用。相關實驗
(一)非解乳糖鏈球菌alactoIyticus^LlWLVQW CGMCC No. 4227 的分離和篩選
準備6支無菌試管並編號後，分別加入9. 5mL樣品稀釋液(質量濃度0. 9%的生理鹽水)。將蘭州市上西園村16月齡健康蛋用土雞宰殺後，從盲腸中取腸內容物，準確稱取0. 50g加入編號I的試管中快速振蕩混勻。從I號試管中吸取0. 5mL液體加入2號試管,快速振蕩混勻後吸取0. 5mL加入3號試管，以此類推。將樣品稀釋成10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6 6個稀釋度。準確吸取10_4、10_5、10_6 3個稀釋度樣品50 L接入事先準備好的改良GAM瓊脂平板上，用塗布器快速塗布均勻後，放入厭氧罐。在厭氧罐中加入指示劑(美蘭試紙)、催化齊IJ (鈀粒)和產氣袋(產氣袋中主要成分為硼氫化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀)後密封培養，培養至平板長出成熟菌落。鑑定並分離純化(溶血試驗出現a溶血，生化鑑定出現苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、鹿糖和海藻糖的陽性反應；乳糖、接觸酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸鈉、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的陰性反應，並用劃線培養挑單個菌落的方法純化菌種)非解乳糖鏈球菌落，將菌落接種MRS瓊脂斜面，並接種搖瓶，初篩利用硫酸-蒽酮法測定產黃芪多糖的轉化率，根據搖瓶產黃芪多糖的轉化率水平，選擇轉化率最高者，篩選出斜面出發菌種非解乳糖鏈球菌種FGMl。採用紫外線誘變處理，通過產黃芪多糖的轉化率測定篩選得到優良的高產菌株，用於厭氧發酵黃芪多糖的生產。具體操作步驟如下菌種紫外誘變接種環挑取非解乳糖鏈球菌種FGMl斜面菌種於裝有無菌水的三角瓶中，置於磁力攪拌器振蕩均勻。將菌懸液倒入無菌平皿。打開平皿蓋，在事先預熱好的15W的紫外燈下30cm處照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s，不同照射劑量菌懸液稀釋到10'再用生理鹽水分別稀釋菌懸液到10_3，吸取稀釋好的菌懸液0. 05mL塗布5%黃芪MRS平板，每個稀釋度塗布3個平板。置於厭氧罐中培養至長出成熟菌落，統計致死率。篩選選取平板菌落進行搖瓶培養，利用硫酸-蒽酮法測定轉化率。轉化率測定以5%黃芪粉溶液為底物，加入適量菌體細胞，總體積為20mL，置於三角瓶中在最適反應溫度，轉速為120r/min的恆溫搖床中反應48h,取出於4000r/min臺式離心機離心lOmin，取上清液，乙醇沉澱，取沉澱作為測定黃芪多糖含量物。從中篩選出黃芪多糖提取率穩定在10. 06%-15. 46%的高轉化率菌株非解乳糖鏈球菌種(St印
alac tolyticus ) LZMYFGM9。
(二)利用非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alactolyticus)LlWYQW 製備生產用的包含非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 的發酵菌劑
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養基斜面進行培養時間16-20小時；環境厭氧發酵；溫度36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。MRS斜面培養基為市售商品，(生產廠家廣東環凱微生物科技有限公司；批號200904172)其成份為1%蛋白腖，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸鈉，0. 2% 磷酸氫二鉀，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐溫80，pH6. 5，3%瓊脂。(2)將上步得到的培養物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養基培養時間16-20小時；環境厭氧發酵；溫度:36. 5-37. 5°C ;初始pH :5. 5-5. 9，培養後得到發酵菌劑。種子培養基為市售商品(生產廠家廣東環凱微生物科技有限公司；批號201106293)，其成份為1%蛋白腖，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸櫞酸二銨，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸鈉，0. 2% 磷酸氫二鉀，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐溫80，pH6. 5。本發明具有以下有益效果
本發明首次提出了非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227，並將其擴大培養為生產用的發酵菌劑，該菌劑能夠用於提取黃芪多糖，具有較高的提取率。本發明實用性強，操作簡便，對發酵設備及生產條件沒有特殊要求，利用一般發酵廠的設備和生產條件即可生產，投資少、見效快、效益高，不但適合於大規模的生產還適合於小批量的生產，具有廣闊的實際應用前景。保藏信息
非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9的拉丁文分類命名為Stre/ (ococctts alactolyticus ；
保藏日期2010年10月19日；
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位簡稱=CGMCC ；
保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號；
保藏編號CGMCC No. 4227。
具體實施例方式(一)菌種實施例
非解乳糖鏈球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227，其形態為革蘭氏陽性，鏡檢為球狀或橢圓，呈鏈狀排布，不形成芽孢。生理生化特性溶血試驗出現a溶血，生化鑑定出現苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、蔗糖和海藻糖的陽性反應；乳糖、接觸酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸鈉、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的陰性反應。(二)包含非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9的發酵菌劑的製備實施例 實施例I
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養基斜面進行培養時間16小時；環境厭氧發酵；溫度
37.50C ;初始 pH :6. 4。(2)將上步得到的培養物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養基培養時間16小時；環境厭氧發酵；溫度37. 5°C ;初始pH 5. 9，培養後得到發酵菌劑。實施例2
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養基斜面進行培養時間20小時；環境厭氧發酵；溫度36. 50C ;初始 pH :6. O。(2)將上步得到的培養物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養基培養時間20小時；環境厭氧發酵；溫度36. 5°C ;初始pH 5. 5，培養後得到發酵菌劑。實施例3
(I)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接種量為IO3Cfu)接入MRS培養基斜面進行培養時間18小時；環境厭氧發酵；溫度370C ;初始 pH :6. 2。(2)將上步得到的培養物(接種量為IO3Cfu)接入一級或二級種子培養基培養時間18小時；環境厭氧發酵；溫度37°C ;初始pH 5. 7，培養後得到發酵菌劑。(三)應用實施例
非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9用於在發酵反應中提取黃芪多糖，具體如下
(I)將製備的包含非解乳糖鏈球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發酵菌劑轉入提取黃芪多糖的發酵培養基，接入量為2%(V/V體積百分數)，置於厭氧罐中，於37攝氏度、120轉/分條件下反應60小時，得到發酵產物。上述提取黃芪多糖的發酵培養基的成分及指標為乳清粉5. 158 g ;蛋白腖0. 456 g ;葡萄糖:0. 12 g ;酵母粉:0. 312 g ;無機鹽(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀):0. 194 g ；黃芪粉16 g;水200 ml，加入500ml的三角瓶，於高壓鍋中121 °C，20min滅菌，調整pH至6.9備用。(2)發酵完畢後，將發酵產物離心法將固液分離，分離後，上清部分用95%乙醇沉澱2次；沉澱部分用水煮後離心，取液體部分濃縮，再用95%乙醇沉澱2次；兩部分沉澱提取物合併後冰凍乾燥，稱得提取物的重量為2. 365克，提取率為14. 78%，黃芪多糖含量為31. 22%。最後應說明的是以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明， 儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococcys alactoIyticus) LZMYFGM9,該菌株的保藏編號為 CGMCC No. 4227。
2.一種包含非解乳糖鏈球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的發酵菌劑，所述發酵菌劑經以下步驟製得 (1)將非解乳糖鏈球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培養基斜面進行培養，接種量為IO3Cfu ； (2)將步驟(I)得到的培養物接入一級或二級種子培養基，培養後得到發酵菌劑，接種量為 103cfu。
3.根據權利要求2所述的發酵菌劑，所述步驟(I)的培養條件為時間16-20小時；環境厭氧發酵；溫度:36. 5-37. 50C ;初始pH :6. 0-6. 4。
4.根據權利要求2所述的發酵菌劑，所述步驟(2)的培養條件為時間16-20小時；環 境厭氧發酵；溫度:36. 5-37. 5 0C ;初始pH :5. 5-5. 9。
5.權利要求I 所述非解乳糖鏈球菌alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227在提取黃芪多糖中的應用。
全文摘要
本發明首次公開了一種非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9，該菌株的保藏編號為CGMCCNo.4227，同時公開了包含該菌株的發酵菌劑及其應用。本發明提出的非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9CGMCCNo.4227可用於黃芪多糖的提取，該方法具有實用性強、操作簡便、效益高的優點，具有廣闊的實際應用前景。
文檔編號C12R1/46GK102676427SQ20121014182
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者孟嘉仁, 張凱, 張景豔, 李建喜, 楊志強, 王學智 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所