含組氨酸標籤重組人內皮抑素質譜絕對定量方法
2023-05-25 17:31:56 2
專利名稱：含組氨酸標籤重組人內皮抑素質譜絕對定量方法
技術領域：
本發明涉及一種利用質譜技術來絕對定量組氨酸標籤重組人內皮抑素的方法
背景技術：
內皮抑素具有廣泛的抗腫瘤血管生成作用，其作用機制是通過抑制形成血管的內皮細胞遷移而抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷腫瘤的營養供給，從而抑制腫瘤增殖或轉移。 2005年SFDA批准了重組人血管內皮抑制素注射液(恩度),作為首個血管內皮抑制素肺癌新藥，該重組人內皮抑素含有組氨酸標籤。作為上市的藥物，重組人內皮抑素的生物樣品定量方法對於評價藥物在體內的動力學行為具有重要的意義。現有的重組人內皮抑素的定量方法主要有放射性同位素標記(Current Drug Metabolism, 2006, 7, 565-576)和酶聯免疫吸附實驗(J. Clin. Oncol. 21 (2003) 223-231)，尚無質譜定量方法。放射性同位素標記方法對操作人員和環境有特殊要求，相對於酶聯免疫吸附實驗方法質譜定量技術具有更好的選擇性和精密度。因此建立一種基於質譜的組氨酸標籤重組人內皮抑素的定量方法是十分必要的。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，建立一種含組氨酸標籤重組人內皮抑素的生物樣品提取方法並建立其質譜定量方法。本發明採取的技術方案是，首先利用含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠樹脂提取血漿中的含組氨酸標籤重組人內皮抑素，經洗脫後用胰蛋白酶水解，選取胰蛋白酶水解的重組人內皮抑素的特異性肽段，選擇的特異性肽段是該的蛋白胰酶水解後獨有的。基於高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)，利用多重反應監測(MRM)模式對特異性肽段進行分析，建立可靠，穩定的LC-MS/MS定量方法。合成一段與特異性肽段相似的合成肽段作為內標，進行定量分析建立標準曲線，從而實現特異性肽段的定量。本發明的具體技術方案如下所述。一種含組氨酸標籤重組人內皮抑素質譜定量方法，包括生物樣品的提取方法和質譜定量方法，具體步驟如下A、生物樣品製備方法(I)樣品提取柱的製備200 U L含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠(Ni2+S^harose)加入離心柱，冷凍離心機離心去除液體(500g，lmin)。加入平衡液放置於渦旋混合器(900rpm， 5min),離心衝洗兩次。預備上樣。(2)生物樣品的提取含重組蛋白血漿200 ii L加入樣品提取離心柱，4°C放置於潤旋混合器(900rpm, 20min)使蛋白與樹脂充分結合，離心(500g, Imin)去除液體,加入 400 u L平衡液置於渦旋混合器(900rpm, 5min)洗兩次,再加入400 U L雜質洗脫液置於渦旋混合器(900rpm, 5min)洗脫雜質,最後加入400 ii L蛋白洗脫液置於潤旋混合器(900rpm, 5min)洗脫目的蛋白。
(3)蛋白樣品的胰蛋白酶消化將提取後的蛋白洗脫液用離心超濾方法置換為 100 u L的消化緩衝液，再加入2 u L胰蛋白酶溶液，渦旋混合，37°C孵育12小時得酶解樣品， 加入2 ii L酶解反應終止液和2 ii L內標溶液後用於質譜定量。B、LC-MS/MS 檢測方法(1)色譜條件為Shimadzu LC(SLC_20A)型液相色譜系統；色譜柱 Agilent300SB-C8column(3. 5 u m, 1 SOmmX2. 1mm);流動相含 0. I 甲酸的水，乙臆，梯度洗脫；柱溫400C，流速0. 2mL/min ;進樣量10 u L。(2)質譜條件為API 4000型三重四極杆串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst I. 3據處理軟體；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；電噴霧電壓為 5500V ;溫度550°C ;源內氣體I :氮氣壓力40PSI ;氣體2 :氮氣壓力60PSI ;氣簾氣氮氣壓力25PSI ;掃描方式為多重反應監測；特異性肽段和內標的序列和檢測m/z以及其相應的 DP和CE值見表I ；表I肽段MRM監測值
權利要求
1.一種含組氨酸標籤重組人內皮抑素的生物樣品提取方法並建立其質譜定量方法，具體步驟如下A、生物樣品製備方法將含金屬Ni2+瓊脂糖凝膠加入離心柱，冷凍離心機離心去除液體；加入平衡液離心衝洗兩次；含重組蛋白血漿加入，4°C渦旋混勻20min，加入平衡液洗兩次，加入雜質洗脫液， 最後加入蛋白洗脫液洗脫目的蛋白；將提取後的蛋白洗脫液用離心超濾方法置換為消化緩衝液，再加入2 u L胰蛋白酶溶液，渦旋混合，37°C孵育12小時得酶解樣品，加入2 ii L酶解反應終止液和2 ii L內標溶液後用於質譜定量；B、LC-MS/MS檢測方法色譜條件為島津SLC-20A型液相色譜系統；色譜柱安捷倫300SB-C8柱，3. 5iim， 150mmX2. Imm ;流動相A :含體積百分比0. I %甲酸的水，B :乙腈，梯度洗脫；柱溫40°C，流速0. 2mL/min ;進樣量10 y L ;質譜條件為API 4000型三重四極杆串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst I. 3數據處理軟體；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；電噴霧電壓為5500V ;溫度550°C;源內氣體I :氮氣壓力40PSI ;氣體2 :氮氣壓力60PSI ;氣簾氣氮氣壓力25PSI ；DP 90V ；CE :40V ;掃描方式為多重反應監測；特異性肽段多重反應監測設定值，Ql =802. 3，Q3 651. 8 ;內標肽段多重反應監測設定值，Ql :816. 9，Q3 :666. 4。
2.根據權利要求I所述的含組氨酸標籤重組人內皮抑素質譜絕對定量方法，其特徵在於所述的平衡液是含有20mM咪唑，500mM氯化鈉的0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液， pH 7.6 ;雜質洗脫液是含有80mM咪唑，500mM氯化鈉的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH7.6 ;蛋白洗脫液是含有500mM咪唑，500mM氯化鈉的0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液， PH 7.6 ;所述的消化緩衝液，是0. IM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH 7.6 ;所述的胰蛋白酶溶液，是IOOii g/mL的胰蛋白酶溶液；所述的酶解終止液，是20%的甲酸水溶液；所述的內標溶液，是I U g/mL的合成肽段內標水溶液。
全文摘要
本發明的含組氨酸標籤重組人內皮抑素質譜絕對定量方法，屬於分析技術領域。本發明基於LC-MS/MS，利用Ni2+瓊脂糖凝膠樹脂提取血漿樣品中的含組氨酸標籤重組人內皮抑素，並利用重組人內皮抑素經胰蛋白酶水解產生的特異性肽段定量策略，以一段與特異性肽段序列相似的合成肽段為內標，實現了對血漿樣品中含組氨酸標籤重組人內皮抑素的絕對定量。本發明主要包括生物樣品製備方法、LC-MS/MS測定方法、標準曲線的製備和精密度測定。本發明方法線性關係良好、準確度高、重現性好，可用於重組人內皮抑素注射液的血藥濃度測定及藥動學研究。
文檔編號G01N30/88GK102621266SQ201210085248
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者李盈淳, 梁豔, 湯志遠, 王廣基, 肖亞楠, 郝海平 申請人:中國藥科大學