豬源附紅細胞體檢測試劑盒及方法和應用的製作方法
2023-05-25 12:02:56 3
豬源附紅細胞體檢測試劑盒及方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種豬源附紅細胞體檢測試劑盒，該試劑盒包括：針對豬源附紅細胞體G1基因設計的TaqMan探針和引物對，該探針與豬源附紅細胞體G1基因第658～793位核苷酸序列特異性結合，該引物對用於擴增豬源附紅細胞體G1基因第658～793位的核苷酸序列。本發明基於粘附蛋白G1基因的豬源附紅細胞體實時螢光定量PCR檢測試劑盒，具有特異性強、靈敏性高、重複性好的特點，可快速、準確、高通量地檢測出豬血樣品中是否存在附紅細胞體，可應用於豬的附紅細胞體病的臨床診斷、分子流行病學調查、療效評估和豬場淨化等方面，對於豬的附紅細胞體病的早期快速診斷、防控和淨化具有重要意義。
【專利說明】豬源附紅細胞體檢測試劑盒及方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於動物血液中支原體感染檢測【技術領域】，具體涉及一種豬源附紅細胞體 檢測試劑盒及方法和應用。
【背景技術】
[0002] 豬源附紅細胞體屬於不能體外培養的嗜血支原體家族中的成員，一般寄生在豬紅 細胞的表面和內部。豬源附紅細胞體感染在全世界廣泛分布，給養豬業帶來嚴重的經濟損 失。其急性感染可導致嚴重的菌血症、急性紅細胞溶血，有時可導致年輕仔豬死亡、懷孕母 豬流產等。對於慢性感染的豬只，血液中細菌含量低，臨床症狀多變，比如可能出現溫和的 黃疸、亞健康、生長速度緩慢、生產能力低下或對其他的感染性疾病易感。在強烈的免疫作 用和抗生素治療之下，豬源附紅細胞體依舊可以在宿主體內建立慢性和持續性的感染。豬 感染附紅細胞體後，極有可能在症狀消失後轉化為慢性感染。目前發現感染豬的附紅細胞 體（即豬源附紅細胞體）有兩種，包括豬附紅細胞體（Mycoplasma suis)和小附紅細胞體 (M. parvum)。由於依靠16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鑑定方法才出現不久，對 小附紅細胞體的研究尚不充分。
[0003] 儘管早在1932年，附紅細胞體病原即已在美國被確認，但其感染的流行病學數據 仍不甚明確，需要一種準確可靠的方法對豬源附紅細胞體感染進行診斷和鑑定，進而推動 對該病的防控和淨化。豬的附紅細胞體病的傳統診斷方法包括鏡檢、血清學檢測、普通PCR 擴增等。而臨床上該病的診斷主要以鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和塗片染色。由於附紅 細胞體主要寄生在紅細胞表面和血漿中，常導致紅細胞變形，但紅細胞的變形可以由多種 因素引起，如塗片技術、滲透壓的改變等，因此容易將變形紅細胞錯誤判斷為附紅細胞體， 從而導致誤診。附紅細胞體在吉姆薩染色時呈藍紫色，瑞氏染色呈淡藍色，吖啶橙染色呈淡 綠色螢光，但是吉姆薩染色和瑞氏染色需要避免變性紅細胞（嗜鹼性紅細胞、多染性紅細 胞和豪-周氏小體紅細胞）、血小板、抗凝劑和染料顆粒的幹擾；載玻片上的汙染異物和白 細胞碎片均可能引起非特異性發光，導致檢測結果出現假陽性。豬源附紅細胞體的血清學 檢測方法包括補體結合試驗（complement fixation test, CFT)、間接血凝試驗（indirect hemagglutination assay, IHA)和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等。由於附紅細胞體尚無成熟的體外培養方法，難以獲得大量原始抗原而阻 礙了血清學方法的應用。近幾年普通PCR診斷方法主要集中在擴增16S rRNA基因上，該基 因序列也是目前最常用的細菌種屬分類和鑑定的序列片段。比對多個原核生物、支原體的 16S rRNA基因發現豬源附紅細胞體與其他原核生物的相似性很高。在臨床採集的豬血樣 本可能被多種細菌汙染，採用PCR擴增16SrRNA基因極易出現假陽性。因此迫切需要建立 一種準確、特異的豬源附紅細胞體檢測方法。豬源附紅細胞體甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣蛋 白 1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-likeproteinl,簡稱 G1 蛋白）基因主 要編碼一種黏附蛋白，具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶的功能，為豬源附紅細胞體特異性基因。 對小附紅細胞體的G1基因（MPG1)進行PCR擴增分析發現其DNA序列與豬附紅細胞體G1 基因（MSG1)的核苷酸序列相似性在96. 6%?98. 2%之間，而胺基酸的相似性為98. 2%? 100%之間，兩者無顯著差異，其中小附紅細胞體G1基因在450?550位、600?900位核苷 酸序列與豬附紅細胞體G1基因對應序列高度同源。
[0004] 實時螢光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號的累積 實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定時分析的方法。與已有的診 斷方法相比，螢光定量PCR -次可同時對多個樣品進行檢測和診斷；檢測速度更加迅速，結 果判斷不需要藉助電泳分析，從而大大節省時間並降低了對環境的汙染；對檢測樣品可以 實時定量分析。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決目前豬源附紅細胞體的檢測方法假陽性率高的技術問題，提供一種 基於粘附蛋白G1基因的豬源附紅細胞體實時螢光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒特異性 強、靈敏性高，可快速、準確地檢測出豬血樣品中是否存在附紅細胞體。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0007] 在本發明的一個方面，提供了一種豬源附紅細胞體檢測試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0008] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細胞體 G1基因第658?793位核苷酸序列特異性結合；
[0009] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的引物對，該引物對用於擴增豬源附紅細胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0010] 優選的，所述探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物對的序列如SEQ ID N0 : 2 和 SEQID NO :3 所示。
[0011] 所述試劑盒還包括：含有豬附紅細胞體G1基因的陽性重組質粒標準品。
[0012] 所述試劑盒還包括：突光定量PCR反應緩衝液及聚合酶。
[0013] 所述探針的5'端標記有螢光報告基團，3'端標記有淬滅基團。
[0014] 在本發明的另一方面，還提供了一種檢測豬源附紅細胞體濃度的方法，包括以下 步驟：
[0015] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細胞體G1 基因第658?793位核苷酸序列特異性結合；
[0016] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計一對引物，該對引物用於擴增豬源附紅細胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列；
[0017] 用所述TaqMan探針及引物，對含有豬附紅細胞體G1基因的陽性重組質粒標準品 進行實時螢光定量PCR檢測，根據檢測結果繪製出標準曲線；
[0018] 用所述TaqMan探針及引物，對待測豬血樣品DNA進行實時螢光定量PCR檢測，根 據所述標準曲線分析待測豬血樣品中豬源附紅細胞體的濃度。
[0019] 所述探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物的序列如SEQ ID N0 :2和SEQ ID NO :3所示。
[0020] 所述陽性重組質粒是將豬附紅細胞體G1全長編碼基因插入PMD18-T載體而製得。
[0021] 在本發明的另一方面，還提供了上述豬源附紅細胞體檢測試劑盒在製備診斷豬的 附紅細胞體病的產品中的應用。
[0022] 本發明基於粘附蛋白G1基因的豬源附紅細胞體實時螢光定量PCR檢測試劑盒，具 有特異性強、靈敏性高、重複性好的特點，可快速、準確、高通量地檢測出豬血樣品中是否存 在附紅細胞體，可應用於豬的附紅細胞體病的臨床診斷、分子流行病學調查、療效評估和豬 場淨化等方面，對於豬的附紅細胞體病的早期快速診斷、防控和淨化具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0024] 圖1是本發明實施例1的豬源附紅細胞體G1基因 PCR擴增電泳圖；
[0025] 圖2是本發明實施例1的豬源附紅細胞體G1基因陽性質粒酶切鑑定電泳圖；
[0026] 圖3是本發明實施例3敏感性試驗擴增曲線圖；
[0027] 圖4是本發明實施例3實時螢光定量PCR標準曲線圖；
[0028] 圖5是本發明實施例4特異性試驗擴增曲線圖；
[0029] 圖6是本發明實施例6豬田間血液樣品附紅細胞體感染檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0030] 下列實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗 指南》（薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.分子克隆實驗指南， 第3版，北京：科學出版社，2002)中所述的方法進行。
[0031] 本發明根據GenBank公布的豬附紅細胞體G1基因序列（GenBank登錄號： AM407404. 1)，設計了 1對引物和TaqMan探針，研製了基於TaqMan探針檢測豬源附紅細胞 體的實時螢光定量PCR檢測試劑盒，並對現場採集的豬血液樣品進行了檢測。結果顯示，設 計的探針對檢測豬源附紅細胞體具有很高的特異性；質粒DNA的檢測閾值達100個拷貝； 檢測了 319份臨床豬血液樣品，豬源附紅細胞體的感染樣品數為45份（含34份豬附紅細 胞體和11份小附紅細胞體），兩種附紅細胞體總的感染陽性率為14. 11%，提示豬源附紅細 胞體TaqMan實時螢光定量PCR檢測試劑盒操作簡便、快速，在螢光PCR儀中反應一小時內 即可獲得準確結果，特異性強，敏感度高，重複性好，可用於豬的附紅細胞體病的臨床診斷、 分子流行病學調查、療效評估和豬場淨化等的快速定量檢測。
[0032] 本發明的豬源附紅細胞體檢測試劑盒，包括：
[0033] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的TaqMan探針，該探針與豬源附紅細胞體G1基 因第658?793位核苷酸序列特異性結合；
[0034] 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的引物對，該引物對用於擴增豬源附紅細胞體 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0035] 在下述優選實施例中，探針的序列如SEQ ID N0 :4所示；引物對的序列如SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所示。
[0036] 實施例1豬源附紅細胞體G1基因的克隆和序列分析
[0037] ⑴引物設計：
[0038] 根據GenBank公布的豬附紅細胞體G1蛋白編碼基因序列（GenBank登錄號： AM407404. 1)，應用Primer Premier5. 0軟體設計了擴增豬源附紅細胞體G1蛋白全長編碼 基因的特異性引物，引物序列如下：
[0039] 上遊引物 MF1 :5, -GCGGGATCCATGACAATCCACAAAGTAGC-3，（SEQ ID NO :5);
[0040] 下遊引物 MR1 :5, -CGCCTGCAGTTAAAGAGAAATGTAGTA-3'（SEQ ID NO :6)。
[0041] (2)豬血液樣品基因組DNA提取：
[0042] 用全血基因組DNA提取試劑盒（樹脂型，購自賽百盛公司，產品目錄號：⑶C-100)， 按照該試劑盒的說明書提取豬血液樣品基因組DNA :取500 μ L無菌抗凝全血到lmL純化樹 脂中，顛倒混勻5-6次。室溫下溫育3min，其間顛倒混勻一次，5000r/min離心3s，收集沉 澱。用lmL GN結合液將純化樹脂懸浮，顛倒混勻，5000r/min離心3s，收集沉澱。用0. 5mL 漂洗液漂洗純化樹脂兩次，顛倒混勻，5000r/min離心3s，收集沉澱。用0. 8mL無水乙醇懸 浮，裝入離心純化柱，12000r/min離心lmin，倒掉廢液收集管中的乙醇，再離心lmin，儘量 除盡乙醇。將離心純化柱套入一個潔淨的1. 5mL離心管中，加入100 μ L TE緩衝液於純化 樹脂上，室溫放置3min，12000r/min離心2min，離心管中收集的液體即為洗脫下來的豬血 全基因組DNA。
[0043] (3)豬源附紅細胞體G1基因全長序列的擴增：
[0044] 1)豬源附紅細胞體G1基因全長序列擴增反應體系如下：2. 5 μ L10倍濃度的Ex TaqBuffer，2y LdNTP，0. 2μ L ExTaq，上、下遊引物各 0. 15μ L，2y LDNA 模板，用滅菌雙蒸水 補齊至25 μ L。設滅菌雙蒸水為陰性對照。
[0045] 2)PCR 擴增反應條件：95°C 5min ;94°C 60s，55°C 45s，72°C 60s，共 35 個循環後， 72°C 延伸 8min。
[0046] 3)擴增產物分析：取5 μ LPCR產物，加入至含有0. 5 μ g/mL溴化乙錠染料的2% 的瓊脂糖凝膠中，於125V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統上觀察擴增產物的圖譜。並 與陰性對照對比，被檢樣品孔約在l〇〇〇bp左右出現電泳條帶，即進行切膠純化。結果，成 功地擴增出了豬源附紅細胞體G1全長基因（圖1)，擴增片段長度為lOllbp。圖1中，Μ : DL2000DNAMarker ;1 :目的片段；Ν :陰性對照。
[0047] 4)將目的條帶切膠純化，將回收產物克隆至pMD18-T載體並轉化DH5 α感受態 細胞，經酶切鑑定後進行序列測定。結果，成功地構建了含有豬源附紅細胞體G1基因的 重組質粒，酶切結果顯示外源片段大小正確（圖2)，圖2中，Ml :DLlkb DNAMarker ;Μ2 : DL2000DNAMarker ;1 :豬源附紅細胞體G1基因陽性質粒酶切片段。豬附紅細胞體G1基因全 長序列如下：
[0048] ATGACAATCCACAAAGTAGCAATCAATGGATTCGGAAGAATCGGAAGATTACTATTTAGA
[0049] AATCTTCTTTCTTCTCAAGGAGTTCAAGTTGTAGCTGTTAATGACGTAGTTGACATTAAA
[0050] GTTCTTACTCACCTTTTGGTTTATGACAGTGCTCAAGGAAAACTAAAAGATTGAGAAGT
[0051] AAGTTGTGATTCAGAATACATAAGACTAAAGAATGTAAATACTGGAGAAGTTAGAGAAG
[0052] TTAGAGTTTTCAACTTCAATACTGAAAAGATTTATCACTGAGGTGAATTAGAAATTGATT
[0053] GTGTTGTTGAATGTTCAGGAAGATTCTTAACTAAGGAAGCAGTTAAGTGTCACCTTGATG
[0054] CAGGAGCTCAAAAAGTTCTTATTTCAGCTCCTGCAAAGGATGACACTAAGACAGTTGTT
[0055] TACAACGTAAACCATACTCAAATTACCAGCTCAGACAATGTTATTTCAGGAGCTTCATGT
[0056] ACAACTAATGCACTAGCTCCTATCGTAAAAATTATTCACAGAAAATTTGGAATTAATTCTG
[0057] GATTCATGACAACAGTTCATGCTTTCACTTCTGACCAAAGACTTCAAGACTCTCCTCACG
[0058] CTGACCTA AGA AGAGCTAGAGCAGCTGCTGGATCA ATTATTCCTACA ACTACCGGAGCA
[0059]
【權利要求】
1. 一種豬源附紅細胞體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括： 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細胞體G1基 因第658?793位核苷酸序列特異性結合； 針對豬源附紅細胞體G1基因設計的引物對，該引物對用於擴增豬源附紅細胞體G1基 因第658?793位的核苷酸序列。
2. 根據權利要求1所述的豬源附紅細胞體檢測試劑盒，其特徵在於，所述探針的序列 如SEQ ID NO :4所示；所述引物對的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3. 根據權利要求1所述的豬源附紅細胞體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包 括：含有豬附紅細胞體G1基因的陽性重組質粒標準品。
4. 根據權利要求1所述的豬源附紅細胞體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包 括：螢光定量PCR反應緩衝液及聚合酶。
5. 根據權利要求1所述的豬源附紅細胞體檢測試劑盒，其特徵在於，所述探針的5'端 標記有突光報告基團，3'端標記有淬滅基團。
6. -種檢測豬源附紅細胞體濃度的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 針對豬源附紅細胞體G1基因設計TaqMan探針，該探針與所述豬源附紅細胞體G1基因 第658?793位核苷酸序列特異性結合； 針對豬源附紅細胞體G1基因設計一對引物，該對引物用於擴增豬源附紅細胞體G1基 因第658?793位的核苷酸序列； 用所述TaqMan探針及引物，對含有豬附紅細胞體G1基因的陽性重組質粒標準品進行 實時螢光定量PCR檢測，根據檢測結果繪製出標準曲線； 用所述TaqMan探針及引物，對待測豬血樣品DNA進行實時螢光定量PCR檢測，根據所 述標準曲線分析待測豬血樣品中豬源附紅細胞體的濃度。
7. 根據權利要求6所述的檢測豬源附紅細胞體濃度的方法，其特徵在於，所述探針的 序列如SEQ ID NO :4所示；所述引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
8. 根據權利要求6所述的檢測豬源附紅細胞體濃度的方法，其特徵在於，所述陽性重 組質粒是將全長豬附紅細胞體G1基因插入pMDIS-T載體而製得。
9. 權利要求1所述的豬源附紅細胞體檢測試劑盒在製備診斷豬的附紅細胞體病的產 品中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152537SQ201310176304
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優先權日:2013年5月13日
【發明者】周鵬, 陳兆國, 曹薇, 米榮升, 黃燕 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所