黃瓜CsLOX1基因花特異表達載體及其應用的製作方法

2023-05-25 16:45:06 1

黃瓜CsLOX1基因花特異表達載體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一個黃瓜CsLOX1基因花特異表達載體及其在花器官改造中的應用，屬於生物【技術領域】。該載體為含有擬南芥花特異啟動子AP3和黃瓜CsLOX1的植物表達載體。在擬南芥中表達CsLOX1基因，獲得的CsLOX1轉基因植株的花瓣呈封閉狀、花瓣發育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的數目增加，不正常異位生長的胚珠和柱頭明顯可見，表明CsLOX1在黃瓜花器官的發育中起重要的調控作用。利用CsLOX1基因獲得的花器官發生變異的新材料可用於農作物和觀賞植物的育種應用。
【專利說明】 黃瓜CsLOXI基因花特異表達載體及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程領域，具體涉及一種黃瓜CsLOXl基因花特異表達載體及其應用。

【背景技術】
[0002]脂氧合酶(LOX)是一類廣泛存在於動植物體中的非血紅素鐵蛋白，其參與脂肪酸氧化途徑中的LOX途徑，專一催化含有順，順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應。脂氧合酶基因家族在植物界廣泛存，是一個多基因的家族，具有9-L0X和13-L0X兩種類型，存在著不同數量的同工酶。植物LOX基因的表達貫穿於植物生活史的整個過程，在植物生長發育的各個階段，包括種子的萌發、塊莖的形成、結節的發育、花的發育、果實的成熟以及植物體的衰老，都可以檢測到LOX基因的表達。隨著分子生物學技術的不斷發展，已從擬南芥、水稻、番茄、馬鈴薯、玉米等植物器官中克隆了 LOX基因。目前，脂氧合酶基因的研究重點主要是側重於其參與衰老和脅迫的調控、果實醛類芳香物質的形成，但其在花發育中的功能報導還較少。Ιν?η等的研究發現，玉米脂氧合酶基因TSl功能的喪失會使得雄蕊變為雌蕊狀的結構，表明脂氧合酶基因在玉米花的發育中起著重要的作用。
[0003]黃瓜(Cucum is sativus L.)是葫蘆科重要的蔬菜作物之一，中國是黃瓜栽培和生產大國，且為主要的溫室產品之一，廣泛分布於各地，對其進行深入的研究具有重要的理論和實踐意義。2008年黃瓜基因組測序的完成為從分子水平上研究黃瓜基因的相關功能提供了可能。我們通過前期的研究發現，在黃瓜基因組中共存在著23個CsLOX基因，通過表達的分析發現僅CsLOXl基因在黃瓜花蕾決定的第6時期特異表達，標明其可能在黃瓜花的發育共起著重要的調控作用。進一步通過相關實驗證實CsLOXl在黃瓜花發育中的作用後，可利用基因工程的策略來改變CsLOXl在植物體內的表達量以此來改變植物的花型，或作為潛在的育種材料應用在育種上。


【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種黃瓜LOXl基因花特異表達載體及其在花器官改造中的應用，該載體含有來自黃瓜脂氧合酶CsLOXl，基因的上遊連有擬南芥AP3花特異啟動子。
[0005]本發明的上述植物表達載體為1301-AP3_CsL0Xl，由下述方法構建而成:
(I)設計擬南芥花特異性啟動子AP3特異性引物AP3-F: 5 』 -aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3』(含 BamHI 位點)，AP3-R: 5』- aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3』(含PstI位點)，以擬南芥基因組為模板進行PCR擴增獲得AP3啟動子。回收並純化AP3啟動子，將其連接到PMD18載體上，採用鹼裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒PMD18-AP3。
[0006](2)使用BamHI和PstI酶切pMD18_AP3和表達載體1301，回收後進行連接、轉化感受態細胞，獲得中間表達載體1301-AP3。
[0007](3)根據NCBI上黃瓜CsLOXl的公布的序列(登錄號為U25058)，設計兩端引物:CsLOXl-F:5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3』(含 PstI 位點)CsLOXl-R:5，-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3』(含BamHI位點)。以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得CsLOXl全長。回收CsLOXl的cDNA全長，將其連接到pMD18載體上，採用鹼裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-CsL0Xl。
[0008](4)使用 PstI 和 BamHI 酶切 pMD18_CsL0Xl，回收 CsLOXl 片段，使用 PstI 和 BglII(BamHI和BglII為同尾酶)酶切中間表達載體1301-AP3，回收大片段，將CsLOXl片段與載體1301-AP3大片段進行連接、轉化感受態細胞，獲得植物表達載體1301-AP3-CsL0Xl。
[0009]本發明的另一目的是公開黃瓜CsLOXl在花器官改造中的基因工程應用，該基因導入擬南芥後，轉基因植株花瓣呈封閉狀、花瓣發育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的數目增加，不正常異位生長的胚珠和柱頭明顯可見。該基因可作為目的基因導入其它植物，改變植物的花型，以進行植物品種的改良。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發明中AP3啟動子擴增後的電泳示意圖；
圖2為本發明表達載體1301-AP3的BamHI和PstI雙酶切電泳檢測圖；
圖3為本發明中CsLOXl擴增後的電泳示意圖；
圖4為本發明中質粒1301-AP3-CsL0Xl的SacI酶切電泳檢測圖；
圖5為轉基因植株的PCR鑑定；
圖6為過量表達CsLOXl的轉基因擬南芥植株的表達分析；
圖7為過量表達CsLOXl的轉基因擬南芥植株花的表型，其中(A)為野生型，(B)-(D)為轉基因植株。

【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，這些實施例僅用於舉例說明本發明，而不對本發明的範圍構成任何限制。
[0012]實施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學實驗試劑、各種限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus購於Τ0Υ0Β0公司，DNase I購於天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。其餘試劑均為國產分析純；儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0013]實施例1:花特異表達啟動子表達載體1301-AP3的構建
(1)引物設計:參照Hill(1998)和Duan (2008)，從Genbank Data下載花特異性啟動子AP3啟動子及其5』端序列(G1: 223046640)，取轉錄起始位點前的726 bp，設計擬南芥花特異性啟動子AP3特異性引物:
AP3-F:5，-aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3，(含 BamHI 位點)
AP3-R:5』 - aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3』(含 PstI 位點)
(2)擬南芥基因組的提取所用的擬南芥為野生型擬南芥，為江西農業大學作物生理生態與遺傳育種重點實驗室保存。在放有擬南芥種子1.5 ml離心管中加入I ml 75%的酒精，消毒5分鐘，上下顛倒離心管使種子與酒精充分接觸。消毒完後，將離心管中的酒精吸出，用滅菌的ddH20漂洗3-5遍。種子漂洗完後將適量0.1%瓊脂糖加入離心管中。將種子均勻滴到1/2MS固體培養基(PH5.8-6.2,6.5%瓊脂粉)中。培養皿於4°C冰箱2_3天，後置於組培室內，光照培養2周進行移栽。用噴壺澆入PNS營養液(1L體積:1M KN03 5ml ；1M Ca (N03) 2.4Η202ml ；1M MgS04.7H20 2ml ；20mM Fe-EDTA 2.5ml ；1M 磷酸緩衝液(pH5.5) 2.5ml ；MS 微量元素Iml ;水補足1L)，將營養土(體積比:蛭石:珍珠巖:黑土 =3:1:2)澆透。塑料缽置於託盤內，用鑷子輕輕夾取擬南芥幼苗下胚軸處，慢慢將擬南芥的根從培養基中拔出，輕輕將根插入塑料缽內的營養土中，苗距2cm以上，播完後用保鮮膜罩上，三天揭膜。以後相對溼度70%，恆溫20-24°C，光照強度80-200umol/M2/S，光照周期為8 h黑暗、16 h光照培養。移栽後30天取擬南芥葉100 mg進行DNA的提取。
[0014](3)擬南芥花特異性啟動子AP3的PCR擴增
以擬南芥基因組DNA為模板，使用引物AP3-F和AP3-R進行PCR擴增AP3的啟動子片段，PCR 的 25μ I 體系為:K0D 緩衝液(1X) 2.5 μ I, KOD 0.5 μ 1、cDNA 模板 I μ 1、1mMdNTP 0.5 μ 1、10μΜ AP3_F$*ly IUOyM ΑΡ3-Ι^_1μ 1、使用無菌水補足 25 μ I。反應條件為:94°C 5min, 35 個循環，94°C變性 30s，55°C退火 30s，68°C延伸 60s，68°C反應 lOmin。PCR經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，其長度與預期大小(726bp) —致(見圖1)。
[0015](4)AP3片段的回收
對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳後，切下目的片段，使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。
[0016](5)AP3片段加尾
取1.5 ml滅菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR產物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶緩衝液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C處理 45 min ;先加 0.18 mL無菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸鈉，混勻，最後加入2倍體積的無水乙醇，-20°C沉澱60 min,12，OOOrpm, 4°C離心lOmin。棄上清，75%乙醇洗滌沉澱2次。DNA晾乾後加入20 μ L無菌水溶解沉澱，溶解的DNA置於_20°C保存備用。
[0017](6)AP3片段的T/A克隆和測序
將回收片段連接到PMD18-T載體上，其具體步驟為:向1.5 ml離心管中分別加入:AP3片段的cDNA 5μ 1、pMD18-T載體0.5μ 1、10XT4 DNA連接酶緩衝液I μ 1，Τ4 DNA連接酶14 1，加無菌水至1(^1，用封口膜封好；置於161:連接4-611。將10(^1感受態腸桿菌Ε.coli DH5a加入連接體系中混勻；混合液冰浴30 min，42°C熱刺激90 s後，冰浴5 min ；加入800μ1 LB液體培養基，37 °C、200 rpm搖床培養45min使菌體復甦；培養結束後，常規
3,000 rpm離心2 min收集菌體；在超淨臺上吸去上清,剩餘約0.1 ml時,使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒塗布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種到帶有Amp抗性的LB液體培養基中培養12h，收集菌體，採用質粒抽提試劑盒提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒PMD18-AP3，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質粒 DNA (50ng/y I) 2 μ l.BamH I 0.5 μ l.Pst I 0.5 μ IUOXbuffer (K) I μ 1，使用無菌水補足20μ I ;37°C反應4h ;經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，重組質粒pMD18-AP3可酶切出預期大小，將酶切正確的重組質粒PMD18-AP3進行測序驗證插入基因的正確性。
[0018](7)表達載體1301-AP3的構建
使用BamHI和PstI對質粒pMD18_AP3和載體PCAMBIA1301 (簡稱1301)進行雙酶切，分別獲得5』端帶有BamHI和3』端帶有PstI的AP3片段和1301載體，電泳後分別進行膠回收，16°C連接4-6h ;將100 μ I感受態腸桿菌Ε.coli DH5 α加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s後，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液體培養基，37°C >200rpm搖床培養45min使菌體復甦；培養結束後,常規3，000 rpm離心I min收集菌體；在超淨臺上吸去上清，剩餘約0.1 ml時,使用移液槍混勻,接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒塗布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種於LB液體+Kan的培養基，37°C、180rpm培養12h後，提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒1301-AP3，具體方法為:向0.5 ml 的離心管中分別加入:質粒 DNA (50ng/y I) 2 μ 1、BamHI 0.5μ 1、PstI 0.5μ1、1Xbuffer (Κ)2 μ 1，使用無菌水補足20 μ I ;37°C反應4h ;經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，重組質粒1301-AP3可酶切出預期大小(726bp)的片段(見圖2)。將酶切正確的重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序進行序列驗證，最後獲得花特異表達啟動子表達載體1301-AP3。
[0019]花特異表達啟動子表達載體1301-AP3_CsL0Xl的構建
(I)引物設計:根據NCBI上黃瓜CsLOXl的公布的序列(登錄號為U25058)，設計兩端引物:
CsLOXl-F:5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3』(含 PstI 位點)
CsLOXl-R:5』 -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3』(含 BamHI 位點)。
[0020](2)黃瓜花蕾總RNA的提取
所用黃瓜品種為華北型黃瓜。取長度約0.7 mm的花蕾lmg，取材後立刻凍到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)試劑法提取總 RNA:加 1.5 ml Trizol 後，室溫放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm離心5 min，棄沉澱。加200 ul氯仿，振蕩混勻後室溫放置15min。4°C 12, OOOg離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置30 min。4°C 12, OOOg離心10 min，棄上清。用I ml 75%乙醇洗滌2次沉澱。4°C 8, OOOg 離心 5 min,棄上清。室溫晾乾 10 min。用 50 uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0021](3)黃瓜花蕾總cDNA第一鏈的合成
黃瓜花蕾RNA用DNase I處理後用於以Oligo (dT) 18為引物的反轉錄:取RNA 15 uL，加Oligo (dT) 18 I uL，混勻，70°C保溫5min，立即冰水浴，稍離心，依次加入10XM-MLV Buffer
2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) I uL，總體積 20 uL,混勻，42°C保溫60min，95°C 1min滅活M-MLV酶活性，_20°C保存。
[0022](4) CsLOXl基因的擴增
設計特異性引物:CsLOXl-F: 5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3，(含 PstI 位點)，CsLOXl-R:5』 -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3』(含 BamHI 位點)，以第一鏈產物為模板，用長片段、高保真酶KOD-PIus進行PCR擴增，PCR反應條件為:94 V 5 min ；94 V 30s ；56 0C 30 s ；68 °C 3.0 min, 40 個循環；68°C 5 min。PCR 產物用 1.2% 瓊脂糖進行電泳檢測，擴增片段大小約2637bp，與預期大小一致(圖3)。
[0023](5) CsLOXl片段的膠回收
對PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳後，切下目的片段，使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。
[0024](6) CsLOXl 片段加尾
取1.5 ml滅菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR產物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶緩衝液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C處理 45 min ;先加 0.18 mL無菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸鈉，混勻，最後加入2倍體積的無水乙醇，-20°C沉澱60 min,12，OOOrpm, 4°C離心lOmin。棄上清，75%乙醇洗滌沉澱2次。DNA晾乾後加入20 μ L無菌水溶解沉澱，溶解的DNA置於_20°C保存備用。
[0025](7) CsLOXl片段的T/A克隆和測序
將回收片段連接到PMD18載體上，其具體步驟為:向1.5 ml離心管中分別加入:CsLOXl 片段的 cDNA 5 μ l、pMD18 載體 0.5 μ 1、10XT4 DNA 連接酶緩衝液 I μ 1，Τ4 DNA 連接酶1μ 1，加無菌水至10μ 1，用封口膜封好；置於16°C連接4_6h。將100 μ I感受態腸桿菌Ε.coli DH5a加入連接體系中混勻；混合液冰浴30 min，42°C熱刺激90 s後，冰浴5min;加入800μ1 LB液體培養基，37 °C、200 rpm搖床培養45min使菌體復甦；培養結束後，常規3，000 rpm離心2 min收集菌體；在超淨臺上吸去上清,剩餘約0.1 ml時,使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒塗布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種到帶有Amp抗性的LB液體培養基中培養12h，收集菌體，採用質粒抽提試劑盒提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒pMD18-CsL0Xl，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質粒 DNA (50ng/y I) 2μ 1、PstI 0.5μ 1、BamH I 0.5 μ IUOXbuffer (K) 2μ I,使用無菌水補足20 μ I ;37°C反應4h ;然後將酶切正確的重組質粒pMD18-CsL0Xl進行測序驗證插入基因的正確性。
[0026](8)表達載體 1301-AP3_CsL0Xl 的構建
使用PstI和BglII對質粒1301-AP3進行雙酶切，使用PstI和BamHI對載體pMD18-CsL0Xl進行雙酶切，分別獲得5』端帶有PstI和3』端帶有BamHI的CsLOXl片段，5』端帶有PstI和3』端帶有BglII的1301-AP3載體(BamHI和BglII為同尾酶)，電泳後分別進行膠回收，16°C連接4-6h ;將100 μ I感受態腸桿菌Ε.coli DH5 α加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s後，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液體培養基，37°C >200 rpm搖床培養45min使菌體復甦；培養結束後,常規3，000 rpm離心I min收集菌體；在超淨臺上吸去上清，剩餘約0.1 ml時，使用移液槍混勻，接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒塗布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種於LB液體+Kan的培養基，370C、180rpm培養12h後，提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒1301-AP3，具體方法為:向 0.5 ml 的離心管中分別加入:質粒 DNA(50ng/μ 1)2 μ l、SacI 0.5 μ 1、10Xbuffer(L)2 μ 1，使用無菌水補足20 μ I ;37°C反應4h ;經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，重組質粒1301-AP3-CsL0Xl可酶切出預期約600 bp和360 bp的片段(圖4)。將酶切正確的重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序進行序列驗證(其核苷酸序列如SEQ IDNOl所示)，最後獲得花特異表達啟動子表達載體1301-AP3-CsL0Xl。
[0027]實施例2:1301-AP3-CsL0Xl 轉農桿菌 GV3101 (I)農桿菌感受態細胞製備挑取農桿菌GV3101單菌落接種於5ml YEB培養基中，28°C搖培過夜，按1:100的比例接種於50 ml YEB培養基中擴培，28°C繼續培養約6_7h至0D600=0.4-0.6。將菌液置於冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C離心 5min,棄上清，將菌體懸於 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C離心5min，棄上清，菌體用I ml 20 mM CaCl2,4°C )輕輕懸浮，每管200μ1分裝，或加入終濃度為20%的無菌甘油，-70°C保存。
[0028](2)農桿菌的轉化及鑑定
將10μ1質粒DNA加入200 μ I農桿菌感受態中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍3_5min，37°C水浴5min,加入I mlYEB培養基，28°C搖培3_4h。10，OOOrpm,室溫離心30s,棄上清，加入200 μ I YEB培養基重懸菌體，塗於YEB培養基上，28°C培養2天；鹼裂解法提取農桿菌質粒DNA，酶切驗證。質粒再重新轉化大腸桿菌(DH5 α )，過夜培養後，挑取單菌落液體培養，提取質粒DNA，再用酶切鑑定。
[0029]實施例3:含1301-AP3_CsL0Xl的農桿菌GV3101轉化擬南芥 (I)擬南芥的種植
①當年收穫的種子種植後4度春化72 h，隔年種子種植後春化24 h。然後轉入人工培養室中在相對溼度80%，恆溫20-24°C，光照強度80-200 μ mol/M2/S,光照周期為8 h黑暗、16 h光照培養。所用的土為3份蛭石，I份珍珠巖和2份黑土混合而成。
[0030]②將營養土用塑料盆裝好，在託盤裡加入營養液，待營養土吸水潮溼後，開始點種。
[0031]③將擬南芥的種子放在平鋪的紙上，用牙籤將擬南芥的種子點在土上。用保鮮膜蓋好，暗培養兩天，四天後揭掉保鮮膜正常培養。
[0032]④土稍幹時可再澆一次營養液，以後澆水即可。若要做轉化，待抽薹2到3cm時，剪除頂花序，用營養液再澆灌一次。
[0033]⑤種子的收集:擬南芥完全成熟後，停止澆水待植株乾燥後將擬南芥剪下放在一張乾淨的光面紙上收集種子，儘量將雜物去乾淨，便於篩選。
[0034](2)擬南芥的轉化和轉化子的篩選
①製備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液10 ml，在轉化前一天晚上，轉入大瓶培養過夜，第二天取出使用時農桿菌液0D600當在1.2到1.6之間。室溫5，000 rpm離心10min。棄上清，將農桿菌沉澱懸浮於相應體積的滲透培養基裡，使0D600在0.8左右。
[0035]②先將植株上已長出的果莢及開放的花剪掉，再將農桿菌懸浮液直接噴灑至整個植株，主要噴灑在花序上。蓋上透明的塑料蓋子以保持溼度，移入恆溫室避光培養，第二天可開蓋，正常光照培養。
[0036]③一周後再噴灑一次，收種子，在相應的抗性1/2 MS平板上篩選轉化子。
[0037]④轉化子的篩選:種子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述處理時要不時地使種子懸浮，並換一次70%乙醇。最後用無菌水洗四次。
[0038]⑤處理後的種子用Top agar (0.1%瓊脂水溶液)均勻塗布在相應的抗性固體篩選培養基表面，每塊150 mm直徑的平皿最多種1500棵。
[0039]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恆溫室培養。將篩選出的轉化子長到合適的大小後移栽到土壤中。
[0040]實施例4:轉基因植株的鑑定和分析 (I)擬南芥DNA的提取
將適量的經篩選的擬南芥葉片放入1.5 ml的離心管中，加入400 μ I的SDS抽提緩衝液，用藍色小棒研磨成漿狀，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，猛烈搖勻，12，000rpm，離心10 min。取上清至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3M醋酸鈉(PH5.2)，劇烈混勻使DNA成團，放入_20°C沉澱2hr以上。隨後12，000 rpm,離心10 min。棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌一次後室溫晾乾，加適量的TE或超純水溶解。
[0041](2)轉基因擬南芥植株的鑑定
以抽提的 DNA 為模板、使用引物 CsLOXl-Fl:CTGCAGTTCCTACTCCCGAAGTT GTC 和CsLOXl-Rl:TCTAGAAGAAGCAATGTTCTTGTGGC 進行 PCR 擴增 CsLOXl 片段，PCR 的 25 μ I 體系為:PCR 緩衝液(1X) 2.5 μ I, Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、1mM dNTP 0.5 μ IUOyMCsLOXl-F引物I μ 1、10 μ M CsLOXl-R引物I μ 1、使用無菌水補足25 μ I。反應條件為:94°C 5min，35 個循環，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，72。。反應 1min0 檢測結果如圖5所示。抽提陽性植株花蕾的總RNA，反轉錄後合成cDNA第一鏈，以CsLOX1-FI和CsLOX1-RI為弓I物進行RT-PCR分析，反應體系和程序同上。內參為CsACTIN基因，弓丨物序列為:CsACTIN-F: GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG, PCR 的25 μ I 體系為:PCR 緩衝液(10Χ)2.5μ l、Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ 1、10 μ M CsACTIN-F引物I μ 1、10 μ M CsACTIN-R引物I μ 1、使用無菌水補足25 μ I。反應條件為:94°C 5min，26 個循環，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，72°C反應 lOmin。檢測結果見圖6所示。
[0042](3)轉基因擬南芥植株表型分析
通過PCR和RT-PCR的結果，對獲得的陽性植物進行觀察，獲得的CsLOXl轉基因植株的花瓣呈封閉狀、花瓣發育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的數目增加，不正常異位生長的胚珠和柱頭明顯可見(圖7)。
【權利要求】
1.黃瓜CsLOXl基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQID N01所示。
2.黃瓜CsLOXl基因花特異表達載體，其特徵在於，所述表達載體為1301-AP3-CsL0Xl，含有來自黃瓜脂氧合酶CsLOXl，基因的上遊連有擬南芥AP3花特異啟動子。
3.根據權利要求2所述的黃瓜CsLOXl基因花特異表達載體，其特徵在於，所述表達載體由下述方法構建而成: (1)設計擬南芥花特異性啟動子AP3特異性引物，其中AP3-F引物引入了BamHI位點，AP3-R 引物引入了 PstI 位點:AP3-F: 5』 -aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA_3』，AP3-R:5』 - aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3』，以擬南芥基因組為模板進行PCR擴增獲得AP3啟動子；回收並純化AP3啟動子，將其連接到pMD18載體上，採用鹼裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-AP3 ； (2)使用BamHI和PstI酶切pMD18_AP3和表達載體1301，回收後進行連接、轉化感受態細胞，獲得中間表達載體1301-AP3 ； (3)根據NCBI上黃瓜CsLOXl的公布序列設計兩端引物，其中CsL0Xl_F引物引入了PstI 位點，CsLOXl-R 引物引入了 BamHI 位點:CsLOXl-F:5』-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3』，CsLOXl-R:5』 -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG_3』，以黃瓜花蕾的 cDNA 第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得CsLOXl全長；回收CsLOXl的cDNA全長，將其連接到pMD18載體上，採用鹼裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-CsL0Xl ； (4)使用PstI 和 BamHI 酶切 pMD18_CsL0Xl，回收 CsLOXl 片段，使用 PstI 和 Bglll 酶切中間表達載體1301-AP3，回收大片段，將CsLOXl片段與載體1301-AP3大片段進行連接、轉化感受態細胞，獲得植物表達載體1301-AP3-CsL0Xl。
4.如權利要求2所述黃瓜CsLOXl基因花特異表達載體的應用，其特徵在於，將植物表達載體1301-AP3-CsL0Xl導入植物以改變植物的花型。
5.如權利要求4所述黃瓜CsLOXl基因花特異表達載體的應用，其特徵在於，將植物表達載體1301-AP3-CsL0Xl轉入農桿菌GV3101，再轉入到擬南芥中，收穫植株的種子，晾乾後通過潮黴素篩選獲得抗性苗，再通過PCR鑑定和RT-PCR檢測後獲得轉基因植株。
【文檔編號】C12N15/82GK104450749SQ201410659267
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】胡麗芳, 劉世強, 賀浩華, 蔣倫偉, 黃長幹, 肖偉 申請人:江西農業大學