以介芬胺為原料製備環杷明的方法
2023-05-25 16:44:36
專利名稱：以介芬胺為原料製備環杷明的方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種環杷明的製備方法，具體地涉及一種以來源於藜蘆屬植物的介芬胺為原料製備環杷明的方法，以及該環杷明在治療胰腺癌、髓母細胞瘤、小細胞肺癌等Hh信號通路表達的腫瘤方面的應用。
背景技術：
Hedgehog(Hh)信號通路最早發現於果蠅，是引發果蠅幼蟲發育的信號通路。進一步的研究表明，Hh信號通路包括Patched(Ptc)蛋白和Smoothened(Smo)蛋白及Ci(Gli)蛋白、Cos2蛋白、Fused激酶、蛋白SuFu的複合體，目的基因。Hh蛋白是一種分泌蛋白，經過自身的修飾獲得活性；Patched蛋白是Hh信號蛋白的受體；Smo蛋白是Hh信號的轉換器。當Hh蛋白存在時，Ptch失去對Smo的抑制作用，Smo蛋白活化，為複合體提供磷酸，促使Ci(Gli)轉變為催化劑形式(155kDa)，進入細胞核啟動下遊基因轉錄；相反，當Hh蛋白缺失時，Smo受到Ptch抑制，Ci(Gli)被蛋白酶水解，其抑制劑形式(75kDa)在細胞核中阻止基因的轉錄。
Hh信號通路是眾多動物胚胎發育及臟器、組織發育的信號通路。胚胎中Hh信號通路的缺失會引起發育缺陷或畸形。在越來越多的腫瘤中發現異常的Hh信號通路激活，因此，國內外學者逐步認識到Hh信號通路與腫瘤的發生有著密切的聯繫。並且隨著在此領域研究的深入和範圍的擴展，發現Hh信號通路的異常表達是引起基底細胞瘤、髓母細胞瘤、胰腺細胞癌、小細胞肺癌、乳腺癌等腫瘤疾病的原因。因此，抑制Hh信號通路的異常表達是治療腫瘤的有效方法之一。
環杷明(cyclopamine)是存在於藜蘆和貝母屬植物中的一種異膽甾烷類生物鹼，最初在1964年發現於毛葉藜蘆(Veratrum grandiflorum(Maxim.)Loes.f.)(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)1374-1378(1965))。20世紀60年代到80年代對於環杷明的研究僅限於其致畸作用，直到20世紀90年代中期才發現環杷明是Hh信號通路的抑制劑，與多種腫瘤的發生發展有關(Cooper，M.K.，et al.，Science 280，1603-1607(1998))。
Johns Hopkings大學的Berman研究組將髓母細胞瘤細胞移植至大鼠，經過環杷明處理，發現環杷明能夠抑制細胞生長，並且使大鼠體內的腫瘤縮小。Hutchinson癌症研究中心的Olson對髓母細胞瘤樣品進行體外實驗，發現環杷明能殺滅99.9％的腫瘤細胞(Bermn，D.M.，etal.，Science 297，1559-1561(2002))。在研究環杷明對胰腺癌細胞株的作用時發現，對Smo基因高表達的細胞株經環杷明處理後與對照組相比增殖率下降75％-80％，凋亡增加2.5-3.5倍。並且用環杷明治療接種對環杷明敏感的細胞株的裸鼠時發現，治療組50％-60％的腫瘤體積縮小。表明環杷明在體內和體外都可以通過Hh途徑誘導細胞凋亡和阻斷增值(Thayer，S.p.，etal.，Nature 425，851-855(2003))。
以上結果可以看出，環杷明只對Hh信號通路表達的腫瘤細胞具有抑制作用，表現出極強的專一性。而且早期的毒理研究表明，環杷明對正常細胞沒有毒性，對實驗動物的毒副作用也很小。許多專家認為這開啟了治療腫瘤的一個極具前景的新途徑。該領域的權威，美國JohnsHopkings大學P.A.，Beachy稱目前的實驗表明，環杷明殺死腫瘤細胞的速度快於以往的任何藥物，而且對實驗動物看不出任何副作用(Beachy，P.A.，et al.，Nature，411，349-354(2001))。但是，環杷明在植物中的含量很低，僅有萬分之一，並且化學全合成極為困難。曾有過報導用介芬胺為原料採用Wolff-Kishner法還原得到環杷明，但在該方法中採用易燃高危險的肼，反應條件要求苛刻，產率低，僅有20％左右(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)1374-1378(1965))。後又有人採用改進的Wolff-Kishner-黃鳴龍法還原製備環杷明，但仍存在產物收率低的問題(約50％)，且有異構體3-表環杷明存在(周劍俠，等.中國藥物化學雜誌，16(5)303-305(2006))。環杷明的來源問題成為其被開發成藥品的一大障礙。
本課題組在研究中發現了環杷明的前驅物--介芬胺，其在該種藜蘆中的含量較高，並且該種藜蘆的資源豐富。發明人進行了40餘次用介芬胺製備環杷明的反覆實驗，優化了反應條件，可以方便地高收率地製備得到環杷明，並且所需的反應條件容易達到，適於工業生產。通過介芬胺製備環杷明成為一條切實可行的途徑。
發明內容
本發明的目的是提供一種反應快速方便、產率高的以介芬胺為原料製備環杷明的方法。
本發明提出的由介芬胺製備環杷明的方法，其步驟如下將介芬胺原料和水合肼、強鹼在相轉移催化劑的催化下，在高沸點溶劑中反應，介芬胺和水合肼的摩爾比為1.1∶1-3∶1，反應溫度為160-200℃，反應時間為2-7小時。反應用高沸點溶劑的用量為每g介芬胺用0.2-0.6L溶劑。反應結束後，加入水，並以中等極性的有機溶劑萃取，收集有機溶劑層，除去水分後濃縮，析出結晶即為環杷明。
反應中強鹼為氫氧化鉀或叔丁醇鉀。高沸點溶劑為一縮二乙二醇、二甲基亞碸、1，3-丙二醇或乙二醇。
相轉移催化劑可以用分子量為400的聚乙二醇，用量為反應溶劑體積的2～8％(ml/ml)，優選為5％。相轉移催化劑也可以為苄基三乙基氯化銨(TEBA)，用量為介芬胺重量的1～3％(g/g)。
反應結束後萃取的中等極性的有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一種或多種。
析出結晶後的母液中含有部分環杷明，用柱層析法進一步純化，得到環杷明。柱層析所用的吸附劑為矽膠、氧化鋁或聚醯胺。洗脫用的溶劑為石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一種或多種。
從介芬胺合成環杷明的反應過程如下 本發明中製備的環杷明的熔點及核磁數據與文獻(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)286-292(1986))一致。
本發明中，所述原料介芬胺可從藜蘆植物中提取獲得，具體提取步驟如下將藥材藜蘆植物的乾燥根莖粉碎後用乙醇熱提或冷浸，將提取液或冷浸液濃縮；對濃縮的粗提物經酸化和鹼沉處理，再用矽膠柱層析法，分離得到介芬胺；所用的洗脫劑是二氯甲烷和甲醇體系或石油醚和乙酸乙酯體系。
其中熱提時採用75％的乙醇，熱提2-4次，每次乙醇用量為藥材(藜蘆根莖)體積的3-5倍。冷浸用75％-95％的乙醇，優選95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇的用量為藥材體積的4-10倍，優選5-7倍體積。酸化處理的酸為質量濃度為0.5％-5％的硫酸或鹽酸，優選1％-2％的質量濃度。鹼沉處理用的鹼為濃氨水或碳酸鈉的飽和液，調節酸化處理的溶液pH值為7-10，優選8-9。
介芬胺的結構式如下
環杷明的結構式如下 本發明還提出含有上述環杷明及一種或多種藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發明的藥物組合物優選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如澱粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；溼潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發明化合物可以組合物的形式通過透皮吸收、口服、靜脈注射給藥的方式用於需要這種治療的患者。用於透皮吸收時，可將其製成乳膏、軟膏或凝膠貼片製劑；用於口服時，可將其製成常規的固體製劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，製成液體製劑如水或油懸浮劑或其它液體製劑如糖漿、酏劑等；用於靜脈注射給藥時，可將其製成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優選的形式是乳膏貼片、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑和注射劑。
環杷明對有Hh信號通路表達的胰腺癌、髓母細胞瘤、小細胞肺癌的細胞株的增殖表現出特異性抑制作用。因此，本發明製備的環杷明及上述藥物組合物可用於這些腫瘤的治療。
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
圖1為環杷明對胰腺癌腫瘤細胞株的抑制活性。
圖2為環杷明對小細胞肺癌細胞株的抑制活性圖3為環杷明對結腸癌細胞株的抑制活性具體實施方式
實施例1取5kg藜蘆根莖的粗粉，用95％的乙醇冷浸兩次，每次的用量為30L的乙醇。冷浸液濃縮至流浸膏狀，拌入0.5kg的硅藻土，晾至近幹後裝柱，用質量濃度2％的硫酸洗脫。洗脫下來的酸水用濃氨水調pH＝9，靜置2h後過濾，得到的40g總生物鹼。拌入100g 200-300目的矽膠中，另用1kg 200-300目矽膠裝。用石油醚∶乙酸乙酯體系(5∶1-2∶1-1∶1-0∶1)洗脫，收集11-16餾分，各180mL。各餾分濃縮至60mL後於冰箱內靜置過夜，析出淡黃色針狀介芬胺，總重325mg。經HPLC檢測含量達99.1％。
實施例2取5kg藜蘆根莖的粗粉，用75％的乙醇熱提3次，每次的用量為15L的乙醇。提取液濃縮至無醇味，剩餘物用2％的硫酸酸化至pH＝1。離心，取上清液，用濃氨水調pH＝9，用氯仿萃取3次，每次2L。氯仿層濃縮至0.5L，拌入200g 200-300目的矽膠中蒸乾，另用2kg200-300目矽膠裝。用二氯甲烷∶甲醇體系(20∶1-10∶1-5∶1-2∶1)洗脫，收集8-12餾分，各180mL，濃縮後上Sephadex-LH20，用甲醇洗脫，除去少量的黃酮和色素。餾分濃縮至60mL後於冰箱內靜置過夜，析出淡黃色針狀介芬胺，總重289mg。經HPLC檢測含量達98％以上。
實施例3將50mg介芬胺溶於30mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h後降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應2.5h左右。反應液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至5mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶28mg，母液上矽膠柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末6mg，共計34mg，收率70.3％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，1H-NMR，13C-NMR數據如表1，與文獻(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)286-292(1986))基本一致。
實施例4將50mg介芬胺溶於15mL二縮乙二醇，加入7μL水合肼，2％體積比的聚乙二醇400，在160℃下攪拌，2h後降溫至120℃，除去水份，加入0.2g的氫氧化鉀，再升溫至190±5℃，反應4h左右。反應液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至5mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶36mg，母液上矽膠柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計41mg，收率82％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例5將50mg介芬胺溶於15mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，1mg的TEBA和0.3g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h後降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應2.5h左右。反應液加入50mL水中，用100mL×2氯仿萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至6mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶28mg，母液上矽膠柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計33mg，收率66％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例6將50mg介芬胺溶於25mL乙二醇，加入20μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2g的氫氧化鉀，在反應瓶上加上除水裝置，在160℃，0.06MPa真空度下回流2h，恢復至常壓後升溫至195-200℃，反應4h左右。反應液加入40mL水中，用40mL×2二氯甲烷萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至5mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶33mg，母液上氧化鋁柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計38mg，收率76％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例7將50mg介芬胺溶於15mL DMSO中，加入10μL水合肼，8％體積比的聚乙二醇400和0.1g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h後降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應4h左右。反應液加入100mL水中，用100mL×2丙酮萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至5mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶26mg，母液上矽膠柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末10mg，共計36mg，收率72％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例8將50mg介芬胺溶於15mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400，在160℃，0.06MPa真空度條件下回流2.5h，降溫至30℃，加入0.4g的叔丁醇鉀，反應6h左右。反應液加入60mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至6mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶29mg，母液上矽膠柱，用梯度的乙酸乙酯∶丙酮混合液洗脫，得到白色粉末8mg，共計37mg，收率74％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例9將50mg介芬胺溶於20mL乙醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2mL37％的鹽酸，回流12h，濃縮至5mL，冷卻析出46mg的淡黃色針狀結晶，收率89.1％。將其溶於15mL DMSO中，加入0.4g叔丁醇鉀，於30℃攪拌6h，反應液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機相用飽和食鹽水洗滌後用無水硫酸鈉乾燥。濃縮至5mL，於冰箱內靜置過夜，析出無色針狀結晶32mg，母液上矽膠柱，用梯度的石油醚∶氯仿混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計37mg，收率74％。TLC展開後噴KBiI4顯色，只有一個斑點。熔點125-128℃，與實施例3中的晶體混合後熔點不下降。ESI[M+H]412。
實施例10環杷明抑制胰腺癌細胞株的增殖。
採用噻唑藍還原法(MTT法)測定環杷明對人胰腺癌細胞株BXPC3，CEPAC，SW1990增殖抑制活性。
方法取對數生長期的人癌細胞株分裝於96孔培養板中，0.25mL/孔。實驗設DMSO對照組，3個不同濃度環杷明組。藥物與細胞培養96h，第48h換液，在實驗結束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h後去處培養液，加入100μL DMSO/孔，待結晶溶解後置酶聯檢測儀，用540nm波長測各孔的吸光度值(A)。
結果見圖1。可以看出，胰腺癌細胞株CEPAC和SW1990對環杷明具有明顯的量效關係。這表明環杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時也表明胰腺癌細胞株CEPAC和SW199是有效的Hh通路轉導抑制劑。
實施例11環杷明抑制小細胞肺癌細胞株的增殖。
採用噻唑藍還原法(MTT法)測定環杷明對人小細胞肺癌細胞株LTEP-Sm1和NCI-H446增殖抑制活性。
方法取對數生長期的人小細胞肺癌細胞株分裝於96孔培養板中，0.25mL/孔。實驗設DMSO對照組，3個不同濃度環杷明組。藥物與細胞培養96h，第48h換液，在實驗結束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h後去處培養液，加入100μL DMSO/孔，待結晶溶解後置酶聯檢測儀，用540nm波長測各孔的吸光度值(A)。
結果見圖2。可以看出，人小細胞肺癌細胞株LTEP-Sm1和NCI-H446對環杷明具有明顯的量效關係。這表明環杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時也表明人小細胞肺癌細胞株LTEP-Sm1和NCI-H446是有效的Hh通路轉導抑制劑。
實施例12環杷明抑制結腸癌細胞株的增殖。
採用噻唑藍還原法(MTT法)測定環杷明對人結腸癌細胞株LOVO和HCT-8增殖抑制活性。
方法取對數生長期的人結腸癌細胞株分裝於96孔培養板中，0.25mL/孔。實驗設DMSO對照組，3個不同濃度環杷明組。藥物與細胞培養96h，第48h換液，在實驗結束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h後去處培養液，加入100μL DMSO/孔，待結晶溶解後置酶聯檢測儀，用540nm波長測各孔的吸光度值(A)。
結果見圖3。可以看出，人結腸癌細胞株LOVO和HCT-8對環杷明具有明顯的量效關係。這表明環杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時也表明胰腺癌細胞株LOVO和HCT-8是有效的Hh通路轉導抑制劑。
表1.環杷明的1H-NMR和13C-NMR數據
權利要求
1.一種環杷明的製備方法，其特徵是包括如下步驟由介芬胺、水合肼、強鹼在相轉移催化劑的催化下，在高沸點溶劑中反應，反應中介芬胺和水合肼的摩爾比為1.1∶1-3∶1，反應溫度為160-200℃，反應時間為2-7小時，高沸點溶劑的用量為每g介芬胺用0.2-0.6L溶劑，反應結束後，加入水，並以中等極性的有機溶劑萃取，收集有機溶劑層，除去水分後濃縮，析出結晶即為環杷明，其中所述強鹼為氫氧化鉀或叔丁醇鉀，所述相轉移催化劑採用分子量為400的聚乙二醇，用量為反應溶劑體積的2～8％，或採用苄基三乙基氯化銨，用量為介芬胺重量的1-3％；所述高沸點溶劑為一縮二乙二醇、二甲基亞碸、1，3-丙二醇或乙二醇。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於反應結束後萃取用的中等極性的有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於對析出環杷明結晶後的固滋進行粒層析純化，得到環杷明，其中柱層析純化所用的吸附劑為矽膠、氧化鋁或聚醯胺；洗脫用的溶劑為石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一種或多種。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所用的介芬胺原料從藜蘆屬植物中提取獲得，具體步驟如下將藥材藜蘆植物的乾燥根莖粉碎後用乙醇熱提或冷浸，將提取液或冷浸液濃縮；對濃縮的粗提物經酸化和鹼沉處理，再用矽膠柱層析法，分離得到介芬胺；所用的洗脫劑是二氯甲烷和甲醇體系或石油醚和乙酸乙酯體系。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述熱提採用75％的乙醇，熱提2-4次，每次乙醇用量為藥材體積的3-5倍；冷浸用75％-95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇用量為藥材體積的4-10倍。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述酸化用的酸為質量濃度0.5-5％的硫酸或鹽酸，鹼沉用的鹼為濃氨水或碳酸的飽和液，調節酸化處理的溶液的pH值為7-10。
7.由權利要求1或4製備的環杷明在製備治療腫瘤的藥物組合物中的應用，其中所述腫瘤為由Hn信號通路表達的腫瘤；所述藥物組合物由所述活性成分環杷明與一種或多種藥學上可接受的載體組成，其中，活性成分含量的重量比為0.1％-99.5％。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述腫瘤為胰腺癌，髓母細胞瘤或小細胞肺癌。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及以來源於藜蘆屬植物的介芬胺(jervine)為原料製備環杷明(cyclopamine)的方法及環杷明在醫藥領域的用途。介芬胺與水合肼反應成腙後於高沸點溶劑中，在氫氧化鉀、叔丁醇鉀等強鹼作用下脫氮形成環杷明，反應中使用聚乙二醇400、TEBA等相轉移催化劑。環杷明通過與腫瘤細胞Hh通路中的Smo蛋白直接連接，非基因毒性地引起癌細胞凋亡，而對正常細胞沒有影響。
文檔編號A61K31/58GK101016329SQ20071003775
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月1日 優先權日2007年3月1日
發明者張衛東, 李慧梁, 湯建, 張川, 蘇娟, 沈雲亨, 柳潤輝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學