一種珠子參β-香樹素合酶基因及其應用的製作方法

2023-05-25 09:41:46

一種珠子參β-香樹素合酶基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種珠子參β-香樹素合酶基因及其應用，利用以珠子參cDNA為模板，利用P1：5'ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3'；反向引物P2:5'TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3'進行PCR反應，可獲得珠子參β-香樹素合酶基因，將珠子參β-香樹素合酶（PBβAS）基因通過農桿菌介導的遺傳轉化轉入珠子參，可獲得高齊墩果烷型皂苷含量的的轉基因植株，為獲得高皂苷含量的珠子參提供理論基礎和應用實例，具有廣大的應用前景。
【專利說明】—種珠子參β-香樹素合酶基因及其應用

【技術領域】
[0001 ] 本發明屬於生物【技術領域】，主要涉及珠子參中β -香樹素合酶(β -amyrin
synthase)基因的克隆和應用，

【背景技術】
[0002]珠子參(Panaxjaponicus C.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y Wu et Κ.M.Fen g)是五加科人參屬(Panax L.)植物竹節參的變種，也是傳統的名貴中藥材之一，主要分布在我國陝西、四川、湖北、雲南等省。具有較高的藥用價值，用於氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌扑損傷、關節疼痛、咳血、吐血、外傷出血等。其主要有效成分是三萜皂苷，以齊墩果烷型五環三萜類皂苷為主。
[0003]珠子參是中國藥典收載品種，具有廣闊的應用前景和可觀的經濟價值，通過研究珠子參中活性成分五環三萜皂苷生物合成的途徑及其調控的分子機制，找出其中的關鍵酶，實現其基因的定位、克隆及高效表達，在分子水平上對齊墩果烷型五環三萜皂苷生物合成進行人工調控，進一步實現齊墩果烷型五環三萜皂苷類化合物的規模生產，以提供醫藥市場的需求。
[0004]β-香樹素合酶(β-amyrin synthase, β AS)基因在三職類阜苷的生物合成途徑中起著重要的作用。β AS催化2，3-氧化角鯊烯生成β -香樹素，β -香樹素再經一系列生化反應生成齊墩果烷型皂苷。PAS被公認為是控制2，3-氧化角鯊烯流向齊墩果烷型皂苷合成途徑的關鍵酶。
[0005]本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000進行珠子參全株的轉錄組測序及Denovo拼接。分析找到珠子參中編碼香樹素合酶的候選基因並進行體外克隆表達，驗證其功能，為珠子參齊墩果烷型皂苷的生物合成提供理論基礎。
[0006]在本發明被公布之前，尚未有任何公開報導過本專利申請中所提及的珠子參香樹素合酶基因及其胺基酸序列，此基因編碼的酶在珠子參中齊墩果烷型皂的生物合成的過程中有重要的作用，本研究認為體外克隆該基因是利用基因工程方法和技術來調控珠子參中齊墩果烷型皂苷化合物生物合成的關鍵點。


【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供一種珠子參β_香樹素合酶(PBMS)基因，其序列為SEQID N0.1所示。該基因編碼的香樹素合酶催化2，3-氧化角鯊烯生成β-香樹素，在齊墩果烷型五環三萜皂苷合成途徑中起關鍵性作用，可通過調節酶量提高齊墩果烷型皂苷合成量。
[0008]本發明的第二個目的是提供一種珠子參香樹素合酶(PBPAS)基因編碼的蛋白質，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發明的最後一個目的在於珠子參香樹素合酶(PBPAS)基因在提高珠子參齊墩果烷型皂苷含量中的應用。通過農桿菌介導的遺傳轉化將其導入到珠子參中，可提高珠子參中齊墩果烷型皂苷的含量。
[0010]為了達到上述目的，本發明採取以下技術措施:
[0011]一種珠子參β_香樹素合酶(PBMS)基因(以下稱為PB MS基因)，其製備方法如下:
[0012]以珠子參cDNA為模板，利用正向引物Pl:5』ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3』 ；反向引物 P2:5』TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3』 進行 PCR 反應。
[0013]反應條件:35個PCR反應循環，94°C變性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min。最後 75°C延伸 1min0
[0014]最終獲得了 PBPAS基因，其序列為SEQ ID N0.1所示，編碼的蛋白質為SEQ IDN0.2所示。
[0015]一種珠子參香樹素合酶(PBPAS)基因在提高珠子參齊墩果烷型皂苷含量中的應用，其應用過程如下:
[0016]將珠子參β -香樹素合酶蛋白質(SEQ ID N0.2所示)對應的PB β AS基因(優選SEQ ID N0.1所示核苷酸序列)通過農桿菌介導的遺傳轉化轉入珠子參，可獲得高齊墩果烷型皂苷含量的的轉基因植株。
[0017]本發明的所要保護的內容還包括:編碼SEQ ID N0.2所示胺基酸的核苷酸序列；優選SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0018]含有本發明的珠子參β -香樹素合酶(PB β AS)基因全序列或其ORF序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬於本發明的保護範圍，包括但不限於 pBI121，pCAMBIA1301。
[0019]含有本發明的珠子參β_香樹素合酶(PBMS)基因全序列或其ORF序列的宿主細胞，如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬於本發明的保護範圍，所述的宿主細胞包括但不限於酵母菌、大腸桿菌、珠子參。
[0020]本發明的珠子參香樹素合酶(PBiiAS)基因的應用，包括用所述的重組載體，如植物表達載體轉化植物細胞；或者用所述含有該基因的農桿菌與植物細胞共培養，得到轉基因的植物髮根系；或者用所述的髮根細胞再生植株；或者用所述的珠子參β -香樹素合酶(PBiiAS)基因全序列或其ORF序列的轉化獲得轉基因生物體，所述的轉基因生物體包括但不限於菸草、酵母、擬南芥、珠子參髮根。
[0021]本發明中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、菸草細胞和其它植物細胞。
[0022]利用本發明的珠子參香樹素合酶(PB β AS)，通過各種常規篩選方法，可篩選出與珠子參β_香樹素合酶(PBPAS)發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0023]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0024]本發明所提供的珠子參香樹素合酶(PBPAS)基因是首次從珠子參植物中克隆製備所得，利用本發明的技術可以對珠子參等含有同類化合物的藥用植物進行基因工程改造，通過轉基因來提高植物體內的齊墩果烷型皂苷的含量。珠子參β_香樹素合酶(PB β AS)基因可參與珠子參齊墩果烷型皂苷的生物合成，因此本專利為珠子參齊墩果烷型皂苷生物合成的進一步研究和工業化生產提供理論依據。
[0025]進一步添加其產業上積極的效果本發明利用轉基因技術得到了齊墩果烷型皂苷含量增加的高產株，為齊墩果烷型皂苷的的工業化生產提供了技術支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為珠子參總RNA電泳圖。
[0027]圖2為PB β AS功能域預測分析。
[0028]圖3為PB β AS系統進化樹。
[0029]圖4為表達載體pYES2-PB β AS構建示意圖。
[0030]圖5為酶活力檢測示意圖。

【具體實施方式】
[0031]本發明所述方案如未特別說明，均為本領域的常規方案，所用試劑如未特別說明，均購自生化商店。
[0032]實施例1:
[0033]珠子參轉錄組測序及數據分析
[0034]1、樣品採集
[0035]珠子參(Panaxjaponicus C.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y Wu et K.M.Fen g)植株來源於湖北恩施，分別取根莖、葉、花，果實置液氮中速凍後，在-80°C冰箱中冷凍保存備用。
[0036]2、珠子參總RNA的分離和檢測
[0037]對_80°C保存的各類樣本於液氮中充分研磨，然後採用優化的Trizol法對樣本進行總RNA的提取，全過程保證在低溫條件下進行，加入一定濃度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，並適當加大β -巰基乙醇的濃度，離心去除PVP和β -巰基乙醇後，採用高濃度NaAc溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性(圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度，RNA樣本置於_80°C冰箱備用。
[0038]3、轉錄組測序(RNA-Seq)
[0039]用oligo(dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板,用六鹼基隨機引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈,然後加入緩衝液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈,在經過QiaQuick PCR試劑盒純化並被EB緩衝液洗脫之後進行末端修復、加poly (A)並連接測序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離並選擇片段大小，PCR擴增構建測序文庫，利用第二代SolexaHiSeq2000進行RNA測序，及De novo拼接。
[0040]4、候選基因初步篩選
[0041]通過GO注釋，Blast比對分析以及MEGA5.0構建系統發育樹(圖3)等軟體分析初步篩選到珠子參中編碼香樹素合酶的候選基因。
[0042]實施例2:
[0043]珠子參β -香樹素合酶基因的克隆
[0044]分析候選基因讀碼框範圍，以珠子參根莖cDNA文庫為模板利用正向引物Pl: 5' ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG 3』 ；反向引物 P2:5』TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3』 克隆候選基因全長序列，連結到克隆載體PMD18-T上並轉化到大腸桿菌感受態細胞E.coliDH5a中，步驟如下:
[0045]a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態細胞懸液，解凍後置於冰上；
[0046]b)加入5 μ L連接產物，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min ；
[0047]c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ；
[0048]d)向EP管中加入lmL LB液體培養基(不含抗生素)，37°C 200rpm 45min ；
[0049]e)搖菌後取100 μ L菌液塗布於含抗生素的平板上，37°C培養箱過夜；
[0050]f)挑取單菌落於4mL含抗生素的LB液體培養基中，37°C 200rpm振蕩培養過夜選取陽性克隆送樣測序。
[0051]至此獲得了珠子參β -香樹素合酶基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。
[0052]實施例3:
[0053]ΡΒ β AS基因的生物信息學分析
[0054]本發明涉及的珠子參β -香樹素合酶(ΡΒβ AS)基因全長為2280bp，其序列為SEQID N0.1所示，其中開放讀碼框位於1?2280bp，編碼的蛋白質序列為SEQ ID N0.2所示。將拼接分析好的β_香樹素合酶全長序列在NCBI資料庫中進行Blast。該基因具有典型的ISOP REN_C2_like superfamily 結構域，如圖 2。
[0055]實施例4:
[0056]ΡΒβ AS基因功能的研究
[0057]1、表達載體的構建
[0058]依據珠子參β AS基因全長序列(SEQ ID N0.1)的0RF，設計擴增完整開放閱讀框的引物，分別在正、反向引物上分別弓丨入限制性酶切位點ΚρηΙ和Xhol，利用正向引物P1:5』 GGTACCATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3』 反向引物 P2:5』 CTCGAGTCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3』進行PCR反應，進行瓊脂糖凝膠電泳，30min後照相，觀察膠圖，擴增片段為2292bp，ΤΑ克隆，提取質粒。以ΚρηΙ和Xhol酶切擴增產物2h，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產物。同時利用ΚρηΙ和Xhol酶在37°C下酶切pYES2載體2h，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，並利用試劑盒回收大小約5856bp的片段。
[0059]二者經連接酶在16°C連接過夜。轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，在含有氨苄青黴素的LB平板上篩選重組子。PCR檢測陽性菌斑，提取陽性克隆質粒，進行限制性內切酶酶切電泳鑑定，保存且有正確目標的重組質粒PYES2-PB β AS用於表達轉化。該表達載體命名為PYES2-PB β AS (圖 4)。
[0060]2、蛋白的誘導表達
[0061]以PYES2-PB β AS質粒轉化突變酵母宿主菌GIL77，在缺少尿嘧啶的完全合成培養基SC-U(20ug/ml麥角固醇，13ug/ml血紅素，5mg/mlTween80)上30°C震蕩培養2d，收集細胞在不含葡萄糖的SC-υ培養基(20ug/ml麥角固醇，13ug/ml血紅素,5mg/mlTween80, 2%半乳糖)上30°C培養10h.收集細胞懸浮於0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸鉀溶液中添加3%葡萄糖和血紅素30°C培養24h。回收菌體，分離微粒體，純化蛋白。
[0062]3、酶促反應鑑定
[0063]對表達純化的β -香樹素合酶進行酶活力的檢測，加入2ug的純化表達蛋白到反應體系0.1M磷酸鉀緩衝液(ρΗ7.5)，2，3-環氧角鯊烯，1禮的001'，111^/1111的BAS，0.05%的T riton Χ-100。2，3-環氧角鯊烯作為反應底物，底物濃度越高產生的β -香樹素含量越高。反應總體系在37°C下預孵20min。在100°C下加熱3min終止反應，用氯仿提取反應產物。檢測香樹素的含量，當添加的底物2，3-環氧角鯊烯濃度越高時產生的β-香樹素含量越高，反應速率隨著香樹素合酶的減少而逐漸減少，如圖5。
[0064]實施例5:
[0065]珠子參香樹素合酶在提高珠子參中齊墩果烷型皂苷含量中的應用，其步驟如下:
[0066]轉基因用的受體材料珠子參(Panaxjaponicus C.A.Mey.var.major (Buck.) C.Yffu et Κ.M.Feng)採自湖北恩施。
[0067]根據珠子參β -香樹素合酶基因的全長cDNA序列(SEQ ID N0.1)，在擴增編碼區的正反方向引物上引入限制性內切酶位點(視選用的載體而定)，構建植物表達載體，通過農桿菌介導遺傳轉化轉入珠子參，篩選轉基因植株檢測其齊墩果烷型皂苷的含量。
[0068]以實施例2中獲得的含有ΡΒ β AS基因編碼區(SEQ ID N0.1所示)的pMD18_T為模版，在上述構建的正向引物前引入BamH I酶切位點，在反向引物前引入Sac I酶切位點，正向引物 P1:5』 GGATCCATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3';反向引物 P2:5』 GAGCTCTCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3』進行PCR擴增後，TA克隆，提取質粒。以BamH I和Sac I酶切擴增產物4h，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產物。同時利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121載體4h，，在16°C下利用T4連接酶連接產物過夜在保證閱讀框正確的前提下將珠子參PAS基因的編碼區克隆到植物表達載體pBI 121上，將酶切鑑定好的表達載體PBI121- β AS轉入農桿菌中，遺傳轉化珠子參。
[0069]利用髮根農桿菌介導的珠子參的遺傳轉化，所需的材料和操作步驟如下:
[0070]髮根農桿菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培養基傳代2次，菌種在使用前接種於YEB液體培養基中，28 °C培養過夜。
[0071]取珠子參細嫩葉片，洗淨後置於70%酒精中浸泡lmin，棄酒精，加入2%次氯酸鈉消毒lOmin，期間搖動數次，棄去消毒液，用無菌水漂洗4?5次，置於無菌濾紙上晾乾，用無菌刀片將珠子參葉片切成5mmX 5mm小片，置於預培養固體培養基上，在(23±1)°C暗箱培養箱中預培養2d。
[0072]經過夜培養的髮根農桿菌A4菌液離心後，菌體沉澱用1/2MS重懸，置於4°C中2h後取出。將預培養過的珠子參葉片浸泡於1/2MS重懸的菌液中5min，用無菌濾紙吸去多餘菌液，放入含250-500mg/L卡那黴素的1/2MS固體培養基中，(23± 1) °C黑暗條件下培養，每2周轉移到新鮮培養基中1次，待長出毛狀根後分離毛狀根，轉移至含250-500mg/L卡那黴素的無激素1/2MS固體培養基中培養，每2周轉移到新鮮培養基中至無菌為止，然後再轉移至不含卡那黴素的無激素1/2MS培養基中培養。
[0073]把在固體培養基上的毛狀根繼代培養物接種於裝有150ml無激素1/2MS液體培養基的500ml三角瓶中，培養溫度、光照、轉速等培養條件與愈傷組織液體懸浮培養條件相同，培養25d後，將毛狀根從培養基中取出放入冷凍乾燥機中進行乾燥，然後稱重，貯存-80°C中備用。
[0074]陽性株篩選步驟如下:
[0075]提取具有卡那黴素抗性的轉化珠子參植株的總RNA，利用Takara反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，半定量所用引物為珠子參珠子參β-香樹素合酶基因特異引物(正向引物 5』 -CACTGTCGGATGGTTTAT-3』 ；反向引物 5』 -TAGCGAGGTGCTTCTTG-3，)，反應程序為 94°C時3分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25個循環；循環完成後72°C延伸5分鐘。用植物beta-actin基因做為內參基因(正向引物5』 -GGAAAAGATTTGGCATC-3』，反向引物5』 -GGGCGTAACCCTCATA-3』)。對珠子參的野生型和轉化系在相同生長狀態下進行目的基因表達水平的分析。選擇相對於野生型植株，基因表達量的Fold-change值高於4倍以上(P〈0.01)的轉化植株作為陽性株進行後續的目的物質的含量檢測。
[0076]過表達珠子參香樹素合酶基因的轉基因珠子參髮根的齊墩果烷型皂苷化合物含量測定:
[0077]根據2010版《中華人民共和國藥典》，人參屬植物中的皂苷都為三萜皂苷。
[0078]轉基因珠子參髮根中齊墩果烷型皂苷的檢測可使用本領域的常規技術，本發明具體採用以下步驟:
[0079]髮根系樣品的前處理:用研缽將樣品研磨成粉末，過4號篩，各取0.lg放入具塞錐形瓶中，加入5ml甲醇，稱定重量，超聲處理(250 W、50 kHz)40min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾；量取續濾液，回收溶劑至幹，殘渣加20ml 25%鹽酸、25ml氯仿，力口熱水解lh，水解物用氯仿振搖提取(25mlX2)，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶液並轉移至10ml量瓶中，加甲醇定容，過濾，續濾液即為樣品溶液。
[0080]參考袁丁等(華西藥學雜誌，2008，23 ￠) =692-694)的高效液相色譜法，對過表達珠子參β AS基因的轉基因髮根系進行齊墩果烷型皂苷的含量測定，非轉基因的野生型珠子參的髮根係為對照組，每組各測20株。標準品為齊墩果酸，購自中國藥品生物製品檢定所(批號:110709-200505)。
[0081]測定結果發現，在過表達珠子參β AS基因的轉基因珠子參髮根中齊墩果烷型皂苷的平均含量比非轉基因對照組平均含量提高了 1.4倍(P〈0.05)。由此證明，珠子參β -香樹素合酶基因對促進珠子參齊墩果烷型皂苷化合物含量的提高有顯著作用，珠子參β -香樹素合酶基因可用於利用轉基因技術提高齊墩果烷型皂苷含量的研究和產業化中，具有一定的應用前景。
【權利要求】
1.一種分離的蛋白質，其胺基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQID N0.1所示。
4.含有權利要求2所述核苷酸序列的植物表達載體。
5.含有權利要求4所述植物表達載體的轉基因植株。
6.權利要求1所述蛋白質或權利要求2所述的基因在提高植物齊墩果烷型皂苷含量中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:權利要求1所述蛋白質或權利要求2所述的基因在提高珠子參齊墩果烷型皂苷含量中的應用。
8.權利要求1所述蛋白質或權利要求2所述的基因在提高珠子參齊墩果烷型總皂苷含量中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104293758SQ201410474222
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】陳平, 張紹鵬, 陳燕, 楊濤, 朱聞君, 曾萬勇, 霍夢蕊, 伍翀, 王如峰, 鄧琛 申請人:陳平, 張紹鵬, 陳燕, 楊濤, 朱聞君, 曾萬勇, 霍夢蕊, 伍翀, 王如峰, 鄧琛