ChREBP基因甲基化狀態的檢測的製作方法

2023-05-25 07:31:16

專利名稱：：ChREBP基因甲基化狀態的檢測的製作方法
技術領域：
：本發明屬於分子生物學領域，涉及一個與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)相關的碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate-response-element-bindingprotein,ChREBP；GeneID51085；OMIMNo.605678)啟動子和第一個外顯子區甲基化狀態的檢測。
背景技術：
：As性疾病位居人類疾病譜的首位，特別是心腦血管As性疾病具有很高的發病率和致死率。高血糖、高血壓、胰島素抵抗、高脂血症和不良的生活習性等都是其發病的危險因素(KleinL,GheorghiadeM.Coronaryarterydiseaseandpreventionofheartfailure[J].MedClinNorthAm，2004，88(5):1209-2235)。這些危險因素的致病機制均可以從遺傳學和表觀遺傳學角度進行解釋[ChengX.,DingT.,ZhengF,etal.TwomutationsinLDLRgenewerefoundintwoChinesefamilieswithfamilialhypercholesterolemia.MolBiolRep,2009；36(8):2053_7.]。表觀遺傳學，相對遺傳學而言，是指在沒有細胞核DNA序列改變的情況下，基因功能可逆的、可遺傳的改變，如DNA的甲基化、組蛋白的修飾和X染色體的失活等[HatadaI，FukasawaM,KimuraM,etal.Genome-wideprofilingofpromotermethylationinhuman.Oncogene.2006May18；25(21):3059-64.]，在基因的表達調控方面有重要作用，啟動子區域的DNA高甲基化可使基因的表達水平降低甚至沉默[IwaseY,ShirayaT,TakenoK.FloweringanddwarfisminducedbyDNAdemethylationinPharbitisnil.PhysiolPlant.2010Jan5.]。許多證據支持AS和表觀遺傳學特別是DNA甲基化的相關性①高同型半胱氨酸血症^AS白勺各蟲tMl^iaf[ThampiP,StewartBff,JosephL,etal.DietaryhomocysteinepromotesatherosclerosisinapoE-defcientmicebyinducingscavengerreceptorsexpression.Atherosclerosis,2008；(197)620-62]，而同型半胱氨酸是體內DNA甲基化反應的甲基供體；②AS斑塊區的特定基因存在表觀遺傳學變化，如雌激素受體基因的高甲基化[KimJ，KimJY，SongKS，etal.Epigeneticchangesinestrogenreceptor旦geneinatheroscleroticcardiovasculartissuesandin~vitrovascularsenescence.BiochimBiophysActa.2007；1772(1):72_80.]，一氧化氮合酶基因的高甲基化和組蛋白修飾[FishJ.E.，YanM.S.，MatoukC.C.，etal.Hypoxicrepressionofendothelialnitric-oxidesynthasetranscriptioniscoupledwithevictionofpromoterhistories.J.Biol.Chem，2010；285:810_826.]，超氧化物歧化酶基因的低甲基化[LaukkanenM0,MannermaaS，HiltunenM0,etal.Localhypomethylationinatherosclerosisfoundinrabbitec—sodgene，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol,1999；192171.]；③AS患者外周血白細胞的基因組DNA的總體甲基化水平降低且和血漿同型半胱氨酸和S腺苷同型半胱氨酸水平相關[YiP,MelnykS.,PogribnaM，PogribnyIP,etal.IncreaseinplasmahomocysteineassociatedwithparallelincreasesinplasmaS-adenosylhomocysteineandlymphocyteDNAhypomethylation.JBiolChem.2000，275:29318_29323.]，更有報導患者白細胞低密度脂蛋白受體基因啟動子高甲基化[ZhiYF,HuangYS,LiZH,etal.HypermethylationinpromoterareaofLDLRgeneinatherosclerosispatients.FenZiXiBaoShengffuXueBao,2007；40(6):419-27.]；④在ApoE基因敲除小鼠中，主動脈和外周血白細胞的DNA甲基化譜的改變早於動脈壁的組織學改變[LundG,AnderssonL,LauriaM,etal.DNAmethylationpolymorphismsprecedeanyhistologicalsignofatherosclerosisinmicelackingapolipoproteinE.JBiolChem,2004；279(28):29147_54.]。可見基因組DNA的低甲基化與特異基因的高甲基化與As的形成密切相關。脂代謝紊亂和As的發生發展密切相關，然而脂代謝基因甲基化狀態的改變與As的關係研究甚少。對於脂代謝相關基因的表觀遺傳學研究僅局限於低密度脂蛋白受體相關蛋白、載脂蛋白E、肝X受體這幾個基因。ChREBP在葡萄糖和多不飽和脂肪酸調控糖酵解和生脂基因上發揮著決定性的調節作用。(MaL，TsatsosNG，TowleHC.DirectroleofChrebp.mixinregulatinghepaticglucose-responsivegenes[J].JBiolChem,2005,280(12)12019-12027；RenaudDentin，FadilaBenhamed，Jean—PaulPegorier，etal.PolyunsaturatedfattyacidssuppressglycolyticandlipogenicgenesthroughtheinhibitionofChREBPnuclearproteintranslocation.ThejournalofClinInves.2005,115(10):2843_2854)。然而迄今為止，還沒有有關與As相關的基因ChREBP甲基化狀態與疾病的相關性的研究報導。
發明內容本發明的第一個目的在於提供用於檢測基因CHREBP啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的PCR引物。本發明的第二個目的在於，提供用於檢測基因CHREBP啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的試劑盒。本發明研究發現，與As相關的基因ChREBP啟動子區和第一個外顯子區甲基化狀態與冠心病相關。ChREBP啟動子區和第一個外顯子區甲基化頻率在AS組中顯著高於正常對照人群(具體數值見下表)。表1病例組和對照組甲基化率的比較tableseeoriginaldocumentpage4注這裡甲基化涉及ChREBP基因CG島內的29個CG位點，只要其中存在甲基化的位點，則認為ChREBP啟動子區和第一個外顯子區為甲基化狀態。由此可見，通過檢測ChREBP基因啟動子區和第一個外顯子區高甲基化狀態可以用作AS預警的一個新指標。為此，本發明提供一種提供用於檢測基因ChREBP啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的PCR引物，其擴增產物至少包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位點中的一個。優選，其擴增產物包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的220411片段。一般而言，PCR引物應當以SEQIDNo.1所示核苷酸序列為模板。當然，本領域技術人員可以根據亞硫酸鹽修飾後的DNA為模板設計恰當的PCR引物，但其至少應當包括上述位點中的一個或多個。此外，在設計引物時應當避開C甲基化位點，這樣在擴增時不論是甲基化的ChREBP還是未甲基化的ChREBP都能擴增出相應的序列。為了保證PCR擴徵的特異性，採用巢式PCR方式進行擴增，這時就需要設計2對弓I物。具體而言，巢式PCR的外側引物包括但不限於ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'內側引物包括但不限於tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage6基於上述引物，採用亞硫酸鹽測序法檢測基因CHREBP啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態。首先，提取基因組DNA，亞硫酸氫鈉修飾和純化基因組DNA。然後，針對亞硫酸鹽修飾後的DNA序列，設計巢式PCR擴增引物(例如上述引物)。採用Touch-Down程序(95°C，5min；95°C，45s，65°C_45°C，每個循環降一度，72°C，45s；72°C，10min)擴增目的片段，並將PCR產物純化後進行T-A克隆。挑取單個菌落增菌後用CHREBP內側引物擴增驗證陽性克隆。每一個樣品至少挑取5個陽性克隆測序。採用反向測序，甲基化的CG在測序圖上表現為GC，未甲基化的CG在測序圖上表現為AC,因而可以鑑別相關位點是否甲基化。為方便應用，本發明還提供一種檢測試劑盒，其包括上述PCR引物，還可以進一步包括亞硫酸鹽測序法應用到的相關試劑、耗材，例如選自對苯二酚、亞硝酸氫鈉、異丙醇、乙酸銨、糖原、無水乙醇、氫氧化鈉中的一種或多種。本發明研究發現ChREBP基因高甲基化狀態與冠心病相關，可作為AS的一個新的預警指標。通過本發明的引物及方法可以對冠心病的發病有效提供預警。圖1顯示的是採用亞硫酸鹽測序法獲得的甲基化的ChREBP基因啟動子區和第一外顯子區序列，其中「辺」表示甲基化的CG位點。圖2顯示的是ChREBP基因啟動子區及第一外顯子區亞硫酸鹽測序圖中，CG島內代表性的CG位點。圖3顯示的是ChREBP基因啟動子區及第一外顯子區亞硫酸鹽測序圖中，CG島內代表性的未甲基化CG位點，未甲基化的CG經亞硫酸鹽處理後C-U，經PCR擴增後變為T。採用反向測序，所以未甲基化的CG在測序圖上表現為CA。圖4患者組和對照組ChREBP基因啟動子區甲基化分布圖，A為冠心病組，B為正常對照組。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例11.材料與方法1.1對象採集100例2007年10月至2008年10月在武漢市亞洲心臟病醫院心血管內科經冠狀動脈造影術確診的50-75歲冠心病患者血樣，並收集其年齡、性別、血壓等基本資料。所有冠心病患者至少一支血管內徑有>50%的具有臨床意義的狹窄。96名正常對照為武漢大學中南醫院健康體檢人員。患者和對照者的種族及地區來源無明顯差異，均為漢族，無血緣關係，入選者均無嚴重肝、腎、肺功能不全，無嚴重貧血、營養不良、糖尿病、風溼病、惡性腫瘤及生殖系統、內分泌系統疾病，自身免疫性疾病和感染性疾病史。所有研究對象均經知情同意。1.2基因組DNA提取和血脂水平的檢測所有研究對象均空腹12h後於次日清晨採集2mL靜脈血，經EDTA抗凝，分離白細胞，用蛋白酶K法提取基因組DNA。同時採集2mL靜脈血，經肝素抗凝，分離血漿用全自動生化分析儀檢測血脂水平。1.3基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化1.3.1將約2μgDNA於1.5mlEP管中使用雙蒸水(DDW)稀釋至50ul；加5.5μ1新鮮配製的3ΜNaOH；55°C水浴20min；1.3.2水浴期間配製10mM對苯二酚(氫醌)，加30ul至上述水浴後混合液中；(溶液變成淡黃色)，3.6M亞硫酸氫鈉(Sigma，S9000)，配製方法1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，並以3MNaOH滴定溶液至pH5.0，最終體積為5ml。加520μ1至上述水浴後溶液中。輕柔顛倒混勻溶液。加200μ1石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。55°C避光水浴16h。1.3.3將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然後吸取混合液至一潔淨1.5mlEP管中。使用PromegaWizardCleanupDNA純化回收系統(Promega,A7280)回收純化亞硫酸鹽修飾的DNA。1)力卩ImlPromega'sWizardDNAClean-upresin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結合；2)將5ml的注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接後，將上述混合物用移液器移至針筒內，加針栓，輕輕加壓，將液體擠出，此時可見小柱內有白色的樹脂沉積；3)向針筒內加入2ml80%的異丙醇，插入針栓，輕輕加壓，將異丙醇擠出；4)將注射器與小柱分離，將小柱置於潔淨1.5ml潔淨EP管上，離心12000rpm，2min,以甩去殘餘異丙醇成分，使樹脂乾燥；5)將小柱取下置於另一潔淨1.5mlEP管上，移液器加50μ1預熱好的DDW，室溫放置5min；6)離心12000rpm，20s。L3.4加5.5μ1新鮮配製的3ΜNaOH，室溫放置15min。1.3.5加33μ1IOM乙酸銨、4μ110mg/ml糖原，250μ1冰無水乙醇，置於-20度，過夜沉澱。1.3.6在4度12000印111離心151^11，棄上清液，加入18(^170%乙醇，4度12000rpm離心5min。離心後棄上清，重複一次。1.3.7倒掉上清，室溫乾燥5min，或沉澱由不透明變為半透明或透明時，加入20μ1-30μ1DDff,溶解沉澱。-20°C保存DNA溶液。1.4PCR擴增及測序檢測針對亞硫酸鹽修飾後的DNA序列，應用在線引物設計軟體設計巢式PCR擴增引物。採用Touch-Down程序(95°C，5min；95°C，45s，65°C-45°C，2cycles/2°C，45s，72°C，45s；72°C,10min)擴增目的片段，並將PCR產物純化後進行T-A克隆。挑取單個菌落增菌後用ChREBP內側引物擴增驗證陽性克隆。每一個樣品至少挑取5個陽性克隆測序。本發明中的擴增產物片段包含29個CpG位點，但片段大小是一個範圍涵蓋從209bp到400bp之間的片段，根據巢式PCR所採用的內側上下遊引物起始位置而定。在本例中，外側引物為ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'內側引物為P15'GAAAGACGGGAAGGGAGA3'P25'TTTTATGGTGTCGTCGTCG3'2.結果分析對病例組合對照組的檢測結果如表2所示。結果表明，ChREBP啟動子區和第一個外顯子區甲基化頻率在AS組(病例組)中顯著高於正常對照人群，表明冠心病與ChREBP啟動子區和第一個外顯子區甲基化相關，通過對ChREBP基因啟動子區和第一個外顯子區甲基化檢測能夠有效評估冠心病發病的潛在可能性。表2病例組和對照組甲基化率的比較tableseeoriginaldocumentpage8以上實施例雖然僅給出了一組巢式PCR引物，然而，本領域技術人員按照本發明公開的實質，很容易設計其他PCR引物來擴增本發明所給出的包含CpG島的序列，從而實現對是否甲基化的檢測。權利要求用於檢測ChREBP基因啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的PCR引物，其擴增產物至少包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位點中的一個。2.如權利要求1所述的引物，其特徵在於，所述引物的擴增產物包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的220411片段。3.如權利要求1或2所述的引物，其特徵在於，該引物以SEQIDNo.1所示核苷酸序列為模板。4.如權利要求1所述的引物，其特徵在於，該引物為巢式PCR引物，包括外側引物ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'以及選自以下引物中的內側引物序號正向(5'-3')反向(5'-3')1GAAAGACGGGAAGGGAGATTTTATGGTGTCGTCGTCG2GAAAGACGGGAAGGGAGAGGTTTGTTTCGTTCGTAGG3AAGACGGGAAGGGAGATGGGTTTGTTTCGTTCGTAGG4AAGACGGGAAGGGAGATGCGATATGCTGCTGCTGTGG5TAAGGAAAGACGGGAAGGCGACGACGACACCATAAAA6GAAAGACGGGAAGGGAGATGCTGCTGCTGTGGTATT7AAGACGGGAAGGGAGATGGCGATATGCTGCTGCTGT8GAAAGACGGGAAGGGAGATTGGATGCTTGCTTTGTTT9GAAAGACGGGAAGGGAGATTATTGGATGCTTGCTTTGT10AAGACGGGAAGGGAGATGTTGGATGCTTGCTTTGTTT11AAGACGGGAAGGGAGATGTTATTGGATGCTTGCTTTGT12AAGACGGGAAGGGAGATGCGACGACGACACCATAAAA13GCGGAGTAGGGATTAGGCTATGCTGCTGCTGTGGTA14TAGGGATTAGGCGGTTGCGCGATATGCTGCTGCTGT15TAAGGAAAGACGGGAAGGGGCTTAGGCTTAGATTTGAT16GCGGAGTAGGGATTAGGCGCGATATGCTGCTGCTGT17AAGACGGGAAGGGAGATGTATGCTGCTGCTGTGGTA18AGGAAAGACGGGAAGGGAGGGTTTGTTTCGTTCGTAGG19AGGAAAGACGGGAAGGGAGTTGGATGCTTGCTTTGTTT20ATGAGGTTCGGTTGGTTAAGAGTTACGACGACGACACCATAAAATA。5.用於檢測基因CHREBP啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的試劑盒，其包括權利要求14任一項所述的PCR引物。6.如權利要求5所述的試劑盒，其還包括選自對苯二酚、亞硝酸氫鈉、異丙醇、乙酸銨、糖原、無水乙醇、氫氧化鈉中的一種或多種。全文摘要本發明提供了一種用於檢測ChREBP基因啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的PCR引物，以及含有該引物的檢測試劑盒。本發明採用亞硫酸鹽測序法研究發現冠心病組中ChREBP基因啟動子區和第一個外顯子區甲基化頻率顯著高於正常對照人群，ChREBP基因高甲基化狀態與冠心病相關。可作為AS的一個新的預警指標。本發明提供的檢測引物和檢測試劑盒可以有效用於ChREBP基因啟動子區和第一外顯子區甲基化狀態的檢測。為評估對象的患病潛在可能性提供了手段和依據。文檔編號C12N15/11GK101824478SQ20101016228公開日2010年9月8日申請日期2010年4月27日優先權日2010年4月27日發明者嚴明,楊娜,塗建成,熊陳嶺,鄭芳,郭書忍,錢冉申請人:武漢大學