β-葡糖苷酶變體及其編碼多核苷酸的製作方法

2023-05-25 07:44:01

專利名稱：β-葡糖苷酶變體及其編碼多核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及β -葡糖苷酶變體，編碼所述變體的多核苷酸，產生所述變體的方法，和使用所述變體的方法。
背景技術：
纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產生水解 連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。內
切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，使其暴露於纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β -1, 4-連接的葡萄糖二聚體。β -葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosic feedstock)轉化為乙醇具有以下優勢:大量原料現成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農業殘餘物、草本作物和城市固體廢物被認為是用於乙醇生產的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發酵成乙醇。美國專利號7，244，605公開了煙麴黴(Aspergillus fumigatus) β -葡糖苷酶及其多核苷酸。在本領域中，改善用於木素纖維素原料的酶法降解的具有β -葡糖苷酶活性的多肽是有利的。本發明提供了與其親本相比具有改善性質的親本葡糖苷酶的變體
發明內容
本發明涉及分離的β -葡糖苷酶變體，其在對應於SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置89，91，100，140，186，283，456，和512的一個或多個(例如幾個)位置包含取代，其中所述變體具有葡糖苷酶活性。本發明亦涉及編碼所述變體的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞；以及產生所述變體的方法。
本發明亦涉及用於降解或轉化纖維素材料的方法，其包括:在此種具有β_葡糖苷酶活性的變體的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。本發明亦涉及用於產生發酵產物的方法，其包括:(a)在此種具有β -葡糖苷酶活性的變體的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(例如幾種)發酵微生物發酵經糖化的纖維素材料以產生發酵產物；和(C)從發酵回收所述發酵產物。本發明亦涉及發酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種(例如幾種)發酵微生物發酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料是在此種具有β -葡糖苷酶活性的變體的存在下用酶組合物糖化的。


圖1A和IB顯不煙麴黴β _甸糖昔酶基因的基因組DNA序列和推導的氣基酸序列(分別為SEQ ID Ν0:1和2)。預測的信號肽以下劃線表示，而預測的內含子斜體表示。圖2顯示具有不同濃度的野生型煙麴黴家族GH3Ai3-葡糖苷酶，變體L89M+G91L+F100D+I140V+I186V+S283G+N456E+F512Y,變體 L89M+G91L+I140V+I186V，和變體F100D+S283G+N456E+F512Y的裡氏木黴(Trichoderma reesei)纖維素分解蛋白組合物的淨葡萄糖產生。定義乙醯木聚糖酯酶:術語「乙醯木聚糖酯酶」意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙醯基從聚合木聚糖、乙醯化木糖、乙醯化葡萄糖、乙酸Ct-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本發明而言，乙醯木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN 20(聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯)的50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的乙醯木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolate anion)的酶量。等位變體(allelic variant):術語「等位變體」意指佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術語「 a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶」意指a _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a -L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a -L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200 μ I中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternational Ireland, Ltd., Bray, C0.Wicklow, Ireland)在 4CTC進行 30 分鐘，接著通過AM1NEX HPX-87H 柱層析(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析來確定的。α -葡糖醛酸糖苷酶:術語「 α -葡糖醛酸糖苷酶」意指a _D_葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase) (EC3.2.1.139)，其催化 a -D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根據deVries, 1998, J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個單位的α _葡糖醒酸糖苷酶等於能夠在pH5，40°C每分鐘釋放I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。β -葡糖苷酶:術語「 β -葡糖苷酶」意指β -D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非還原 β -D-葡萄糖殘基的水解，並釋放β-D-葡萄糖。就本發明而言，葡糖苷酶根據Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophiIum:production, purification and some biochemical properties,J.BasicMicrobiol.42:55-66的方法使用對硝基苯基-β _D_葡糖吡喃糖苷作為底物確定。一個單位的β -葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01% TWEEN 20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。β -木糖苷酶:術語「 β -木糖苷酶」意指β -D-木糖苷木糖水解酶(β -D-xylosidexylohydrolase) (E.C.3.2.1.37)，其催化短 β (I — 4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續的D-木糖殘基。就本發明而言，一個單位的β_木糖苷酶定義為在40°C，pH5在含有0.01% TWEEN 20的IOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-木糖苷每分鐘產生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。cDNA:術語「cDNA」意指能夠通過反轉錄從得自真核或原核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體,其通過一系列的步驟加工包括剪接,然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。纖維二糖水解酶:術語「纖維二糖水解酶」意指l，4-13_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I, 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖，或任何包含β -1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4- β -D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri, 1997，Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trendsin Biotechno1gyI 5:1 60-1 67;Teeri 等,1998, Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose , Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根據 Lever 等，1972，Anal.Biochem.47:273-279 ;van Tilbeurgh等，1982，FEBS Lettersl49:152-156 ；van Tilbeurgh 和 Claeyssens, 1985，FEBSLettersl87:283-288 ;以及 Tomme 等，1988, Eur.J.Biochem.170:575-581 描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發明中，Tomme等的方法可用於確定纖維二糖水解酶活性。
纖維素材料:術語「纖維素材料」意指包含纖維素的任何材料。生物質的初生細胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細胞壁(secondary cell wall)在細胞停止生長後產生,其同樣含有多糖並通過共價交聯至半纖維素的聚合木質素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，並且因此是直鏈i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的複雜分支結構。儘管通常是多形的，存在於植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩定細胞壁基質。纖維素通常見於例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限於，農業殘餘物、草本材料(包括能量作物)、城市固體廢物、紙眾與造紙廠殘餘物、廢紙和木材(包括林業殘餘物)(參見，例如，Wiselogel等，1995，於 Handbook on Bioethanol (Charles E.Wyman 編),pp.105-118, Taylor&Francis, Washington D.C.;Wyman, 1994, Bioresource Technology50:3-16;Lynd, 1990, AppliedBiochemistry and Biotechno1gy24/25:695-719;Mosier 等,,1999, Recent Progressin Bioconversion of Lignocellulosics,於 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T.Scheper 主編,Volume65, pp.23-40, Springer-Verlag, New York)。在本文中應理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質中包含木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優選的方面，纖維素材料是任何生物質材料。在另一個優選的方面，所述纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質素。在一個方面，纖維素材料是農業殘餘物。在另一個方面，纖維素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘餘物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是木材(包括林業殘餘物)。在另一個方面，纖維素材料是蘆竹(arundo)。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是竹材。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸杆。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻杆。在另一個方面，纖維素 材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個方面，纖維素材料是麥杆。在另一個方面，纖維素材料是白楊。在另一個方面，纖維素材料是桉樹。在另一個方面，纖維素材料是揪樹。在另一個方面，纖維素材料是松樹。在另一個方面，纖維素材料是楊樹。在另一個方面，纖維素材料是雲杉。在另一個方面，纖維素材料是柳樹。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cotton linter)。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是水生生物質。如用於本文中，「水生生物質」意指在水生環境中由光合作用過程產生的生物質。水生生物質可為藻類、挺水植物(emergentplant)、浮葉植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。纖維素材料可以按原樣(as is)使用或進行預處理，使用本領域已知的常規方法，如本文所述。在一個優選的方面，纖維素材料經預處理。纖維素分解酶或纖維素酶:術語「纖維素分解酶」或「纖維素酶」意指一種或多種(例如幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，β_葡糖苷酶，或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性(內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β_葡糖苷酶)，如 Zhang 等，Outlook for cellulase improvement:Screening and selectionstrategies, 2006, Biotechnology Advances24:452-481 所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatman N0.1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatman N0.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由International Unionof Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987，Measurement of cellulaseactivities, Pure App1.Chem.59:257-68)確立的。就本發明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定:l-50mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素(或其它經預處理的纖維素材料)在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C進行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。通常條件為:Iml反應液，經洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM 乙酸鈉pH5，ImM MnSO4,50°C、55°C或60°C，72 小時，通過AMINLX HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)進行糖分析。編碼序列:術語「編碼序列」意指直接指定變體的胺基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開始，並且以終止密碼子如TAA、TAG或TGA結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。調控序列(control sequence):術語「調控序列」意指對編碼本發明的變體的多核苷酸表達是必需的核酸序列。各個調控序列對於編碼所述變體的多核苷酸可以是天然的(即，來自同一基因)或外源的(即，來自不同基因)，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼變體的多核苷酸編碼區的連接。內切葡聚糖 酶:術語「內切葡聚糖酶」意指內切-1，4-(1, 3; 1，4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-Ι, 4_ β -D-glucan4-glucanohydrolase) (E.C.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣澱粉(Iichenin)中的l，4-13-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如穀類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1，4鍵的內水解(endohydrolysis)。內切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006, BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發明而言，根據Ghose, 1987, Pureand App1.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內切葡聚糖酶活性。表達:術語「表達」包括涉及變體產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體:術語「表達載體」意指線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼變體的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的調控序列可操作地連接。家族GH3 β -葡糖苷酶:術語「家族GH3 β -葡糖苷酶」意指根據Coutinho，P.Μ.和Henrissat，B.，1999，Carbohydrate—active enzymes:an integrated database approach,於"Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering^, H.J.Gilbert, G.Davies, B.Henrissat 和 B.Svensson 編，The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp.3-12 的家族3的糖基水解酶。家族61糖苷水解酶:術語「家族61糖苷水解酶」或「家族GH61」或「GH61」在本文中定義為根據 Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities, Biochem.J.280:309-316,及 HenrissatB.和 Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases, Biochem.J.316:695-696屬於糖苷水解酶家族61的多肽。該家族中的酶原先基於在一個家族成員測量到的非常弱的內切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而歸類為糖苷水解酶家族。這些酶的結構和作用模式是非經典的，且它們無法視為真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基於當與纖維素酶或纖維素酶的混合物一同使用時，其增強木素纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。阿魏酸酯酶:術語「阿魏酸酯酶(feruloyl esterase) 」意指4_輕基_3_甲氧基肉桂醯-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂醯(阿魏醯)基團從酯化的糖(其在天然生物質底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、輕基肉桂醯基酯酶、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-1或FAE-1I。就本發明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶等於能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。片段:術語「片段」意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如幾個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有β_葡糖苷酶活性。在一個方面，所述片段含有SEQ ID NO:2的至少720個胺基酸殘基，例如至少760個胺基酸殘基，或至少800個胺基酸殘基。半纖維素 分解酶或半纖維素酶:術語「半纖維素分解酶」或「半纖維素酶」意指一種或多種(例如幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom, D.和Shoham, Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology, 2003，6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質降解中的關鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限於乙醯甘露聚糖酯酶、乙醯木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團，這些多糖通過氫鍵鍵合於植物細胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯為魯棒(robust)的網絡。半纖維素亦共價地附於木質素，與纖維素一同形成高度複雜的結構。半纖維素的可變的結構和組織形式需要許多酶的協同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側基的酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基於其一級結構的同源性，可指派為GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的摺疊，可進一步歸類為宗族(clan)，以字母標記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)資料庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據Ghose和Bisaria, 1987, Pure&Appl.Chem.59:1739-1752 在合適的溫度，例如 50°C、55°C或 60°C，和pH，例如5.0或5.5進行測量。
高嚴格條件:術語「高嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和50%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在65°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。宿主細胞:術語「宿主細胞」意指任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。術語「宿主細胞」涵蓋任何親本細胞的後代，其由於在複製中發生的突變而不同於親本細胞。增加的比活性:術語「增加的比活性」意指與親本的每分子或微摩爾的酶活性相比更高的變體的每分子或微摩爾的酶活性。變體相對於親本的增加的比活性可例如在一種或多種(例如幾種)pH、溫度、底物濃度和產物抑制劑(例如葡萄糖)濃度的條件下進行評估。在一個方面，所述條件是pH。舉例而言，所述pH可為3至7範圍的任何pH，例如3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，或7.0 (或其之間)。可使用任何用於取得所需pH的合適緩衝液。在另一個方面，所述條件是溫度。舉例而言，所述溫度可為25°C至90°C範圍的任何溫度，例如 25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，或 90 (或其之間)。在另一個方面，所述條件是底物濃度。舉例而言，所述底物濃度可為ImM至IOOmM範圍的任何底物濃度，例如ImM，10mM，25mM，50mM，75mM，或IOOmM(或其之間)。底物的實例包括但不限於纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、β_龍膽二糖、昆布二糖(Iaminaribose)或槐糖。在另一個方面，所述條件是產物抑制劑濃度。舉例而言，所述產物抑制劑濃度可為ImM 至 120mM 範圍的任何濃度，例如 ImM，10mM，25mM，50mM，75mM，IOOmM,或 120mM(或其之間)。產物的實例包括但不限於葡萄糖、β -D-甘露糖、β -D-山梨糖或D-葡糖醛酸。在另一個方面，使用兩個或更多個(例如幾個)上述條件的組合以確定變體相對於親本的增加的比活性，如在3至7範圍的pH，例如3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5，或7.0(或其之間)，在25°C至90°C範圍的任何溫度，例如25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，或90°〇(或其之間)。在一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.0和25°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和30°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和35°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.0和40°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和45°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和50°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.0和55°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.0和60°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和65°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和70°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和75°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.0和80°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和85°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.0和90°C確定。
在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和25°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和30°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和35°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和40°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和45°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和50°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和55°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和60°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和65°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和70°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和75°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH4.5和80°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和85°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH4.5和90°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.0和25°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和30°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和35°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.0和40°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和45°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和50°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.0和55°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.0和60°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和65°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和70°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和75°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.0和80°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和85°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.0和90°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和25°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和30°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和35°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和40°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和45°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和50°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和55°C確定 。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和60°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和65°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和70°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和75°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH5.5和80°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和85°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH5.5和90°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和25°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和30°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和35°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和40°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和45°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和50°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和55°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和60°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和65°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和70°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和75°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在pH6.0和80°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和85°C確定。在另一個方面，相對於親本的變體的比活性在PH6.0和90°C確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為IOmM的葡萄糖的存在下確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為25mM的葡萄糖的存在下確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為50mM的葡萄糖的存在下確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為75mM的葡萄糖的存在下確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為IOOmM的葡萄糖的存在下確定。在上述每一個方面，相對於親本的變體的比活性可在濃度為120mM的葡萄糖的存在下確定。變體相對於親本的增加的比活性可使用本領域中對於葡糖苷酶任何已知的酶測定法來確定。此類酶測定法包括但不限於以纖維二糖或對硝基苯基_β -D-葡糖吡喃糖苷作為底物。或者，變體相對於親本的增加的比活性可使用任何對於變體的應用測定法來確定，其中將變體的性能與親本相比較。舉例而言，可使用實施例5中所述的應用測定法。在一個方面，所述變體的比活性是親本的比活性至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少25倍，和至少50倍高。分離的:術語「分離的」意指以不在自然界出現的形式或環境存在的物質。分離的物質的非限定性實例包括(I)任何非天然存在的物質，(2)任何至少部分地從一種或多種或全部與其天然結合的天然存在的成分移出的物質，包括但不限於任何酶、變體、核酸、蛋白質、肽或輔因子；(3)任何相對於見於自然界的該物質經人力修飾的物質；或(4)任何通過相對於與其自然結合的其他組分增加該物質的量(例如，編碼該物質的基因的多拷貝；比與編碼該物質的基因自然結合的啟動子更強的啟動子的使用)而修飾的物質。分離的物質可存在於發酵液樣品中。低嚴格條件:術語「低嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5Χ SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和25%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在50°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。成熟多肽:術語「成熟多肽」意指以其在翻譯和任何翻譯後修飾之後的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，根據預測SEQ ID NO: 2的胺基酸I至19是信號肽的SignalP程序(Nielsen等,1997, ProteinEngineeringlO: 1-6),成熟多肽是SEQ ID NO:2的胺基酸20至863。在本領域中已知宿主細胞可產生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端胺基酸)的混合物。
成熟多肽編碼序列:術語「成熟多肽編碼序列」意指編碼具有β -葡糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，根據預測SEQ ID NO:1的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至2580。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至2580中含有的cDNA序列。中等嚴格條件:術語「中等嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和35%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在55°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。中等-高嚴格條件:術語「中等-高嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和35%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在60°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。突變體:術語「突變體」意指編碼變體的多核苷酸。核酸構建體:術語「核酸構建體」意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其經修飾以本來不存在於(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區段，或其為合成的，其包含一個或多個調控序列。可操作地連接:術語「可操作地連接」意指這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導編碼序列的表達。親本或親本葡糖苷酶:術語「親本」或「親本葡糖苷酶」意指一種葡糖苷酶，對其進行改變以產生本發明的變體。所述親本可為天然存在的(野生型)多肽或其變體，或它們的片段。具有纖維素分解增強活性的多肽:術語「具有纖維素分解增強的多肽」意指催化具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強的GH61多肽。就本發明而言，通過測量來自由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖 維素分解增強活性:l_50mg總蛋白/g PCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強活性的多肽的蛋白質，在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C和pH，例如5.0或5.5歷時1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/g PCS中纖維素)所進行的對照水解相比。在一個優選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米麴黴β-葡糖苷酶(根據WO 02/095014在米麴黴中重組產生)或者總蛋白質量的2_3%的煙麴黴β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米麴黴中重組產生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST 1.5L (Novozymes A/S, BagSV^rd, Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優選降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。預處理的玉米秸杆:術語「PCS」或「預處理的玉米秸杆」意指通過用熱和稀硫酸處理、鹼預處理或中性預處理的源自玉米秸杆的纖維素材料。序列同一性:參數「序列同一性」描述兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，TrendsGenet.16:276-277)，優選3.0.0、5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的參數為缺口罰分(gap penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty)0.5和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為「最高同一性(longestidentity)」的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，並計算如下:(同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上文)，優選3.0.0、5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見上文)來測定。使用的參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為「最高同一性」的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，並計算如下:(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數)亞序列:術語「亞序列(subsequence) 」意指從成熟多肽編碼序列的5』和/或3』端缺失一個或多個(例如幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有葡糖苷酶活性的片段。在一個方面，所述亞序列含有SEQ ID Ν0:1的成熟多肽編碼序列的至少2160個核苷酸，例如至少2280個核苷酸，或至少2400個核苷酸。變體:術語「變體」意指在一個或多個(例如幾個)位置包含改變，即取代、插入和/或缺失的具有β_葡糖苷酶活性的多肽。取代意指將佔據某位置的胺基酸用不同的胺基酸替代；缺失意指去除佔據某位置的胺基酸；而插入意指在鄰接並緊接著佔據某位置的胺基酸之後添加氨基 酸。本發明的變體具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的β-葡糖苷酶的至少20%,例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少100%。非常高嚴格條件:術語「非常高嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5Χ SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和50%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在70°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。非常低嚴格條件:術語「中等嚴格條件」意指對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切並且變性的鮭精DNA和25%的甲醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2X SSC、0.2%SDS在45°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。含木聚糖材料:術語「含木聚糖材料」意指任何包含含有β -(1-4)連接的木糖殘基骨架的植物細胞壁多糖的材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的雜聚物，其由短的糖鏈分支。它們包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多種包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖類型的多糖可分為均木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan),後者包括葡糖醒酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和複合雜木聚糖。參見，例如 Ebringerova 等,2005, Adv.Polym.Sc1.186:1-67。在本發明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一個優選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術語「木聚糖降解活性」或「木聚糖分解活性」意指水解含木聚糖材料的生物學活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎方法包括:(I)測定總木聚糖分解活性，和(2)測定單獨的木聚糖分解活性(例如內切木聚糖酶、β_木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結於幾個公開文獻中，包括 Biely 和 Puchard, Recent progress in the assays of xylanolyticenzymes, 2006, Journal of the Science of Food 和 Agriculture86(11):1636-1647 ;Spanikova 和 Biely, 2006, Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esteraseproduced by Schizophyllum commune, FEBS Letters580(19):4597-4601 ;Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely 和 Kubicek,1997，The beta-D-xylosidase ofTrichoderma reesei is a multifunctional beta—D—xylan xylohydrolase, BiochemicalJournal321:375-381。總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oat spelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基於從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產生還原糖，如 Bailey, Biely, Poutanen, 1992，Interlaboratory testing of methods for assay ofxylanase activity, Journal of Biotechnology23 (3): 257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01%TRITON* X-100 (4-(I, I, 3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸鈉緩衝液pH6中來確定。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩衝液中從作為底物的0.2%AZCL_阿拉伯木聚糖每分鐘產生1.0微摩爾天青精。就本發明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(Sigma Chemical C0., Inc., St.Louis, MO, USA)水解的增加來確定的:Iml反應液，5mg/ 底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質/g底物,50mM乙酸鈉，pH5,50 °C, 24 小時，如 Lever, 1972，A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates, Anal.Biochem47:273-279所述使用對輕基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定法進行糖分析。木聚糖酶:術語「木聚糖酶」意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶(I, 4- β -D-xylan-xylohydrolase) (E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中 I, 4_β -D-木糖苷鍵的內水解。就本發明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩衝液中從作為底物的
0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產生1.0微摩爾天青精。野生型多肽:術語「野生型多肽」意指由天然存在的微生物，如見於自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的葡糖苷酶。發明詳述本發明涉及分離的多肽，其在對應於SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置89，91，100，140，186，283，456，和512的一個或多個(例如幾個)位置包含取代，其中所述變體具有β-葡糖苷酶活性。變體命名規則:就本發明而言，使用公開於SEQ ID Ν0:2中的成熟多肽以確定在其它β -葡糖苷酶中對應的胺基酸殘基。將其它葡糖苷酶的胺基酸序列與公開於SEQ ID Ν0:2中的成熟多肽進行比對，並基於該比對，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48 =443-453)(如用EMBOSS軟體包(EMBOSS:歐洲分子生物開放軟體套件(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice 等，2000, TrendsGenetl6:276-277)的Needle程序執行，優選為5.0.0版或之後的版本)確定SEQ ID NO: 2所公開的成熟多肽中任何胺基酸殘基對應的胺基酸位置編號。使用的參數為缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。在另一個β_葡糖苷酶中對應胺基酸殘基的鑑定可通過使用數種電腦程式使用其各自的預設參數進行的多個多肽序列的比對來確定，所述電腦程式包括但不限於MUSCLE (根據log期望的多重序列比較，multiple sequencecomparison by log-expectation ;3.5 版或之後的版本；Edgar, 2004, Nucleic AcidsResearch32:1792-1797), MAFFT (6.857 版或之後的版本；Katoh 等，2005，NucleicAcids Research33:511-518;Katoh 和 Toh, 2007，Bioinformatics23:372-374;Katoh等，2009，Methods in Molecular Biology537:39-64; Katoh和 Toh, 2010，Bioinformatics26:1899-1900)和採用 Clustalff 的 EMBOSS EMMA (1.83 或之後;Thompson 等，1994，NucleicAcids Research22:4673-4680)。當其它多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽歧異到傳統的基於序列的比較無法檢測出其關係時(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其它配對序列比較算法。在基於序列的搜索中較高的敏感度可使用採用多肽家族的概率表現(probabilistic representation)(序型)搜索資料庫的搜索程序來獲得。例如，PS1-BLAST程序通過迭代的(iterative)資料庫搜索過程來產生序型，並能夠檢測出較遠的同源物(Atschul 等，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。當多肽的家族或超家族在蛋白質結構資料庫中具有一個或多個代表時，甚至可達成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jonesl999, J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin 和 Jones, 2003, Bioinformaticsl9:874-881)使用來自不同來源(PS1-BLAST、二級結構預測(secondary structureprediction)、結構比對序型(structural alignment profile)以及溶解勢(solvationpotential))的信息作為預測所查詢序列(query sequence)的結構摺疊(structuralfold)的神經網絡的輸入。類似地，Gough等，2000，J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用於將未知結構的序列與存在於SCOP資料庫中的超家族模型進行比對。這些比對可接著用於生成所述多肽的同源性模型，且上述模型可就其準確度使用多種為此目的開發的工具加以評價。
對於已知結構的蛋白質,可獲取數種工具和資源以供找回(retrieve)和生成結構比對。例如，已將SCOP超家族的蛋白質進行了結構比對，且這些比對是可獲取並可下載的。兩個或更多蛋白質結構可使用多種算法，如距離比對矩陣(distance alignmentmatrix) (Holm 和 Sander, 1998，Proteins33:88-96)或組合延伸(combinatorialextension) (Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Engineering.11:739-747)進行比對，且這些算法的實施可另外用於查詢具有目標結構的結構資料庫，以發現可能的結構同源物(例如 Holm 和 Park, 2000, Bio informat ics 16:566-567)。在描述本發明的變體時，為了參照方便起見，採用了下面所述的命名法。使用通用的IUPAC單字母或三字母胺基酸縮寫。座也。對於胺基酸取代，使用下述命名法:初始胺基酸，位置，取代胺基酸。相應地，在226位用丙氨酸取代蘇氨酸命名為「Thr226Ala」或「T226A」。多重突變可以用加號(「 +，，)分開，例如，「Gly205Arg+Ser411Phe」 或 「G205R+S411F」，分別代表 205 和 411 位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。籃失。對於胺基酸缺失，使用了如下命名法:初始胺基酸，位置*。相應地，在位置195缺失甘氨酸命名為「Glyl95*」或「G195*」。多個缺失通過加號(「 + 」)分開，例如，「Glyl95*+Ser411*，，或 「G195*+S411*，，。通2k。對於胺基酸插入，使用了如下的命名法:初始胺基酸，位置，初始胺基酸，插入的胺基酸。因此，在位置195的甘氨酸之後插入賴氨酸命名為「Glyl95GlyLys」或「G195GK」。多個胺基酸的插入命名為[初始胺基酸，位置，初始胺基酸，插入的胺基酸#1，插入的胺基酸#2 ;等等]。例如，在位置195的甘氨酸之後插入賴氨酸和丙氨酸記為「Glyl95GlyLysAla」 或 「G195GKA」。在此情況下，通過在插入的胺基酸殘基前的胺基酸殘基的位置號添加小寫字母而對插入的胺基酸殘基進行編號。因此，在上一例子中序列為:
權利要求
1.一種β-葡糖苷酶變體，其在對應於SEQ ID Ν0:2的成熟多肽的位置89，91，100，140，186，283，456，和512的一個或多個(例如幾個)位置包含取代，其中所述變體具有β-葡糖苷酶活性。
2.權利要求1的變體，其為親本葡糖苷酶的變體，選自下組: (a)多肽，其與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少80%，例如至少81%，至少82%，至少83%,至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴格條件下或非常高嚴格條件下與以下雜交:(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)或(i)或(ii)的全長互補鏈； (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%，例如至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和 (d)SEQID NO:2的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
3.權利要求2的變體，其與親本β-葡糖苷酶的胺基酸序列具有至少80%，例如至少81%,至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,但少於100%序列同一性 。
4.權利要求1-3任一項的變體，其與SEQID ΝΟ:2的成熟多肽具有至少80%，例如至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,但少於100%序列同一性。
5.權利要求1-4任一項的變體，其包含一個或多個選自下組的取代:L89M，G91L，F100D, I140V, I186V, S283G, Ν456Ε，和 F512Y。
6.權利要求1-4任一項的變體，其包含如下取代或由如下取代組成:L89M，G91L，F100D, I140V, I186V, S283G, Ν456Ε，和 F512Y。
7.—種分離的多核苷酸,其編碼權利要求1-6任一項的變體。
8.—種宿主細胞，其包含權利要求7的多核苷酸。
9.一種產生變體的方法，其包括: (a)在適於表達所述變體的條件下培養權利要求8的宿主細胞；和 (b)回收所述變體。
10.一種轉基因植物、植物部分或植物細胞，其用權利要求7的多核苷酸轉化。
11.一種產生權利要求1-6任一項的變體的方法,其包括: (a)在有助於產生所述變體的條件下培養包含編碼所述變體的多核苷酸的轉基因植物或植物細胞；和 (b)回收所述變體。
12.—種用於獲得變體的方法，其包括:將在對應於SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置.89，91，100，140，186，283，456，和512的一個或多個位置的取代導入親本β-葡糖苷酶，其中所述變體具有β -葡糖苷酶活性；和回收所述變體。
13.一種用於降解或轉化纖維素材料的方法，其包括在權利要求1-6任一項的變體的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。
14.權利要求13的方法，其進一步包括回收經降解的纖維素材料。
15.權利要求13或14的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的多肽、半纖維素酶、棒麴黴素、酯酶、漆酶、木質素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。
16.一種用於產生發酵產物的方法，其包括: (a)在權利要求1-6任一項的變體的存在下用酶組合物糖化纖維素材料； (b)用一種或多種微生物發酵經糖化的纖維素材料以產生發酵產物；和 (C)從發酵回收所述發酵產物。
17.權利要求16的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的多肽、半纖維素酶、棒麴黴素、酯酶、漆酶、木質素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。
18.一種發酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種發酵微生物發酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料是在權利要求1-6任一項的變體存在下用酶組合物糖化的。
19.權利要求18的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的多肽、半纖維素酶、棒麴黴素、酯酶、漆酶、木質素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。
20.權利要求18或19的方法，其中所述纖維素材料的發酵產生發酵產物。
21.權利要求20的方法，其進一步包括從發酵回收發酵產物。
22.—種全培養液配製物或細胞培養組合物，其包含權利要求1-6任一項的變體。
全文摘要
本發明涉及親本β-葡糖苷酶的變體。本發明亦涉及編碼變體的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞；和使用所述變體的方法。
文檔編號C12N9/42GK103221538SQ201180056301
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月30日 優先權日2010年10月1日
發明者M.沃古利斯, P.哈裡斯, D.奧斯伯恩 申請人:諾維信股份有限公司