基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法
2023-05-25 07:37:41
基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法，包括（1）針對亞硫酸氫鈉轉化後的Alu序列設計相應引物；（2）標本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理；（3）對處理後的標本進行BSP測序；（4）根據測序結果，分析篩選出檢測位點，並針對該位點設計相應探針；（5）製備標準品和樣品PCR產物；（6）將探針包被到微球上（7）將包被了探針的微球與PCR產物雜交孵育，並在液相晶片機器上進行檢測，讀取數據；（8）根據標準品繪製標準曲線後，計算出每個樣品的甲基化水平。本發明方法相較於現有的檢測方法，是一種高通量、操作簡便、準確可靠的定量檢測Alu基因甲基化水平的方法。
【專利說明】基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種基因甲基化水平的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]Alu和LINE等重複序列是研宄基因組整體甲基化水平的主要靶基因。
[0003]Alu家族是靈長類動物基因組內最具特徵性的短散在重複序列。人Alu元件由兩個不完全對稱的單體組成，典型Alu長282 bp，左右兩部分為同源序列，其間為富含腺苷酸的連接區。Alu RNA實質上為獲得polyA結構的7sL RNA 二聚體，而7sL RNA是信號識別顆粒的重要組成部分。Alu序列作為人類基因組中的調控序列，對基因表達的調節起重要作用。Alu元件的去甲基化是基因組穩定性降低的標誌，也是基因組重組和染色體易位的必要條件。
[0004]目前，甲基化水平的檢測方法主要有甲基化特異PCR (MSP)、結合亞硫酸鹽的限制性內切酶分析(COBRA)、亞硫酸氫鹽基因測序(BSP)、焦磷酸測序、定量甲基化特異PCR(Methylight)以及高解析度溶解曲線檢測(HRM)等。目前運用這些方法對Alu序列進行甲基化水平檢測存在以下這些問題:MSP和COBRA方法均局限於對某一或兩個位點進行定性檢測，對操作過程和位點選擇有很高的要求，受標本個體差異的影響較大，同時定性檢測不如定量檢測準確可靠；BSP和焦磷酸測序雖然可以檢測一定範圍內DNA序列的所有CpG位點的甲基化水平，但操作繁瑣，每一個樣本檢測均需構建多個克隆，分別測序後統計分析甲基化水平，甲基化水平結果的準確性在一定程度上取決於選取克隆數的多少，並且這兩種方法並不能稱為是完全意義上的定量檢測；Methylight雖然可以定量檢測基因的甲基化水平，但目前一般只對基因中某一個位點進行檢測，Alu序列中有多個CpG位點，其中的某一個位點的甲基化水平是否能夠完全代表Alu基因的整體甲基化水平還有待研宄。HRM檢測可以檢測基因整體的甲基化水平，對基因中的各個CpG位點的具體甲基化水平卻無法研宄。
[0005]因此，針對Alu基因，建立一種新的、操作簡便、準確可靠的定量甲基化檢測方法十分有必要。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於針對Alu基因，提供一種操作簡便、準確可靠的基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法。
[0007]本發明的技術解決方案是一種基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法，其特徵是:包括下列步驟:
(I)針對亞硫酸氫鈉轉化後的Alu序列設計相應引物；(2)標本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理；(3)對處理後的標本進行BSP測序；(4)根據測序結果，分析篩選出檢測位點，並針對該位點設計相應探針；(5)製備標準品和樣品PCR產物；(6)將探針包被到微球上(7)將包被了探針的微球與PCR產物雜交孵育，並在液相晶片機器上進行檢測，讀取數據；(8)根據標準品繪製標準曲線後，計算出每個樣品的甲基化水平。
[0008]步驟(I)中，選擇Alu 22bp?259bp為靶序列，此片段中共有17個CpG位點，針對這個片段，上下遊引物分別為5』 - TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3』和5』 -CCCAAACTAAAATACAATAA -3，。
[0009]步驟(5)中，基因合成24個CpG位點分別為CG和TG兩種鹼基類型的兩段Alu基因，以這兩段序列的系列體積比稀釋溶液作為該方法的系列標準品溶液。
[0010]通過BSP檢測標本後選擇185bp進行下遊檢測，根據此位點設計的探針序列為:探針 CG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT，和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGTo
[0011]Alu序列是根據RepeatMasker和相關文獻報導找到的Alu家族的共有保守序列(圖1)。經亞硫酸氫鈉處理後，Alu原序列中的CpG位點處的C不變，其他位置的C變為T，以該轉化後的序列一一亞硫酸氫鈉轉化後的Alu序列作為下遊檢測的模板(圖2)。發生了甲基化的CpG位點，經過亞硫酸氫鈉處理後仍然為CG，而處於非甲基化狀態的CpG位點，經過處理後變為TG，由於我們需要得到所有甲基化和非甲基化產物，故設計引物時避開CpG位點，選擇Alu 22bp?259bp為靶序列，此片段中共有17個CpG位點，針對這個片段，本發明中Alu基因的上下遊引物分別為5』- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3』和5』-CCCAAACTAAAATACAATAA -3』(圖2方框處)，以此序列作為BSP檢測的上下遊引物；在該上下遊引物5』端加上生物素標記，作為基於液相晶片的定量甲基化檢測的引物。
[0012]本發明中首先通過BSP測序篩選出下遊檢測的靶位點，使得下遊基於該位點的檢測更加有針對性，更能有效的代表Alu基因的整體甲基化水平。根據篩選出的CpG位點分別設計CG和TG兩種類型的探針。為了與含有羧基的微球進行偶聯，每條探針的5』端均需加入一個氨基。
[0013]液相晶片系統是一種以螢光編碼微球為核心，集流式細胞、雷射分析、高速數位訊號處理等多種技術於一體的多指標並行分析技術平臺。該方法具有通量大、靈敏度高、操作簡便等特點。目前液相晶片系統對核酸的檢測應用主要集中在對基因進行單核苷酸多樣性分析(SNP)和病毒核酸檢測。液相晶片系統能夠在同一個樣本中對單個或多個靶基因進行檢測，並可以同時對多個樣本進行檢測，本發明中我們將其引入到Alu基因甲基化檢測中，利用液相晶片系統中的微球包被特異性探針，微球在流式細胞功能的作用下單個通過雷射分析系統，在高速數位訊號處理系統的作用下進行分析，使甲基化檢測通量更高、操作更簡便。由於結合液相晶片系統，本發明的設計思路和方法不僅可用於對Alu基因中各CpG位點分別進行甲基化水平檢測，也可以選擇性的將針對不同位點的探針進行組合，在一個標本中同時對多個位點進行甲基化水平檢測，多位點檢測有利於提高檢測的準確度和可靠性。不僅如此，液相晶片系統的運用使得大規模樣本同時檢測成為可能，極大的提高了樣本檢測效率。
[0014]本發明方法相較於現有的檢測方法，是一種高通量、操作簡便、準確可靠的定量檢測Alu基因甲基化水平的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是Alu原始序列。
[0016]圖2是經亞硫酸氫鈉轉化後的Alu序列，方框處為引物位置，灰色陰影處為CG位點。
[0017]圖3是質粒CG序列。方框處為CG位點。
[0018]圖4是質粒TG序列。方框處為TG位點。
[0019]圖5是液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平方法的標準曲線。
[0020]圖6是批內重複性結果。
[0021]圖7是批間重複性結果。
【具體實施方式】
[0022]實施例1:基於液相晶片定量檢測Alu基因185bp處CpG位點的甲基化水平
(I)靶序列選擇和引物設計
根據ItepeatMasker和相關文獻報導找到Alu家族的共有保守序列(圖1)。經亞硫酸氫鈉處理後，Alu序列中的CpG位點處的C不變，其他位置的C變為T，以該轉化後的序列作為下遊檢測的模板(圖2)。
[0023]發生了甲基化的CG位點，經過亞硫酸氫鈉處理後仍然為CG，而處於非甲基化狀態的CG位點，經過處理後變為TG，由於我們需要得到所有甲基化和非甲基化產物，故設計引物時避開CG位點，選擇Alu 22bp?259bp為靶序列，本發明中Alu基因的上下遊引物分別為 5』- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3』 和 5』- CCCAAACTAAAATACAATAA -3』(圖 2 方框處)，以此序列作為BSP檢測的上下遊引物；在該上下遊引物5』端加上生物素標記，作為基於液相晶片的定量甲基化檢測的引物。
[0024](2)血清DNA提取和標本處理
使用含有促凝劑和分離膠的血清分離管無菌採集新鮮血液3 miaeoog離心10分鐘，吸取上層血清，並放於-80°c保存。血清DNA提取按照德國Qiagen公司核酸提取試劑盒(QIAamp MinElute Virus Spin Kit)說明書對血清中游離DNA進行提取。按照德國Qiagen公司的亞硫酸氫鈉轉化試劑盒(Epitect Bisulfite Kit)說明書轉化上步提取的DNA，回收後-20°C保存。
[0025](3) BSP 檢測
將經過亞硫酸氫鈉轉化的DNA標本送上海睿安公司進行BSP測序，每個標本要求做8個克隆。
[0026](4)去甲基化位點選擇
根據Alu基因185bp處的CG位點分別設計CG和TG兩種類型的探針，每條探針的5』端均加入一個氨基(為了與含有羧基的微球進行偶聯)。
[0027]探針序列分別為:
探針 CG:NH2-1TITITITTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT，和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGTo
[0028](5)標準品製備
基因合成24個CpG位點分別為CG和TG兩種鹼基類型的兩段Alu基因(見圖6和圖7)，將其分別構建到PCDNA3.1載體中，用上下遊都標記了生物素的引物對這兩種質粒DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系為:20 μ L PCR混合物中包含10 μ L南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2 X Master PCR Mix)，0.5 μ L 的質粒 DNA, 10 μ M 的上下遊引物各 0.4μ L和8.7 μ L雙蒸水。PCR擴增條件為:95°C預變性10分鐘，隨後進行40個循環(94°C變性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸30秒)，最後在72°C延伸10分鐘。擴增產物按照體積比配成CG含量(CG%)分別為0%、20%、40%、60%、80%和100%的溶液，以此作為該方法的系列標準品溶液。
[0029](6)樣本PCR產物製備
以步驟(2)中亞硫酸氫鈉轉化後的DNA為模板，用上下遊都標記了生物素的引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為:20 μ L PCR混合物中包含10 μ L南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2 X Master PCR Mix)，2 μ L 的標本 DNA, 10 μΜ 的上下遊引物各 0.4 μ L和7.2 μ L雙蒸水。PCR擴增條件為:95°C預變性10分鐘，隨後進行40個循環(94°C變性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸30秒)，最後在72°C延伸10分鐘。
[0030](7)微球包被
將步驟(4)中我們設計的兩種探針送上海透景公司進行微球包被，每種探針包被到唯一編號的一種微球上。
[0031](8)雜交孵育及上機檢測
將包被了探針CG/TG的兩種微球配製成工作微球混合物，每22 μ L工作微球混合物含有16.8 yL 1.5 X TMAC (sigma),兩種微球各0.1 yL，5 μ L I X TE緩衝液。向96孔板中每孔加入22 μ L工作微球混合物和3 μ L PCR產物，95°C變性5分鐘，47 °C孵育30分鐘。用I XTE緩衝液將親和素-藻紅蛋白(streptavidin-R-phycoerythrin, sigma)稀釋成最終濃度為10 μ g/mL的工作報告溶液混合物，30分鐘後每孔加入該溶液75 μ L, 47°C孵育15分鐘。在液相晶片(Luminex 200 xMAP)上47°C進行檢測，並讀取數據。在對標準品和樣品進行檢測的同時，加入一個陰性對照，陰性對照PCR擴增體系為:20 uL PCR混合物中包含10 UL南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2XMaster PCR Mix)，10 μΜ的上下遊引物各0.4 yL和9.2 yL雙蒸水。PCR擴增條件為:95°C預變性10分鐘，隨後進行40個循環(94°C變性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸30秒)，最後在72°C延伸10分鐘。陰性對照的讀數為本底值，其他讀數均需扣除本底值後再進行統計分析。
[0032](9)標準曲線繪製
以CG含量(0%、20%、40%、60%、80%和100%)為橫坐標，探針CG讀數/ (探針CG讀數+探針TG讀數)為縱坐標，繪製標準曲線，並得到相應的回歸方程。
[0033](10)液相晶片檢測Alu基因甲基化水平
根據機器給出的每個標本的探針CG和探針TG讀數，代入回歸方程，計算得到相應標本的CG含量，即標本的甲基化水平。
[0034](11)統計學方法
用GraphPad Prism v5.0統計軟體進行統計學分析，P < 0.05為有統計學意義。兩獨立樣本比較採用Mann-Whitney U檢驗，多個獨立樣本比較用Kruskall-Wallis H檢驗，雙變量相關分析用Spearman相關檢驗；受試者工作曲線(Receiver Operator CharacteristicCurve, ROC曲線)用於評價參數作為診斷標誌物的準確性和精確性，依據最大曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)計算最佳截斷值及其準確度和精確度。
[0035](12)對上述建立基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法進行方法學評價。
[0036]線性:以CG含量(0%、20%、40%、60%、80%和100%)為橫坐標，探針CG讀數/ (探針CG讀數+探針TG讀數)為縱坐標，繪製標準曲線，並得到回歸方程y=0.6679x+0.0476和標準曲線的線性R2=0.9888 (圖5)，線性良好。
[0037]重複性:反應設立2個復孔，分別選取CG%為20%和60%的溶液，同一批重複做20個測定，批內CV值分別為13.9%和4.7% (圖6)。選取CG%為20%和60%的溶液，連續測定5天，每天重複做4個測定，批間CV值分別為16.2%和6.0% (圖7)，該方法重複性佳。
【權利要求】
1.一種基於液相晶片定量檢測AlU基因甲基化水平的方法，其特徵是:包括下列步驟:(I)針對亞硫酸氫鈉轉化後的Alu序列設計相應引物；(2)標本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理；(3)對處理後的標本進行BSP測序；(4)根據測序結果，分析篩選出檢測位點，並針對該位點設計相應探針；(5)製備標準品和樣品PCR產物；(6)將探針包被到微球上(7)將包被了探針的微球與PCR產物雜交孵育，並在液相晶片機器上進行檢測，讀取數據；(8)根據標準品繪製標準曲線後，計算出每個樣品的甲基化水平。
2.根據權利要求1所述的基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法，其特徵是:步驟(I)中，選擇Alu 22bp?259bp為靶序列，此片段中共有17個CpG位點，針對這個片段，上下遊引物分別為5』 - TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3』和5』 -CCCAAACTAAAATACAATAA -3，。
3.根據權利要求1所述的基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法，其特徵是:步驟(5)中，基因合成24個CpG位點分別為CG和TG兩種鹼基類型的兩段Alu基因，以這兩段序列的系列體積比稀釋溶液作為該方法的系列標準品溶液。
4.根據權利要求1所述的基於液相晶片定量檢測Alu基因甲基化水平的方法，其特徵在於:通過BSP檢測標本後選擇185bp進行下遊檢測，根據此位點設計的探針序列為:探針CG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT,和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGT0
【文檔編號】C12Q1/68GK104498591SQ201410676539
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月24日 優先權日:2014年11月24日
【發明者】戚菁, 鞠少卿, 施煒, 李曉紅, 郭益冰, 申嫻娟, 陸晶晶, 施維, 朱慧, 吳信華 申請人:南通大學附屬醫院