用於鑑定與zap-70相互作用的分子和純化zap-70的方法

2023-05-25 11:08:11

專利名稱：：用於鑑定與zap-70相互作用的分子和純化zap-70的方法用於鑑定與ZAP-70相互作用的分子和純化ZAP-70的方法
技術領域：
：本發明涉及使用氨基吡啶並嗜啶(aminopyrido-pyrimidine)配體24作為ZAP-70的配體來鑑定與ZAP-70相互作用的分子和純化ZAP-70的方法。此外，本發明涉及包含所述相互作用分子的藥物組合物，例如用於治療T細胞介導的疾病例如自身免疫性疾病、炎症和移植排斥。如生長因子、細胞因子或趨化因子的細胞的激活、生長和分化的信號轉導事件。一般說來，這些激酶分成兩組，優先磷酸化酪氨酸殘基的激酶和優先磷酸化絲氨酸和/或蘇氨酸殘基的激酶。酪氨酸激酶包括跨膜生長因子受體例如表皮生長因子受體(EGFR)和細胞質非受體激酶例如Src、Syk或ZAP-70。不適當的高蛋白激酶活性涉及許多疾病包括癌症和炎症。這可由因酶的突變、過表達或不適當的激活而導致的控制機制的失效直接或間接引起。在所有這些情況下，預期激酶的選擇性抑制具有有益的效果。蛋白質酪氨酸激酶-受體酪氨酸激酶和非受體激酶二者-對於免疫系統的細胞的激活和增殖是必需的。在肥大細胞、T細胞和B細胞中免疫受體激活後最早可檢測的事件是非受體酪氨酸激酶的刺激。免疫受體例如高親和力IgE受體(FcsRI)、T細胞抗原受體(TCR)和B細胞受體由抗原結合亞基和信號轉導亞基組成。信號轉導鏈包含一個或多個拷貝的免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif)(ITAMS)。對於TCR的激活，通過Lck和Fyn(兩個Src家族酪氨酸激酶)磷酸化位於CD3分子中的ITAMS，然後募集和激活ZAP-70(酪氨酸激酶Syk家族的成員)。然後這些被激活的酪氨酸激酶磷酸化下遊銜接分子(adaptormolecule)例如LAT(用於T細胞激活的連接體(linker))和SLP-76(76KDa的包含SH2結構域的白細胞蛋白)。該步驟導致多個下遊信號轉導分子例如可誘導T細胞激酶(ITK)、PLCyl和PI3激酶的激活(Wong，2005，CurrentOpinioninPharmacology5，l-8)。ZAP-7G(7GkDa的^-相關蛋白)屬於酪氨酸激酶的Syk家族，其與T細胞受體的^亞基相關(Chan等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，9166-9170;Weiss，1993，Cell73，209-212)。ZAP-70主要在T細胞和天然殺傷(NK)細胞中表達，並通過TCR在信號轉導中起著重要的作用。T細胞的TCR介導的激活對於免疫反應是至關重要的。不能充分地調控T細胞的激活可導致變應性疾病和自身免疫性疾病。因此ZAP-70被認為是開發用於T細胞介導的疾病的免疫抑制劑的極具吸引力的靶。已報導了幾種鑑定選擇性ZAP-70抑制劑的方法。Vu提出基於結構設計和合成ZAP-70的串聯Src-同源性2(SH2)結構域的拮抗劑(Vu,2000，Curr.Med.Chem.7(10)，1081-1100)。Nishikawa就結合ZAP-70的能力篩選肽文庫並通過與蛋白質底物竟爭鑑定了抑制ZAP激酶活性的肽(Nishikawa等人，2000，MolecularCell6，969-974)。Moffat使用利用非生理學底物polyGluTyr進行的ZAP-70激酶測定法來鑑定ZAP-70抑制劑(Moffat等人，1999，Bioorg.Med.Chem.Letters9，3351-3356)。此外，報導了與星形孢菌素(Staurosporine)形成的複合物中的ZAP-70激酶結構域的三維結構，該結構被認為是基於結構設計抑制劑的基礎(Jin等人，2004，J.Biol.Chem.279(41)，42818-42825)。儘管已於1991年(Chan等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，9166-9170)發現了ZAP-70及其在TCR信號轉導中的作用並在之後不久其被公認為T細胞介導的疾病的邏輯藥物把，但至今仍然沒有批准ZAP-70的抑制劑作為藥物。對於未能鑑定和開發選擇性ZAP-70抑制劑的一個原因是缺乏有效測定方法來鑑定與ZAP-70(當其存在於激活的T細胞中時)的生理形式相互作用的化合物。鑑於上述內容，存在對提供用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的有效方法以及用於純化ZAP-70的方法的需要。為了滿足該需要，本發明在第一方面提供了用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形體24接觸，c)將氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定化合物是否能夠將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡咬並嘧啶配體24分離。在第二方面，本發明涉及用於鑑定與ZAP-7G相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-7Q複合物形體24和與給定的化合物接觸，和c)檢測步驟b)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-砩酸化的ZAP-70複合物。在第三方面，本發明提供了用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供兩等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使一個等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，c)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使另一等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24和與給定的化合物接觸，和d)確定步驟1))和(;)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。在第四方面，本發明涉及用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供兩個各自包含至少一個含有磷酸化的ZAP-70的細胞的等份，b)將一個等份與給定的化合物一起溫育，c)收穫各等份的細胞，d)裂解細胞以獲得蛋白質製劑，e)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形體24接觸，和f)確定步驟e)中各等份中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。在本發明的上下文中，已令人吃驚地發現氨基吡啶並嘧啶配體24是優先識別磷酸化的ZAP-70的ZAP-70配體(參見圖2)。這使得氨基吡啶並嘧啶配體24能夠用於篩選測定，例如用於竟爭性篩選測定法以及用於純化磷酸化的ZAP-70的方法。在圖1中給出了氨基吡啶並嗜啶配體24的結構。該化合物(7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-曱基-lH-[l，6]萘啶-2-酮)是取代的氨基吡啶並嘧啶化合物。可通過伯氨基將氨基吡啶並嘧啶配體24共價偶聯至合適的固體支持材料並將其用於分離結合的蛋白。在實施例1中描述了氨基吡啶並嘧啶配體24的合成。根據本發明，表述"氨基吡啶並嘧啶配體24"還包括包含核心例如由Klutchko和同事(Klutchko等人，1998，J.Med.Chem.41(17):3276-3292)描述的相同的吡啶並[2，3]嘧啶核心結構的化合物，但該核心具有優選偶聯至氨基(而非成為環狀結構的部分)的另一種連接體，以與固體支持物連接。連接體通常具有8、9或10個原子的主鏈。連接體可包含羧基、羥基或氨基活性基團。因此，優選地，表述"氨基吡啶並嘧啶配體24"還包括具有相同((7-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-lH-[1,6]萘啶-2-酮)核心的化合物，所述核心可以任選地例如用具有例如1-15個碳原子的烷基在7-苯氨基的4位上進行取代，所述化合物可用氨基、羥基或羧基進行取代，並且可以額外地用具有例如1-15個碳原子的垸基在1H-[1，6]萘啶-2-酮的N原子的1H位上進行取代。更優選地，表述"氨基吡啶並嘧啶配體24"還包括具有相同((7-苯氨基)-3-(2,6-二氯-苯基)-lH-[l，6]萘咬-2-酮)核心的化合物，所述核心只在7-苯氨基的4位上用具有例如1-15個碳原子的烷基進行取代，所述化合物可用氨基、幾基或羧基進行取代並且在1H-[1，6]萘啶-2-酮的1H位上可用具有例如1-15個碳原子的烷基進行取代。最優選，稱為"氨基吡啶並嗜啶配體24"的化合物選自(7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-lH-[1，6]萘啶-2-酮)和具有相同的((7-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-lH-[l，6]萘啶-2-酮)核心的化合物，所述核心只在7-苯氨基的4位上用具有例如1-15個碳原子的烷基進行取代，所述化合物可用氨基、羥基或羧基進行取代並且在1H-[1，6]萘啶-2-酮的1H位上可用具有例如1-15個碳原子的烷基進行取代。吡啶並[2，3]嘧啶衍生物最初被描述為受體酪氨酸激酶(血小板衍生的生長因子受體，PDGFR;成纖維細胞生長因子受體，FGFR;表皮生長因子受體，EGFR)和非受體酪氨酸激酶c-Src的ATP竟爭性抑制劑(Klutchko等人，1998，J.Med.Chem.41(17):3276-3292)。後來，報導了PD173955化合物有效地抑制Bcr-Abl融合蛋白和c-Kit受體酪氨酸激酶(Wisniewski等人，2002，CancerResearch62，4244-4255)以及間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase)(ALK)(Gunby等人，2006，J.Med.Chem.49(19):5759-5768)。在化學蛋白組學研究中，發現被固定的吡梵並[2，3-d]嘧咬配體與超過30種的人蛋白激酶相互作用並有效地抑制p38和RICK激酶(Wissing等人，2004，Mol.Cell.Proteomics3(12):1181-1193)。在獨立的蛋白組學研究中，觀察到固定的PD173955化合物與幾種肝配蛋白(ephrin)受體酪氨酸激酶相互作用(WO2006/056467Al)。而另一個出版物顯示該化合物有效地抑制肝配蛋白受體的激酶活性(Caligiuri等人，2006，Chemistry&Biology13，711-722)。根據本發明，表述"ZAP-70"不僅是指圖4中顯示的人蛋白質而且還指其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同源物或由在低嚴格條件下與編碼所述蛋白質的核酸雜交的核酸編碼的變體。優選地，這些低嚴格條件包括在40X:下在包含35%甲醯胺、5xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%BSA、100ug/ml變性鮭精DM和10。/。(重量/體積)硫酸葡聚糖的緩衝液中進行18-20小時的雜交，在55匸下在由2xSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和O.1%SDS組成的緩沖液中進行1-5小時的洗滌，和在60'C下在由2xSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS組成的緩衝液中進行1.5小時的洗滌。在本發明的一些方面，首先提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑。可使用任何蛋白質製劑作為起始材料來進行本發明的方法，只要磷酸化的ZAP-70溶解在該製劑中。實例包括幾種蛋白質的液體混合物、細胞裂解物、不包含存在於原始細胞中的所有蛋白質的部分細胞裂解物或幾種細胞裂解物的組合。可在用特異性抗ZAP-70磷酸化位點例如位點126、292、319、492或493上的磷酸化的酪氨酸殘基的抗體探測的蛋白質印跡上檢測目的蛋白質製劑中磷酸化的ZAP-70蛋白質種類的存在(Watts等人，1994，TheJournalofBiologicalChemistry269(4)，29520-29529)。還可使用抗磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸的抗體。可從商業供應商(例如Upstate或CellSignaling)獲得此類磷酸特異性抗ZAP-70抗體。已描述了此類抗磷酸抗體與蛋白質印跡分析結合用於檢測磷酸化的ZAP-70的用途(Houtman等人，2005，TheJournalofImmunology175(4)，2449-2458)。可以首先通過分離細胞器(例如，細胞核、線粒體、核糖體、高爾基體等)，然後製備來源於這些細胞器的蛋白質製劑來獲得細胞裂解物或部分細胞裂解物。用於分離細胞器的方法在本領域內是已知的(Chapter4.2PurificationofOrganellesfromMammalianCellsin"CurrentProtocolsinProteinScience"，Editors:John.E.Coligan，BenM.Dunn,HiddeLPloegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。此外，可通過分級分離細胞提取物從而富集特定類型的蛋白質例如細胞質蛋白或膜蛋白來製備蛋白質製劑(Chapter4.3SubcellularFractionationofTissueCultureCellsin，，CurrentProtocolsinProteinScience"，Editors:John.E.Coligan,BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。此外可使用來自體液(例如，血液、腦脊液、腹膜液和尿)的蛋白質製劑。例如可使用來源於模式生物例如線蟲的確定的發育階段或成年階段的完全胚胎裂解物。此外，完整的器官例如從小鼠切取的心臟可以是蛋白質製劑的來源。還可在體外灌注這些器官以獲得蛋白質製劑。此外，蛋白質製劑可以是包含重組產生的磷酸化的ZAP-70的製劑。已廣泛地建立了用於在原核和真核細胞中產生重組蛋白質的方法(Chapter5ProductionofRecombinantProteins//7"CurrentProtocolsinProteinScience"，Editors:John.E.Coligan，BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh,DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,1995，ISBN:0-471-14098-8)。在本發明的方法的優選實施方案中，蛋白質製劑的提供包括收穫至少一個包含磷酸化的ZAP-70的細胞和裂解細胞的步驟。ZAP-70蛋白優選在T淋巴細胞和天然殺傷(NK)細胞中表達。因此從外周血分離的細胞代表了合適的生物學材料。用於製備和培養獲自外周血(PBL)的人淋巴細胞和淋巴細胞亞群的方法是眾所周知的(W.EBiddison，Chapter2.2"Preparationandcultureofhumanlymphocytes"inCurrentProtocolsinCel1Biology,1998，JohnWiley&Sons,Inc.)。例如，密度梯度離心是用於將淋巴細胞與其他血液細胞群體(例如紅細胞和粒細胞)分離的一種方法。可通過它們的特異的細胞表面受體(所述受體可被單克隆抗體識別)分離人淋巴細胞亞群。物理分離方法包括將這些抗體試劑偶聯至允許富集被這些抗體結合(陽性選擇)的細胞的磁珠。可進一步培養分離的淋巴細胞，並通過加入抗T細胞受體或共受體例如CD-3的抗體刺激所述淋巴細胞，從而起始T細胞受體信號轉導和隨後ZAP-70的磷酸化(Houtman等人，2005，TheJournalofImmunology175(4)，2449-2458)。作為原代人細胞的另一選擇，可以使用培養的細胞系(例如Jurkat細胞)，並以類似的方式使用抗CD3抗體刺激所述細胞系，從而獲得磷酸化的ZAP-7G(Kim和White,2006，TheJournalofImmunology176(5):2833-2843)。可選擇地，還可以將所述淋巴細胞或細胞系與磷酸酶抑制劑一起溫育以使ZAP-70保持其磷酸化狀態。此類方法在本領域內是已知的(D.C.Weiser和S.Shenolikar，Chapter18.10inC""e/^戶rc^ocoh//7#o7ecw/ar"2'0/0^7，2003，JohnWiley&Sons,Inc.)。在優選實施方案中，細胞是細胞培養系統的部分，用於從細胞培養系統收穫細胞的方法在本領域內是已知的(文獻同上)。細胞的選擇將主要取決於ZAP-70的表達，因為必須確保該蛋白質主要存在於所選擇的細胞中。為了確定給定的細胞是否適用於本發明的方法的合適的起始系統，為了確定給定的目的蛋白是否存在於該細胞中，方法如蛋白質印跡法、基於PCR的核酸檢測法、RM印跡法和DNA微陣列法("DNA晶片")可以是合適的。細胞的選擇還受研究目的影響。如果需要分析給定藥物的體內功效，那麼可選擇其中發生希望的療效的細胞或組織(例如T細胞、NK細胞或ZAP-70陽性CLL細胞)。相反地，為了闡明蛋白質耙介導不想要的副作用，可分析其中觀察到所述副作用的細胞或組織(例如骨髓、胸腺)。此外，預想在本發明內，可例如通過活組織檢查從生物體獲得包含磷酸化的ZAP-70的細胞。相應的方法在本領域內是已知的。例如，活組織檢查是用於獲得少量組織之後可通過顯微鏡或使用生物化學方法檢查的組織的診斷方法。活組織檢查不僅對於疾病的診斷、分類和分期而且對於藥物治療的評估和監測是非常重要的。在收穫至少一個細胞的同時進行裂解包括在本發明中。然而，同樣優選首先收穫細胞，然後分開裂解。用於裂解細胞的方法在本領域內是已知的(Karwa和Mitra:Samplepreparationfortheextraction,isolation,andpurificationofNucleiAcids;chapter8in"SamplePreparationTechniquesinAnalyticalChemistry"，Wiley2003，編輯SomenathMitra，印刷ISBN:0471328456;在線ISBN:0471457817)。可通過勻漿器(例如Potter-homogenizer)、超聲粉碎機、酶促裂解、去汙劑(例如NP-40、TritonX-IOO、CHAPS、SDS)、滲透壓休克(osmoticshock)、反覆凍融或這些方法的組合實現不同細胞類型和組織的裂解。根據本發明的方法，在允許氨基吡啶並嘧啶配體24磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸。在本發明中，術語"氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物"表示其中氨基吡啶並嗜啶配體24通過例如共價鍵或最優選通過非共價結合與ZAP-70相互作用的複合物。本領域技術人將知道可應用什麼條件以使氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物能夠形成。在本發明的上下文中，術語"在允許複合物形成的條件下"包括在其下此類形成，優選此類結合是可能的所有條件。這包括使固體支持物在固定相上和使裂解物流至其上的可能性。在另一個優選實施方案中，還包括，固體支持物以微粒的形式存在且與細胞裂解物混合。在非共價結合的背景中，氨基吡啶並嗜啶配體24和磷酸化的ZAP-70之間的結合是例如通過鹽橋、氫鍵、疏水相互作用或其組合進行的。在優選實施方案中，在大體上生理條件下進行形成氨基吡啶並嘧啶配體24一磷酸化的ZAP-70複合物的步驟。在Petty,1998(HowardR.Petty1,Chapter1，Unit1.5in:JuanS.Bonifacino,MaryDassoJoeB.Harford,JenniferLippincott-Schwartz，和KennethM.Yamada(eds.)C"rre/7t戶rofoco/s//Ce"萬2'o7c^7Copyright2003JohnWiley&Sons,Inc.保留所有；^又利。腿10.1002/0471143030.cb0101s00在線公布日期2001年5月，印刷出版日期1998年10月)中描述了細胞內蛋白質的物理狀態。在大體上生理條件下的接觸具有以下優點，即配體、細胞製劑(即待表徵的酶)和任選地化合物之間的相互作用儘可能地反映天然條件。除其他以外，"大體上生理條件"尤其是那些存在於原始的、未處理的樣品材料中的條件。它們包括生理蛋白質濃度、pH、鹽濃度、緩衝能力和所涉及的蛋白質的翻譯後修飾。術語"大體上生理條件"不需要與樣品所來源的原始活生物體中的條件完全相同的條件，但需要大體上類細胞(cel卜like)的條件或與細胞條件相近的條件。當然本領域技術人員將認識到，由於實驗設置的原因可產生某些限制，這最終將導致與類細胞條件少許不同。例如，當從活生物體取樣和處理樣品時細胞壁或細胞膜的最終必需的破裂可能需要與生物體中所見的生理條件不同的條件。實施本發明的方法的生理條件的合適的變化對於本領域技術人員來說是很顯然的，所述變化包括在本文所使用的術語"大體上生理條件"內。概而言之，應理解，術語"大體上生理條件"涉及接近於例如在天然細胞中發現的生理條件的條件，但不需要要求這些條件完全一致。例如，"大體上生理條件"可包含50-200mMNaCl或KC1、pH6.5-8.5、20-45t:和0.001-10mM二價陽離子(例如Mg++、Ca++，);更優選大約150mNaCl或KC1、pH7.2至7.6、5mM二價陽離子和通常包括0.01-1.0%的非特異性蛋白質(例如BSA)。非離子型去汙劑(Tween、NP-40、Triton-XlOO)通常可以以通常大約0.001至2°/。，典型地0.05-0.2%(體積/體積)的濃度存在。對於一般指導，可使用下列緩沖水性條件10-250mMNaCl、5-50mMTrisHC1、pH5-8，任選地加入二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子去汙劑。優選，"大體上生理條件"是指6.5至7.5，優選7.0至7.5的pH,和/或10至50mM，優選25至50mM的緩沖液濃度，和/或120至170mM，優選150mM的一價鹽(例如Na或K)濃度。二價鹽(例如Mg或Ca)還可以以l至5mM，優選1至2mM的濃度存在，其中更優選地緩沖液選自Tris-HCl或HEPES。在本發明的上下文中，氨基吡啶並嘧啶配體24被固定在固體支持物上。在整個發明中，術語"固體支持物"涉及每一種能夠將小分子配體固定在其表面上的不溶性支持物。根據其他優選實施方案，固體支持物選自瓊脂糖、修飾的瓊脂糖、sepharose珠粒(例如NHS激活的sepharose)、膠乳(latex)、纖維素和亞鐵化合物顆粒或鐵磁性顆粒。可共價地或非共價地將氨基吡啶並嗜啶配體24偶聯至固體支持物。非共價結合包括通過生物素親和配體與鏈黴抗生物素蛋白基質(steptavidinmatrice)結合的結合。優選，將氨基吡啶並嘧啶配體24與固體支持物共價偶聯。在偶聯前，基質可包含活性基團例如NHS、碳二亞胺等以使能夠與氨基吡啶並嘧啶配體24產生偶聯反應。可通過直接偶聯(例如使用官能團例如氨基、巰基、羧基、羥基、醛基和酮基)和通過間接偶聯(例如通過生物素、共價連接至氨基吡啶並嘧啶配體24的生物素以及生物素與直接結合至固體支持物的鏈黴抗生物素的非共價結合)將氨基吡啶並嘧啶配體24偶聯至固體支持物。與固體支持物材料的連接可包括可切割的和不可切割的連接體。可通過酶促切割或用合適的化學方法處理來實現切割。將氨基吡啶並嘧啶配體24與固體支持物材料結合的優選結合界面是具有碳原子主鏈的連接體。連接體通常具有8、9或10個原子的主鏈。連接體包含羧基或氨基活性基團。本領域技術人員將認識到，在本發明的方法的單個步驟之間，可能需要洗滌步驟。這樣的洗滌是本領域技術人員的知識的一部分。洗滌用於從固體支持物除去未結合的細胞裂解物的組分。可通過加入低水平的去汙劑或通過對洗滌緩衝液中的鹽濃度進行適度的調整來使非特異性(例如單純的離子)結合相互作用減少至最低程度。根據本發明的鑑定方法，讀出系統是磷酸化的ZAP-70的檢測或確定(本發明的第一方面)、氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的檢測(本發明的第二方面)或氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量的確定(本發明的第二、第三和第四方面)。在根據本發明的第一方面的方法中，分離的磷酸化的ZAP-70的檢測或確定優選表明化合物能夠將磷酸化的ZAP-70從固定的aminopyrimidin配體24分離的事實。該能力表明各個化合物與ZAP-70相互作用，優選與之結合，這表明了其治療潛能。在根據本發明的第二方面的方法的一個實施方案中，檢測在本發明方法的過程中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物。形成此類複合物的事實優選表明化合物不完全抑制複合物的形成。另一方面，如果沒有形成複合物，則化合物是假定的與ZAP-70的強相互作用子(interactor)，這表明了其治療潛能。根據本發明的笫二、第三和第四方面，確定在方法過程中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。一般說來，在各個化合物存在的情況下形成的複合物越少，各個化合物與磷酸化的ZAP-70的相互作用越強，這表明了其治療潛能。可通過使用標記的抗磷酸化的ZAP-70的抗體和合適的讀出系統進行根據本發明的第二方面的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的檢測。根據本發明的笫二方面的優選實施方案，通過確定其量來檢測氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物。在本發明的第二、第三和笫四方面的過程中，優選將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡咬並嘧咬配體24分離以確定氨基吡咬並嘧咬配體24-磷酸化的ZAP-70復令物的量。根據本發明，分離表示破壞氨基吡啶並嘧啶配體24和磷酸化的ZAP-70之間的相互作用的每一個操作。這包括在優選實施方案中將磷酸化的ZAP-70從固定的氨基吡啶並嘧咬配體24洗脫。通過使用下面詳細描述的非特異性試劑(離子強度、pH值、去汙劑)實現洗脫。此外，可檢測目的化合物是否可特異性地將磷酸化的ZAP-70從氨基吡啶並嘧啶配體24洗脫。在下面部分進一步描述此類與ZAP-70相互作用的化合物。的，其取決於配體酶的相互作用的性質。原則上，離子^度、pH值、溫度的改變或與去汙劑的溫育是將耙酶與固定的配體分離的合適方法。洗脫緩衝液的應用可通過極端pH值(高或低pH;例如通過使用0.1M檸檬酸鹽(pH2-3)降低pH)、離子強度的改變(例如使用Nal、KI、MgCl2或KC1的高鹽濃度)、破壞疏水相互作用的極性還原劑(例如二噁烷或乙二醇)或變性劑(離液鹽或去汙劑例如十二烷基硫酸鈉，SDS;Review:SubramanianA.，2002，Immunoaffintychromatography)來分離結合伴侶。在一些情況下，優選必須將固體支持物與釋放的材料分離。用於該目的的單獨的方法取決於固體支持物的性質，所述方法在本領域內是已知的。如果支持物材料包含在柱中，則可將釋放的材料收集為柱流出液(columnflowthrough)。在將支持物材料與裂解物組分混合(所謂的分批方法)的情況下，可能需要額外的分離步驟例如溫和的離心，且釋放的材料收集為上清液。可選擇地，磁珠可用作固體支持物，以便可通過使用磁性裝置將珠粒從樣品中除去。在根據本發明的第一方面的方法的步驟d)中，確定是否已將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離。這可以包括磷酸化的ZAP-70的檢測或磷酸化的ZAP-70的量的確定。因此，至少在本發明的所有鑑定方法的優選實施方案中，使用用於檢測分離的磷酸化的ZAP-70或用於確定其量的方法。此類方法在本領域內是已知的且包括物理化學方法例如蛋白質測序(例如Edmann降解)、通過質傳法進行的分析或使用抗磷酸化的ZAP-70的抗體的免疫檢測方法。優選地，通過質鐠法或免疫檢測法檢測磷酸化的ZAP-70或確定磷酸化的ZAP-70的量。使用質譜分析(質譜法)進行的蛋白質的鑑定在本領域內是已知的(Shevchenko等人，1996，AnalyticalChemistry68:850-858，(Mann等人，2001，Analysisofproteinsandproteomesbymassspectrometry,AnnualReviewofBiochemistry70，437-473)且在實施例部分進行了進一步的舉例說明。優選地，以定量的方式例如通過使用iTRAQ技術(同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequatification))或cICAT(可切割的同位素親合標籤(cleavableisotope-codedaffinitytag))(Wu等人，2006.J.ProteomeRes.5，651-658)進行質傳分析。根據本發明的其他優選實施方案，通過鑑定磷酸化的ZAP-70的原生肽(proteotypicpeptides)來進行通過質鐠(MS)的表徵。設想是，用蛋白酶消化磷酸化的ZAP-70,並通過MS確定所得的肽。因此，來自相同來源蛋白質的肽的肽頻率存在很大程度的不同，最常見的"通常"幫助鑑定該蛋白質的肽稱為"原生肽"。因此，本發明中白質同種型(proteinisoform)的肽。根據優選實施方案，通過將在實施本發明的方法的過程中獲得的原生肽與已知的原生肽比較來進行表徵。由於當使用通過蛋白酶消化製備的片段來鑑定MS中的蛋白質時，通常對給定的酶觀察到相同的原生肽，因此可以就給定的酶種類的酶比較對於給定的樣品獲得的原生肽與已知的原生肽，從而鑑定存在於樣品中的酶。作為質譜分析的另一選擇，可通過使用抗磷酸化的ZAP-70的特異性抗體，優選用識別磷酸化的ZAP-70的位點493上的酪氨酸磷酸化的抗體檢測洗脫的磷酸化的ZAP-70(包括共洗脫的結合伴倡或支架蛋白)或確定其量。此類抗體在本領域內是已知的(CellSignalingTechnologies,#2704)。由於氨基吡啶並嘧啶配體24優先識別磷酸化的ZAP-70,因此也可以使用識別ZAP-70上的非磷酸化表位的抗ZAP-70抗體。此外，在另一個優選實施方案中，一旦已通過質語分析建立共洗脫的結合伴侶的鑑定，使用抗該蛋白的特異性抗體檢測各結合伴倡。合適的基於抗體的檢測包括但不限於蛋白質印跡、ELISA測定、夾心ELISA測定和抗體陣列或其組合。此類測定的建立在本領域內是已知的(Chapter11，Immunology,pagesll-lto11-30in:ShortProtocolsinMolecularBiology.第4版，由F.M.Ausubel等人編著，Wiley,NewYork,1999)。不僅可以以檢測和定量與ZAP-70相互作用的目的蛋白(例如另一種激酶例如其為ZAP-70的底物的LAT)的方式而且還可以以分析翻譯後修飾模式例如泛素修飾的方式設計此類測定。此外，本發明的鑑定方法包括就它們作為與ZAP-70相互作用的化合物的能力對其進行檢測的化合物的用途。原則上，根據本發明，此類化合物可以是能夠例如通過抑制ZAP-70與氨基吡啶並嘧啶配體24結合而與ZAP-70相互作用的每一種分子。優選地，化合物對ZAP-70具有影響，例如刺激或抑制效應。優選地，所述化合物選自合成的或天然存在的化合物或有機合成的藥物，更優選小分子、有機藥物或天然小分子化合物。優選地，所述化合物從包含此類化合物的文庫開始進行鑑定。然後，在本發明的過程中，篩選此類文庫。此類小分子優選地不是蛋白質或核酸。優選地，小分子展示低於1000Da，更優選低於750Da，最優選低於500Da的分子量。根據本發明的"文庫"涉及以分類方式提供的(許多)不同化學實體的集合體(通常很大)，所述分類方式使得能夠對不同的個體實體進行快速功能分析(篩選)，並同時提供對形成文庫的個體實體的快速鑑定。實例是在表面上包含化合物的管或孔或斑的集合體，所述化合物可以高通量的方式加入至與一種或多種確定的潛在相互作用伴倡的反應。在鑑定兩個伴倡的希望的"陽性"相互作用後，歸因於文庫構建，可快速鑑定各個化合物。可由本領域技術人員購買或設計合成的和天然來源的文庫。在例如BreinbauerR，MangerM，ScheckM，WaldmannH.Naturalproductguidedcompoundlibrarydevelopment.CurrMedChem.2002Dec;9(23):2129-45中提供了文庫構建的實例，其中描述了在生物學上被證明為組合文庫的設計起點的天然產物，因為它們具有已證明的生物學相關性的記錄。根據通過結構生物學和生物信息學獲得的關於蛋白質的結構域結構的新見解，可以解釋天然產物在藥物化學和化學生物學中的該特殊作用。為了滿足結構域家族中個體結合袋的特定要求，可能需要通過化學變化來最優化天然產物的結構。固相化學被認為是該最優化過程的有效工具，在這一綜述論文中突出強調了該領域內的最新進展。其他相關參考文獻包括EdwardsPJ，MorrellAI.Solid—phasecompoundlibrarysynthesisindrugdesignanddevelopment.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002Jul;5(4):594-605.;MerlotC,DomineD，ChurchDJ.Fragmentanalysisinsmallmoleculediscovery.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002May;5(3):391-9.綜述；Good謂RAJr.Currentpracticesingenerationofsmallmoleculenewleads.JCellBiochemSuppl.2001;Suppl37:13-21;其描述了在許多製藥公司中目前的藥物發現過程需要大量和不斷增加的高質量引導物結構(leadstructure)的集合體以用於高通量篩選測定。過去，通過幾種方法通過之前內部引導物最優化成就的檔案、通過從化合物賣家購賣和通過在公司合併後結合各自的集合體來獲得具有不同結構和"類藥"(drug-like)性質的小分子的集合體。儘管高通量/組合化學被描述為新引導物產生過程中的重要組成部分，但用於合成的文庫設計和隨後文庫成員的設計的選擇已演化至新的挑戰和重要性水平。篩選多個針對多個生物學靶的小分子化合物文庫設計的潛在益處提供了大量發現新引導物結構的機會。在本發明的第二方面的優選實施方案中，首先將磷酸化的ZAP-70與化合物一起溫育，然後再與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24—起溫育。優選地，首先將磷酸化的ZAP-70與化合物在4'C至37'C，更優選4。C至25X:，最優選4。C下溫育10至60分鐘，更優選30至45分鐘。優選地，以1juM至1mM，優選10至100jaM的濃度使用化合物。笫二步驟，接觸固定的配體，優選地在4'C下進行IO至60分鐘。此外，可使用幾種蛋白質製劑進行本發明的第二方面的步驟a)至c)以檢測不同的化合物。該實施方案在中等或高通量篩選中特別吸引人(參見下文)。在根據第三或第四方面的本發明的方法的優選實施方案中，將步驟c)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量與步驟b)中形成的量相比較。在根據第三或第四方面的本發明的方法的優選實施方案中，與步驟b)相比，步驟c)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的減少的量表明磷酸化的ZAP-70是化合物的耙。該結果是由這樣的事實引起的，即在本發明的該方法的步驟c)中，化合物與配體竟爭結合磷酸化的ZAP-70。如果在與化合物一起溫育的等分中存在更少的磷酸化的ZAP-70,則這優選表示化合物已與抑制劑竟爭與酶的相互作用，因此是酶的直接的靶，反之亦然。優選地，以中等或高通量篩選的形式進行本發明的鑑定方法。通過確定其是否對ZAP-70活性(例如對其激酶活性)具有影響來進一步表徵根據本發明鑑定的相互作用的化合物(Isakov等人，TheJournalofBiologicalChemistry271(26)，15753-15761)。還可通過在基於細胞的測定中使用T細胞系或原代T細胞測量其是否影響T細胞受體(TCR)信號轉導來表徵根據本發明鑑定的相互作用化合物。通過TCR信號轉導起始的細胞激活作為一系列分子事件的結果發生，所述分子事件包括CD3^(CD3C)鏈的酪氨酸磷酸化、ZAP-70的募集、磷脂酶y(PLCy)的磷酸化、肌醇1，4，5-三磷酸的產生和釣貯備從內質網至細胞質的釋放。已描述了用於在TCR刺激後使用針對胞質釣的螢光指示劑測量細胞內鈣釋放的方法(Mein1等人，2000，J.Immunol.165(7):3578-3583)。根據經典TCR信號轉導模型，CD3^鏈和ZAP-70是Lck激酶的底物，而SLP76、LAT和PLCy是ZAP-70的下遊(Schwartzberg等人2005，Nat.Rev.Immunology5，284-295)。通過用特異性抗磷酸酪氨酸抗體檢測下遊耙的特異性磷酸化事件來評估ZAP-70的活性。例如，ZAP-70在位點191的酪氨酸殘基上磷酸化"用於T細胞激活的連接體"(LAT)蛋白，這可通過抗pTyrl91抗體檢測(Houtman等人，2005，J.Immunol.175(4):2449-2458)。該測定可用作ZAP-70活性的讀出或用於測量與ZAP-70相互作用的化合物對激酶ZAP-70的活性的影響。可進一步最優化(引導物最優化)根據本發明鑑定的化合物。由於這些引導物產生文庫(leadgenerationlibrary)中編碼的結構-活性關係(SAR)信息，通常加速此類化合物的該隨後最優化。歸因於用於追蹤合成(follow-upsynthesis)的高通量化學(HTC)方法的即時可應用性，通常促進引導物最優化。在WakelingAE，BarkerAJ，DaviesDH，BrownDS，GreenLR，CartlidgeSA，WoodburnJR.Specificinhibitionofepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseby4一anilinoquinazolines.BreastCancerResTreat.1996;38(1):67-73中描述了此類文庫和引導物最優化的一個實例。本發明還涉及用於製備藥物組合物的方法，該方法包括步驟a)如上所述鑑定與ZAP-70相互作用的化合物，和b)將相互作用化合物配製成藥物組合物。因此，本發明提供了用於製備可以以有效量施用給受試者的藥物組合物的方法。在一個優選方面，基本上純化治療劑。待治療的受試者優選是動物，包括但不限於動物例如牛、豬、馬、雞、貓、狗等，優選是哺乳動物，最優選是人。在特定的實施方案中，非人哺乳動物是受試者。根據本發明鑑定的化合物用於預防或治療其中ZAP-70起作用的疾病，例如免疫性或自身免疫性疾病或由T淋巴細胞介導的病症。此類疾病或病症包括哮喘、類風溼性關節炎、牛皮癬、炎性腸病(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)、多發性硬化症和器官或組織同種異體移植物或異種移植物的急性或慢性排斥。此外，本發明的化合物可用於治療ZAP-70陽性B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)。一般而言，本發明的藥物組合物包含治療有效量的治療劑和藥學上可接受的載體。在特定的實施方案中，術語"藥學上可接受的"是指由聯邦或州政府的管理機構批准的或美國藥典或其他公認的藥典中所列的用於動物，更特別地用於人的。術語"載體"是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥物載體可以是無菌液體例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，包括但不限於花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當口服施用藥物組合物時，水是優選載體。當靜脈內施用藥物組合物時生理鹽水和水性葡萄糖是優選載體。生理鹽水溶液和水性葡萄糖以及甘油溶液優選用作用於注射液的液體栽體。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠，麥芽，米，麵粉，白堊(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果想要，組合物還可包含少量潤溼劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以以溶液、懸浮液、乳劑、片劑、藥丸、膠嚢、粉劑、持續釋放製劑等形式存在。可將組合物與常規的粘合劑和載體例如甘油三酯一起配製為栓劑。口服製劑可包含標準載體例如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酯鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在由E.W.Martin編著的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述了合適的藥物載體的實例。此類組合物包含治療有效量的治療劑，優選以純化的形式存在，與合適量的載體一起，以提供用於患者的恰當施用的形式。製劑應當適合施用的模式。在優選實施方案中，按照常規方法將組合物配製為適合用於人靜脈內施用的藥物組合物。通常，用於靜脈內施用的組合物是無菌等滲含水緩衝液中的溶液。當必要時，組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因以在注射部位減輕疼痛。一般而言，分開地提供組分或將其混合以單位劑型(例如作為標明活性劑的量的密封容器例如安瓿或sachette中凍幹的粉劑或無水濃縮劑)提供。當通過輸注施用組合物時，可將其分散至裝有無菌藥物級水或生理鹽水的輸注瓶。當通過注射施用組合物時，可提供用於注射的無菌水或生理鹽水的安瓿以便在施用之前可將組分混合。本發明的治療劑可配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與游離羧基例如來源於鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的羧基形成的鹽，與游離胺基例如來源於異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的胺基形成的鹽和來源於氫氧化鈉、鉀、銨、鈣和鐵等的鹽。在治療特定病症或病況中有效的本發明的治療劑的量將取決於病症或病況的性質，其可通過標準臨床技術來確定。此外，體外測定可任選地用於幫助鑑定最佳劑量範圍。製劑中使用的精確劑量還取決於施用途徑和疾病或病症的嚴重性，應當按照醫生的判斷和各患者的情況來確定。然而，用於靜脈內施用的合適的劑量範圍通常為大約20-500毫克活性劑/千克體重。用於鼻內施用的合適的劑量範圍通常為大約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。可從來源於體外或動物模型試驗系統的劑量響應曲線推斷出有效劑量。通常，栓劑可包含按重量計算0.5%至10%的範圍內的活性組分；口服製劑優選包含10%至95%的活性組分。各種遞送系統是已知的且可用於施用本發明的治療劑，例如脂質體、微粒和微膠嚢中的封裝能夠表達治療劑的重組細胞的使用、受體介導的內吞作用的使用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432);作為逆轉錄病毒或其他載體的部分的治療性核酸的構建等。導入的方法包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。可通過任何方便的途徑例如通過輸注，快速濃注(bolusinjection)、通過經由上皮或黏膜襯(例如，口腔黏膜、直腸黏膜和腸黏膜等)的吸收施用化合物，且可將所述化合物與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身性的或局部性的。此外，可能希望通過任何合適的途徑(包括腦室內和鞘內注射)將本發明的藥物組合物導入中樞神經系統；可通過例如附著至貯器例如奧馬耶貯器的腦室內導管幫助腦室內注射。還可例如通過使用吸入器或噴霧器和具有霧化劑的製劑進行肺部給藥(Pulmonaryadministration)。在特定的實施方案中，可能希望將本發明的藥物組合物局部施用至需要治療的區域。這可以通過例如(但不限於)手術期間的局部輸注、手術後例如與傷口敷劑(wounddressing)結合的局部敷用、通過注射、通過導管、通過栓劑或通過植入物來實現，所述植入物是多孔的、無孔的或凝膠狀材料，包括膜例如矽橡膜(sialasticmembranes)或纖維。在一個實施方案中，可通過在惡性腫瘤或瘤(neoplastic)組織或肺瘤前組織(pre-neoplastictissue)的位置(或之前的位置(formersite))上的直接注射來進行施用。在其他實施方案中，可在媒介物特別地在脂質體中遞送治療劑(Langer，1990，Science249:1527-1533)。在另一個實施方案中，可通過控釋系統遞送治療劑。在一個實施方案中，可使用泵(Langer，supra)。在另一個實施方案中，可將控釋系統置於治療靶即腦的附近，從而只需要全身性劑量的一部分。本發明還涉及用於純化磷酸化的ZAP-70的方法，該方法包括步a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，和c)將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離。如上所述，令人吃驚地發現氨基吡啶並嘧啶配體24是識別磷酸化的ZAP-70的配體。這使得能夠產生磷酸化的ZAP-70的有效純化方法。對於磷酸化的ZAP-70,包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑、用於與氨基吡啶並嘧啶配體24接觸的條件、固定的氨基吡啶並嘧啶配體24、氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物、磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24的分離以及磷酸化的ZAP-70的檢測或其量的確定、上述用於本發明的鑑定方法的實施方案也用於本發明的純化方法。在一個優選實施方案中，本發明的純化方法還包括在步驟c)後鑑定能夠結合磷酸化的ZAP-70的蛋白質。當在大體上生理條件下進行複合物的形成時這特別吸引人，因為之後其可以保持酶的天然狀況(包括結合伴侶、酶亞基的存在或翻譯後修飾的存在)，所述狀況之後可藉助質譜(MS)來鑑定。因此，在一個優選實施方案中，本發明的純化方法還包括在步驟c)後，確定磷酸化的ZAP-70是否還例如通過泛素修飾來進行進一步的翻譯後修飾。本發明還涉及氨基吡啶並嘧啶配體24用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物和純化磷酸化的ZAP-70的用途。上面定義的實施方案也用於本發明的這些用途。已描述了ZAP-70是代表B細胞惡性腫瘤的慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的診斷標記(Hamblin和Hamblin,2005，ExpertOpinioninTherapeuticTargets9(6):1165-1178)。最初通過免疫球蛋白可變區基因的突變狀態來區分CLL亞型，但現在已確立，可通過ZAP-70的表達來鑑定CLL亞型。ZAP-70激酶通常在T細胞而非B細胞中表達。因此，氨基吡啶並嘧啶配體24是診斷CLL的亞型或通過確定CLL患者將遭受晚期疾病的可能性來預後疾病進程的重要工具。因此，在其他方面，本發明還涉及氨基吡啶並嘧啶配體24用於製備用於慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的診斷劑的用途。本發明還涉及用於CLL的診斷/預後的方法，該方法包括確定磷酸化的ZAP-7Q在樣品中的存在/與ZAP-7G的總量相比磷酸化的ZAP-70的量的步驟，其中與來自CLL患者的樣品中的ZAP-7Q的總量(非磷酸化的+磷酸化的ZAP-70)相比磷酸化的ZAP-70的增加的量表示就CLL的侵襲形式而言具有更高的可能性。在本說明書中，樣品是來源於受試者的蛋白製劑。因此，上述關於來源於受試者的蛋白質製劑的所有實施方案也用於本發明的該方面。在本發明的診斷方法的一個優選實施方案中，通過上述方法例如通過MS或藉助於特異性抗體確定磷酸化的ZAP-70和總ZAP-70的存在或量。然後，比較各個量。根據本發明，"受試者"是指任何哺乳動物，優選人。可如上所述確定磷酸化的ZAP-70的量。在本發明的說明書中，"診斷"指現存疾病的診斷以及給定的受試者具有超過50%的可能性發展各個疾病的預後。通過下列圖表和實施例進一步舉例說明本發明，所述圖表和實施例不認為是對由本申請的權利要求賦予的保護範圍的限定。附圖概述圖1:氨基吡啶並嘧啶配體24的結構。游離的氨基可用於共價偶聯至固體支持物材料。圖2:用固定的氨基吡啶並嘧啶配體24和蛋白質印跡分析的藥物下拉(pulldown)實驗。使用從未處理或過釩酸鹽處理的Jurkat細胞製備的細胞裂解物作為生物材料。如實施例2中所述用包含50mg蛋白質的裂解物樣品進行藥物下拉實驗。在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離加入裂解物，流出物(非結合級分)和SDS-洗脫物(結合級分)，並且轉移至膜。首先用普通抗ZAP-70抗體(2A)探測印跡，然後用抗磷酸ZAP-70抗體(2B)探測印跡。用螢光染料標記第二檢測抗體以使用Odyssey紅外成像系統進行檢測。來自未處理的Jurkat細胞的裂解物(泳道1至3):泳道l:裂解物對照，未經歷藥物下拉實驗泳道2:流出物(未結合級分)泳道3:洗脫物(SDS-洗脫的結合級分)來自過釩酸鹽處理的Jurkat細胞的裂解物(泳道4至6):泳道4:裂解物對照，未經歷藥物下拉實驗泳道5:流出物(未結合級分)泳道6:洗脫物(SDS-洗脫的結合級分)2A:用普通ZAP-70抗體(L1E5，抗圍繞人ZAP-70的氨基末端部分的殘基的小鼠單克隆抗體，CellSignaling#2709)探測的上方印跡。2B:用磷酸-ZAP-7G抗體(磷酸-ZAP-70Tyr493，Cel1Signaling#2704)探測的下方印跡。圖3:用固定的氨基吡啶並嘧啶配體24的藥物下拉實驗以用於蛋白質和磷酸肽的質i普分析。用SDS樣品緩衝液洗脫與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24結合的蛋白質，然後通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。顯示用考馬斯藍染色後的蛋白質凝膠。切取標示的凝膠區域作為凝膠切片，然後使蛋白經歷通過質語進行的分析。ZAP-70的位置在凝膠切片10和10a中。圖4:鑑定的ZAP-70的肽。以粗體類型和下劃線展示由人ZAP-70序列(IPI00329789.5，628個胺基酸)的質譜分析鑑定的肽。圖5:用於與ZAP-70相互作用的化合物的鑑定的測定法。如實施例3中所述進行實驗。通過固定的氨基吡啶並嘧咬配體24從Jurkat細胞裂解物(過礬酸鹽處理的Jurkat細胞)捕獲ZAP-70蛋白，然後通過標示的化合物洗脫。將洗脫物轉移至硝酸纖維素膜，用Odyssey紅外成像系統檢測ZAP-70。一抗抗磷酸ZAP-70(Tyr493)。二抗山羊抗兔Irdye800CW。顯示相對Odyssey單位。用於洗脫的化合物SDS，最大洗脫的陽性對照；DMS0，溶劑對照；配體24,氨基吡啶並嘧啶配體24;星形孢菌素；JNK抑制劑SP600125;p38抑制劑SB202190。圖6:通過向細胞裂解物加入化合物進行的化合物鐠的表徵(compoundprofiling)(實施例4)。以不同的濃度向Jurkat細胞加入受試化合物，然後與親和基質一起溫育，並分析捕獲的蛋白質。A:使用特異性抗體和Odyssey成像系統檢測和定量ZAP-70和Lck蛋白質。25jug細胞裂解物用作對照。B:受試化合物CZC15497的劑量響應曲線。圖7:通過將化合物與活細胞一起溫育進行的化合物語的表徵(實施例4)。將Jurkat細胞與不同濃度的受試化合物一起溫育30分鐘，然後使用過釩酸鹽處理細胞30分鐘。製備細胞裂解物，與親和基質混合，並分析捕獲的蛋白質。A:使用特異性抗體和Odyssey成像系統檢測和定量ZAP-70和Lck蛋白質。25Mg細胞用作對照。B:受試化合物CZC15497的劑量響應曲線。圖8:在基於細胞的釣釋放測定中進行的化合物CZC15497的檢測。使用用抗CD3抗體激活的Jurkat細胞(密度l.5x1(^個細胞/ml)通過流式細胞測定法實時測量釣的釋放。將4丐釋放的抑制對化合物濃度作圖。獲得O.24laM的ICs。值。如實施例5中所述進行該實驗。實施例1:親和基質的製備本實施例舉例說明用於親和捕獲來自細胞裂解物的激酶的親和基質的製備。使用氨基官能團通過共價連接將捕獲配體共價固定在固體支持物上。該親和基質用於實施例2和實施例3。氨基吡啶並嘧啶配體24:7-(4-氨曱基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-lH-[l，6]萘啶-2-酮的合成如Klutchko，S.R,等人，1998,JournalofMedicinalChemistry41，3276-3292中所述進行合成的前七個步驟。如下所述進行剩下的步驟。步驟l-7:按照/.Vetf.C/e邁.1998，W,3276-3292中的方法從4-氯-2-甲磺醯基(methylsulfanyl)-5-嘧啶羧酸乙酯合成6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺醯基-8-甲基-8^吡啶並[2，3-d嘧啶-7-酮。步驟8:{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-1，2-二氬-[1，6]萘啶-7基氨基]苯基}-氨基甲酸叔丁酯將6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺醯基-8-甲基-8#-吡啶並[2，3-^1嘧咬-7-酮(0.100g，0.2mmol)和3-(戶Boc-甲氨基)苯胺(0.421g，2.Ommol)以固體形式混合，加熱至140°C進行30分鐘。將粗反應混合物溶解於二氯甲烷中，用2NHC1(水性)洗滌2次。用無水硫酸鎂乾燥有機層，進行過濾和濃縮。從熱的乙酸乙酯再結晶粗產物以提供作為黃色固體的{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-l-曱基-2-氧-l，2-二氫-[1，6〗萘啶-7-基氨基]苯基)-氨基甲酸叔丁酯(0.031g-25%)。2HNMR(DMS0-《)510.18(s，1H);8.83(s,1H);7.76(d，2H);7.58(d，2H);7.46(dd，1H);7.32(brt，1H);7.23(d，2H);4.10(d，2H);3.66(s,3H);1.40(s，9H).LCMS:方法A，RT-5.60分鐘。步驟9:7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氟-笨基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮將{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-l，2-二氫-[1，6]萘啶-7-基氨基]苯基}-氨甲酸叔丁酯(0.026g，0.05mmol)溶解於甲醇(3ml)中，並加入鹽酸(4N於二噁烷中，1.2ml)。在室溫下攪拌反應物進行1.5小時，此時HPLC顯示無剩餘起始材料。在真空中除去溶劑。將殘留物溶解在水中，用碳酸鈉(飽和的，水性)鹼化溶液。收集所得的沉澱，並乾燥以提供作為黃色固體的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-曱基-lH-[1，6]萘啶-2-酮(0.021g-100%)。NMR(DMS0-cOS10.20(brd，1H);8.83(d，1H);7.90(d，1H);7.76(d，1H);7.72(d，1H);7.60(dd，2H);7.47(ddd，1H);7.33(d，1H);7.24(d，1H);4.07(d，2H);3.66(s，3H)。LCMS:方法A，RT-4.44分鐘，[MH+-426]。在惰性氣氛下進行所有反應。在Brukerdpx400上獲得NMR光譜。使用zorbaxSBC-18,4.6mmxl50mm-5ja柱在Agilent1100上進行LCMS。柱流為lml/分鐘，所使用的溶劑是水和乙腈(0.1%TFA)，注射體積為IOW。波長為254和210nm。下面描述方法。表1:分析方法tableseeoriginaldocumentpage32表2:用於化學方案的縮寫tableseeoriginaldocumentpage33)包含胺基的配體的固定用無水DMSO(二甲基亞碸，Fluka，41648，H20<=0.005°/。)平衡NHS-活化的Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,17-0906-01)。將lml沉積的珠粒置於15mlFalcon管中，加入化合物原液(通常100mM於DMF或DMSO中)(終濃度0.2-2^mol/ml珠粒)和15jil三乙胺(Sigma,T-0886,99%的純度)。在黑暗中在室溫下於立式圓筒(end-over-end)振蕩器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上溫育珠粒，進行16至20小時。通過HPLC確定偶聯效率。通過在室溫下於立式圓筒振蕩器上與氨基乙醇一起溫育過夜來封閉未反應的NHS基團。用10mlDMS0洗滌珠粒，在-20iC下將其^存在異丙醇中。這些珠粒在實施例2和3中用作親和基質。通過阻斷NHS基團(通過如上所述與氨基乙醇一起溫育來阻斷)來產生對照珠粒(沒有固定的配體)。實施例2:使用固定的氨基吡啶並嘧啶配體24進行的ZAP-70的磷酸化形式的藥物下拉該實施例示範固定的氨基吡啶並嘧，定配體24用於鑑定來自人T細胞系(Jurkat細胞)的細胞裂解物的ZAP-70的用途。為此，將未處理的和處理的Jukat細胞的裂解物與實施例1中描述的親和基質接觸。通過蛋白質印跡和質i普(MS)分析鑑定結合氨基吡啶並嘧啶配體24的蛋白質。對於蛋白質印跡分析，從親和基質洗脫結合的蛋白質，隨後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對其進行分離。用結合所述蛋白質的非磷酸化氨基末端部分的普通單克隆抗體和另外用磷酸-特異性抗體(phospho-specificantibody)檢測ZAP-70(圖2)。蛋白質印跡分析的結果顯示固定的氨基吡啶並嘧啶配體24優先下拉ZAP-70的磷酸化形式。與未處理的裂解物相比只在已處理的Jurkat細胞裂解物中顯著檢測到磷酸化的ZAP-70。對於通過質譜分析鑑定蛋白質和磷酸肽，洗脫通過親和基質捕獲的蛋白質，隨後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對其進行分離。切取合適的凝膠條帶，使其經歷使用胰蛋白酶的凝膠內蛋白水解消化。然後通過固定的金屬親和層析(IMAC)富集磷酸化的肽。通過LC-MS/MS質譜法分別分析保留的磷酸肽和非結合肽。ZAP-70的肽序列覆蓋示於圖4中。通過質鐠法總共鑑定9個ZAP-7Q砩酸肽(表4)。1.細胞培養以0.15x106和1.2x16個細胞/ml之間的密度將Jurkat細胞(來自ATCC，編號TIB-152的克隆E6-1)在1升Spinner瓶(IntegraBiosciences,#182101)中懸浮培養在補充有10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640培養基(Invitrogen，#21875-034)中。對於刺激實驗，用30juM過釩酸鹽(終濃度)處理密度大約為1.0x106個細胞/ml的細胞，進行1小時，然後通過離心收穫細胞。在用1xPBS緩衝液(Invitrogen，#14190-094)充分洗滌後，將細胞沉澱冷凍在液氮中，然後於-80'C下保存。對於刺激實驗，用仏02處理的原釩酸鈉處理細胞以抑制蛋白質酪氨酸磷酸酶(D.C.Weiser和S.Shenolikar，Chapter18.10inCVrre/^戶rofoco7s#o/ecw/arS/o/^r，2003，JohnWiley&Sons,Inc.)。對於細胞處理，向10升培養基中加入30ml混合物3，從而產生30MM過釩酸鹽的終濃度。以0.8至1.2x1(T個細胞/ml之間的密度保持Jurkat細胞，進行1小時，然後收穫細胞。過釩酸鹽溶液的製備以100mM的終濃度將原釩酸鈉(Sigma，#6508)溶解在無菌蒸餾水中，用0.1MNaOH將溶液的pH值調節至pH10.0。將溶液置於沸水浴中直至溶液澄清或變成半透明。如果必要，再次調節pH至10.0，在-20'C下貯存原液。避免原液反覆凍融。將500Ml30%線(Sigma,Cat.No.H1009)和375ju11xPBS混合(混合物1)。將3.5ml100mM釩酸鹽溶液(pH10.0)和31.5ml1xPBS混合(混合物2)。將650pi混合物1和32.5ml混合物2混合(混合物3)。在用於細胞培養前在室溫下溫育混合物3，進行10分鐘。2.細胞裂解物的製備在PotterS勻漿器中將Jurkat細胞在裂解緩沖液(50mMTris-HCl、0.8°/。NP40、5%甘油、150mMNaCl、1.5mMMgCh、25mMNaF、1mM釩酸鈉、1mMDTT、pH7.5)中勻漿。每25ml緩衝液加入一個完整的不含EDTA的片劑(蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)。使用機械化的POTTERS將材料勻漿(dounce)10次，然後將材料轉移至50mlfalcon管中，在冰上溫育30分鐘，然後在4'C下以20，000g(10，000rpm於預冷的SorvallSLA600中)離心IO分鐘。將上清液轉移至超速離心機(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmarm，355654)中，在4。C下以100.000g(33.500rpm於預冷的Ti50.2中)離心1小時。再次將上清液轉移至新的50mlfalcon管中，通過Bradford測定法(BioRad)確定蛋白質濃度，並製備每等分包含50mg蛋白質的樣品。立即將樣品用於實驗或冷凍在液氮中，於-80'C下冷凍貯存。3.化合物下拉實驗在裂解緩沖液中平衡具有固定的化合物的Sepharose-珠粒(每個下拉實驗100jil珠粒)，然後在立式圓筒振蕩器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上在4"C下與包含50mg蛋白質的細胞裂解物樣品一起溫育2小時。收集珠粒，將其轉移至Mobicol-柱(MoBiTech10055)，並用10ml包含0.5%NP40去汙劑的裂解緩沖液洗滌，然後用5ml具有0.25%的去汙劑的裂解緩沖液洗滌。為了洗脫結合的蛋白質，加入60pi2xSDS樣品緩衝液，在50TC下加熱柱子進行30分鐘，通過離心將洗脫物轉移至微量離心管。然後通過SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質。4.通過蛋白質印跡分析法進行的蛋白質檢測按照標準方法進行蛋白質印跡，按照廠商提供的說明書(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.PublishedMay2004byLI-CORBiosciences,www.1icor.國)通過使用特異性抗磷酸ZAP-70抗體(一抗)、焚光標記的二抗和來自LI-CORBiosciences(Uncoln，Nebraska,USA)的Odyssey紅夕卜成像系統來檢測和定量ZAP-70蛋白。只有當在酪氨酸殘基493上磷酸化時，磷酸ZAP-70抗體(pTyr493，兔多克隆抗體，CellSignaling#2704)檢測ZAP-70。普通ZAP-70抗體(L1E5，小鼠單克隆抗體，CellSignaling#2709)抗人ZAP-70的氨基末端。5.通過質譜法進行的蛋白質鑑定5.1在質i普分析之前進行的蛋白質消化基本按照Shevchenko等人，1996,Anal.Chem.68:850-858所描述的方法在凝膠中還原、烷基化和消化凝膠分離的蛋白質。簡而言之，使用乾淨的解剖刀從凝膠切取凝膠分離的蛋白質，使用lOmMDTT(於5mM碳酸氫銨中，54°C，45分鐘)還原所述蛋白質，然後在室溫下在黑暗中用55mM碘乙醯胺(於5mM碳酸氫銨中)進行烷化(30分鐘)。以12.5ng/pl於5mM碳酸氫銨中的蛋白酶濃度用豬胰蛋白酶(Promega)在凝膠中消化經還原和烷化的蛋白質。讓消化在37。C下進行4小時，隨後使用5pi5%甲酸終止反應。5.2通過質謙法分析之前的樣品製備用20pi1%TFA提取凝膠塞2次，將其與酸化的消化上清液混合。在真空離心機中乾燥樣品，然後重懸於10pl0.1%甲酸中。將乾燥的樣品重懸於30u1包含250mM乙酸、30%乙腈和4p1PHOS-選擇性鐵親和珠粒(Sigma，P9740;IMAC材料)的水中，在溫和水平振蕩的條件下在室下溫育2小時。隨後，將漿狀物(slurry)裝載在包含restriction的凝膠裝料器尖端以防止IMAC材料流出。讓珠粒沉澱l分鐘，然後使用P10移液管使溶劑通過柱子，並在Eppendorf管中收集所述溶液。用20jal包含250mM乙酸、30%乙腈的水溶液洗滌IMAC柱兩次。混合洗脫的級分，在真空離心機中進行乾燥，該級分稱為未結合級分(NBF)。使用20Ml包含400mM氨和30%乙腈的水溶液從IMAC柱洗脫磷酸肽。重複洗脫兩次，混合洗脫級分，並在真空離心機中千燥(結合級分，BF)。在進行LC-MS/MS分析(PozueloRubio等人，2005，BiochemicalJournal392(Part1)，163-172)之前將兩種級分(NBF和BF)都重懸於10pi0.1%甲酸中。5.3.質鐠數據的獲取將肽樣品注射入直接與四極T0F(QT0F2，QT0FUltima,QT0FMicro,Micromass)或離子阱(LCQDecaXP)質鐠儀偶聯的的納米LC系統(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex)。使用水性和有機溶劑的梯度在LC系統上分離肽(參見下文)。溶劑A是於0.5%的曱酸中的5%乙腈，溶劑B是於0.5%的曱酸中的70%乙腈。表3:在質鐠儀中對從LC系統洗脫出的肽進行部分測序。tableseeoriginaldocumentpage385.4.蛋白質的鑑定將LC-MS/MS實驗中產生的肽質量和片段化數據用於查詢NCBI(針對NCBInr、dbEST以及人和小鼠基因組)和歐洲生物信息研究所(EBI，針對人、小鼠、果蠅和線蟲蛋白質組資料庫)維護和定期更新的fasta格式的蛋白質和核苷酸序列資料庫。通過使用軟體工具Mascot(MatrixScience;Perkins等人，1999.Probabi1ity-basedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydata.Electrophoresis20，3551-3567)使測量的肽質量和片段化數據與從資料庫的條目(entries)計算的相同數據相關趙垂t免恭i^抽孟iA論賦胡孚厶;l;jf箭J墓/"亦/f乂工亦>f>.—r、,|，—JBt,">^Ao\|，-*t,w一-，'i"^/ysr口k、iw，'，*io5.5磷酸肽的鑑定通過允許在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上磷酸化(作為Mascot搜尋參數的可變修飾)，之後人工觀察光鐠與序列賦值(sequenceassignments)來完成磷酸化的肽的鑑定。表4:ZAP-70的磷酸肽標示通過人ZAP蛋白質序列(IPI00329789.5，628個胺基酸)的質譜分析鑑定的磷酸肽(觀察的值測量的質荷比；Mr(exp.):'觀察的值，x電荷)。tableseeoriginaldocumentpage39實施例3:用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的測定法如實施例1中所述進行氨基吡啶並嘧啶配體24親和基質的製備。為了在96孔板中篩選最多80種化合物，如下所述進行洗脫實驗。洗脫測定法用30mllxDP-緩沖液洗滌親和基質(1600m1的珠粒)2次。在每一次洗滌步驟後，通過在Heraeus離心才幾中在4°C下以1300rpm離心4分鐘來收集珠粒。棄去上清液。最後，在50ml結合緩沖液(lxDP緩沖液/0.4%NP40)中平衡珠粒，在4°C下於ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc.)上旋轉30至45分鐘。在該溫育時間後，收穫珠粒，將其與45ml過釩酸鹽激活的澄清的、蛋白質濃度為5mg/ml的Jurkat細胞裂解物混合。如實施例2中所述製備裂解物。在4°C下溫育珠粒和裂解物2小時。在與裂解物溫育後，如所述通過離心收集珠粒，用25ml結合緩衝液洗滌珠粒3次。在每一次洗滌步驟過程中，在4°C下在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustriesInc.)上溫育珠粒8分鐘。在第三次洗滌後，將珠粒轉移至2ml柱子(MoBiTec，#S10129)，並用20mllxDP緩衝液/0.2%NP40進行洗滌。在洗滌緩衝液完全通過柱子後，計算留在柱子中的珠粒的體積(大約1000m1)。將珠粒重懸於4倍過量的lxDP-緩沖液/O.2%NP40(4ml)中以產生1:4的漿狀物。對於化合物洗脫試驗，向96孔板(MilliporeMultiScreenHTS，MSBVN1210，具有蓋子和1.2um親水低蛋白結合Durapore膜)的各個孔加入50ju1該懸浮液。為了除去殘留緩衝液，將96孔板裝配上裝配濾器(Assemblefilter)和收集板，並將該夾層裝置在離心機中以800rpm離心10秒。然後向珠粒中加入40jn1補充有受試化合物的洗脫緩衝液(lxDP-緩衝液/0.2%NP40)。通過將它們(始於40倍的DMSO中的濃縮原液)稀釋在稀釋緩沖液中來製備受試化合物。將板裝配在收集板上，固定在Eppendorf保溫箱上，在4。C下在以650rpm振蕩的情況下溫育30分鐘。為了收穫冼脫物，在4"C下在臺式離心機(Heraeus)中以800rpm離心裝配在96孑L收集板上的96孔濾板1分鐘。洗脫物的通常體積為大約35m1。在-80。C下貯存洗脫物。通過使用斑點印跡法就ZAP-70的存在檢查洗脫物。使用氨基吡啶並嘧啶配體24(參見實施例1)，星形孢菌素(SigmaS4400)、JNK抑制劑SP600125(Calbiochem420119)和p38抑制劑SB202190(Tocris1264)作為受試化合物。通常將所有化合物以100mM的濃度溶解在100%DMSO(Fluka，cat.no41647)中。可選擇地，100%DMF(Fluka，cat.no40228)可用於不能溶解在DMSO中的那些化合物。在-20iC下貯存化合物。用於洗脫實驗的受試化合物的稀釋通過用100%DMSO以1:1稀釋100mM的原液來製備50mM的原液。對於洗脫實驗，進一步用洗脫緩衝液(lxDP-緩衝液，0.2%NP40)稀釋化合物。緩衝液的製備表5:5x-DP緩沖液的製備tableseeoriginaldocumentpage41將5x-DP緩沖液通過0.22um的濾器進行過濾，並將其在-80。C下以40ml的等分貯存。從下列提供商獲得這些溶液1.OMTris/HClpH7.5(Sigma,T-2663)、87%甘油(Merck,目錄號04091.2500)、1.0MMgCl2(Sigma，M-1028)、5.0MNaCl(Sigma,S-5150)。洗脫的ZAP-70的檢測按照廠商提供的說明書(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative,two—colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.由U-CORBiosciences於2004年5月公布,www.licor.com)使用特異性抗磷酸ZAP-70抗體(一抗)、焚光標記的二抗和來自LI-CORBiosciences(Lincoln,Nebraska,USA)的Odyssey紅外成像系統，通過斑點印跡法檢測和定量洗脫的ZAP-70蛋白。用20%的乙醇處理硝酸纖維素膜5秒，然後用1xPBS緩沖液洗滌。將洗脫物(如上所述的)與10|il4xSDS上樣緩衝液(200mMTris-HClpH6.8，8%SDS、40%甘油、0.04°/。溴酚藍)混合，用BioRad斑點印跡裝置(BioRad，#170-6545)將其用於硝酸纖維素膜，並用1xPBS緩衝液洗滌一次。對於ZAP-70蛋白的檢測，首先通過與Odyssey封閉緩衝液溫育1小時來封閉膜。將經封閉的膜在4"C下與一抗，識別磷酸化的酪氨酸殘基493的兔抗磷酸ZAP-70抗體(pTyr493，兔多克隆抗體，CellSignaling#2704)(在補充有0.1%Tween20和0.02%SDS的Odyssey封閉緩衝液中以1:1000稀釋)一起溫育16小時。在用包含0.01%Tween20的1xPBS緩沖液洗滌膜4次(每次5分鐘)後，將膜與檢測抗體(來自LI-COR的山羊抗兔IRDye800CW抗體，在補充有0.1%Tween20和0.02%SDS的Odyssey封閉緩衝液中以1:10OOO稀釋)一起溫育1小時。之後用1xPBS緩沖液/0.1%Tween20洗滌膜4次(每次5分鐘)並用1xPBS緩衝液洗滌膜1次(進行5分鐘)。之後用Odyssey讀數計掃描膜，並分析數據。實施例4:通過向細胞裂解物或活細胞加入化合物來進行的與ZAP-70相互作用的化合物的化合物傳的表徵本實施例示範了其中將受試化合物直接加入細胞裂解物或與活細胞一起溫育的竟爭結合測定法。對於細胞裂解物竟爭結合測定法，向裂解物樣品加入不同濃度的受試化合物，讓所述受試化合物與裂解物樣品中包含的蛋白質結合。然後加入包含固定的氨基吡啶並嗜咬配體24的親和基質以捕獲不與受試化合物結合的蛋白質。在溫育時間後，通過離心將具有捕獲的蛋白的珠粒與裂解物分離。然後洗脫結合的蛋白質，並使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統檢測ZAP-70的存在和對其進行定量(圖6A)。產生化合物CZC15497的劑量響應曲線，ICs。值為1.72|iM(圖6B)。可選擇地，首先將活Jurkat細胞的等分與各種化合物濃度溫育30分鐘，然後用30uM過釩酸鹽處理另外30分鐘。收穫細胞，製備細胞裂解物，並加入親和基質以捕獲不與受試化合物結合的蛋白。在將細胞裂解物與親和基質溫育90分鐘後，通過離心將具有捕獲的蛋白的珠粒與裂解物分離。然後洗脫結合的蛋白，並如上所述，使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統檢測ZAP-70的存在和對其進行定量(圖7A)。產生化合物CZC15497的劑量響應曲線，ICs。值為0.65uM(圖7B)。兩種方法的結果的比較(圖6和7;加入至裂解物的化合物對與細胞一起溫育的化合物)對於CZC15497化合物和ZAP-70激酶產生相似的ICs。值。此外，該化合物特異性地與ZAP-70激酶而非Lck相互作用。親和基質的洗滌用15mllxDP緩沖液洗滌實施例1中描述的親和基質(O.3ml幹體積(dryvolume))2次，然後用15ml包含0.4%NP40的lxDP緩沖液洗滌，最後重懸於0.3ral的包含0.4%NP40的lxDP緩沖液中(50%珠粒漿狀物)。受試化合物的製備對於在裂解物竟爭中，在DMSO中製備相應於比最終希望的試驗濃度高200倍的濃度的受試化合物的原液(例如對於5jjm的終試驗濃度製備1mM的原液)。該稀釋方案產生0.5%的終DMSO濃度。對於對照實驗(無受試化合物)，使用包含O.5%DMSO的緩沖液，以便所有受試樣品包含0.5%DMSO。細胞裂解物的稀釋如實施例2中所述從過釩酸鹽處理的Jurkat細胞製備細胞裂解物。對於通常實驗，將一個包含50mg蛋白質的裂解物等分在37匸的水浴中解凍，然後保持在4t:。向裂解物中加入1體積的包含蛋白酶抑制劑的lxDP緩沖液(l片蛋白酶抑制劑溶解在25mllxDP緩衝液或25ml包含0.4%NP40的lxDP緩衝液中；不含EDTA的小片蛋白酶抑制劑混合物來自RocheDiagnostics,產品目錄號41647),以便獲得0.4%的終NP40濃度。通過加入包含0.4%NP40和蛋白酶抑制劑的lxDP緩衝液來進一步稀釋裂解物，以便獲得5mg/ml的終蛋白質濃度。細胞裂解物與受試化合物和親和基質的溫育向1mlJurkat裂解物(包含5mg蛋白質)加入5y1化合物CZC15497(稀釋於DMS0中)，在4'C下溫育45分鐘。然後加入20p1具有固定的氨基吡啶並嘧啶配體24的親和基質，在4'C下再溫育1個小時。在通過離心將珠粒與裂解物分離後，用50Ml2x濃縮樣品緩衝液(25ju14xNuPAGELDS樣品緩沖液，Invitrogen，NP0007;2.5ju11M二硫蘇糖醇(DTT);22.5ju1H20)洗脫結合的蛋白質。ZAP-70的檢測和定量按照標準方法進行蛋白質印跡法，按照由廠商提供的說明書(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.由LI-CORBiosciences於2004年5月公布，www,licor.com)通過使用特異性抗ZAP-70抗體(一抗)、螢光標記的二抗和來自LI-C0RBiosciences(Uncoln，Nebraska,USA)的Odyssey紅夕卜成像系統檢測和定量ZAP-70蛋白。對於Lck的檢測，使用抗Lck抗體(Upstate3A5)。在SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白質洗脫物，然後轉移至PVDF膜。在室溫下將膜與Odyssey緩沖液一起溫育1小時以阻斷非特異性結合。在洗滌後，在4X:下將膜與抗ZAP-70抗體(獲自Abeam的抗磷酸Tyr292的兔多克隆抗體；於具有0.2%Tween20的Odyysey緩衝液中以1:1000稀釋)一起溫育16小時。對於Lck的檢測，使用抗Lck抗體(Upstate3A5)。然後用補充有0.1%Tween20的PBS緩沖液洗滌膜4次，每次5分鐘。將用螢光染料標記的第二檢測抗體與Odyssey紅外成像系統結合使用以顯現和定量蛋白質條帶(於具有0.2%Tween20、0.02%SDS的Odyssey緩衝液中以1:10000稀釋的IRDye800nm抗兔抗體(Licor)，在室溫下溫育1小時)。再一次，用補充有0.1%44Tween20的PBS緩衝液洗滌膜4次，每次5分鐘，最後用PBS緩衝液短暫洗滌以除去Tween20。使用XL擬合程序(fitprogram)(XLfit4ExcelAdd-InVersion4.2.0Build13;IDBS，Guilford,UK)計算劑量響應曲線。細胞與受試化合物的溫育，細胞裂解物的製備，與親和基質的溫育以及蛋白質的檢測對於細胞處理，以比最終希望的試驗濃度高5000倍的濃度製備受試化合物的原液。細胞培養基中的終DMSO濃度為0.02%DMSO。在37C下用不同濃度(5.0jjM、1.0juM、0.33jaM、0.11jaM、0.037iaM和0.012MM)的化合物CZC15497處理Jurkat細胞培養物(l升體積，細胞密度1.15x1(T個細胞/ml)30分鐘，然後用30過釩酸鹽再處理另外30分鐘(關於過釩酸鹽溶液的製備，參見實施例2)。然後收穫細胞，如上所述製備細胞裂解物，並加入親和基質以捕獲未與受試化合物結合的蛋白質。在細胞裂物與親和基質在4°C下溫育90分鐘後，通過離心將具有捕獲的蛋白質的珠粒與裂解物分離。用50u12x濃縮樣品緩衝液(25Ml4xNuPAGELDS樣品緩衝液，Invitrogen，NP0007;2.5|i11M二硫蘇糖醇(DTT);22.5ja1H20)洗脫珠粒結合的蛋白質。使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統檢測洗脫物中ZAP-70的存在和對其進行定量(圖7A)。對於Lck的檢測，使用抗Lck抗體(Upstate3A5)。產生化合物CZC15497與ZAP-70相互作用的劑量響應曲線，得到0.65jLiM的IC5。值(圖7B)。實施例5:Jurkat細胞中的鈣釋放測定與CZC15497用作ZAP-70的抑制劑一致，我們發現該化合物抑制抗CD3刺激的JurkatT細胞中的鉀釋放，ICs。值為0.24iuM(圖8)。測定原理螢光探針的開發使得能夠測量單個活細胞中細胞內游離4丐離子的濃度。首先用可滲透細胞的0&2+-靈敏性染料裝載細胞，然後加入受試化合物。最後，在即將於流式細胞儀上獲取數據之前用抗CD3抗體通過T細胞受體激活細胞。Ca^的釋放測量為細胞刺激後時間的函數。本方案描述了使用Fluo-3和Fluo-4染料(Minta等人，1989，J.Biol.Chem.264(14):8171-8178)測量Jurkat細胞中細胞內Ca2+的濃度的流式細胞術方法(也參見June等人，1997，Measurementofintracellularcalciumionsbyflowcytometry.In:CurrentProtocolsinCytometry(1997)Unit9.8.1-9.8.19，JohnWiley&Sons,Inc.)。Ca2+釋放的測定方案一般而言，應當在可能的最短時間內處理細胞以確保它們的穩定性。因此，高度推薦預先準備所有材料和利用任何溫育或離心時間準備後面的步驟(例如製備化合物稀釋物或啟動流式細胞儀)。1)準備標明待分析的樣品包括對照的數目的工作計劃。2)細胞收穫以1100rpm離心50至100mlJurkat細胞培養物，進行5分鐘。棄去上清液，將重懸的細胞沉澱混合在單個50mlFalcon管中，用PBS-CaCl2(無FCS)補足至50ml。再次離心樣品。3)用PBS-CaCh(無FCS)重懸細胞沉澱以獲得不低於10x106個細胞/ml的濃度。製備適當的稀釋物以估計細胞濃度和計數細胞。4)在50mlFalcon管中分離需要裝載的細胞的體積(例如用於20個樣品的107個細胞)，對於107個細胞用PBS-CaCh補足至900jil。5)在黑暗中製備1:1的FLU0-4(1mM)+PluronicF-127(20%)的混合物。每107個細胞需要5jil的Fluo-4。6)用PBS-CaCl2製備該混合物的1/10稀釋物(在黑暗中；例如將5plFluo-4+5^1F-127配成100。7)向細胞加入染料溶液。每管裝載不超過30x106個細胞。8)在細胞培養箱(37X:，5%C02)中溫育樣品30分鐘。不時進行混合。469)在此期間，於PBS-CaCl2(具有10%FCS)中製備足夠的受試化合物稀釋物。溶液濃度應當比希望的終濃度高10倍。渦旋各稀釋物。也製備抗體稀釋物:抗CD3(1/200)和GAM(1/25)。10)標記FACS管，將30|Lil化合物稀釋物分配入相應的管中或只將緩沖液分配入對照管中。11)在30分鐘的溫育後，在PBS-CaCh(具有10%FCS)中洗滌細胞兩次。在洗滌步驟期間確保流式細胞儀已經打開以加熱雷射器。12)以1.5x16個細胞/ml的濃度在PBS-CaCl2(具有10%FCS)中重懸細胞沉澱。13)將300^1細胞懸浮液分配入FACS管，輕輕混合。開始化合物溫育。在黑暗中使樣品保持在室溫。14)打開流式細胞儀的設置。建議將用於所有測量的模板準備好。機器的設置也應當在允許估計細胞製劑的重複性的實驗間相同。15)在設置方法中，在細胞儀上控制細胞製劑。細胞應當置於預先確定的槽(gates)。16)在化合物溫育期間，也檢查細胞如預期響應抗CD3激活。將定時器定為8秒。加入6jil抗CD3稀釋物(0.2jig/ml終濃度)，輕輕地混合。加入1piGAM稀釋物(0.75ng/ml終濃度)，輕輕地混合。在37C下在水浴中溫育樣品，同時起動定時器。在8秒鐘的溫育後，以中等速度獲得數據，進行200秒。螢光的明顯增加應當在1分鐘後出現。17)在獲取FACS數據之前確保細胞在室溫下靜息和平衡15分鐘。18)數據獲取應當連續測量待比較的樣品。19)為了更好的重複性，確保在2小時內獲得裝載的細胞的數據。20)使用FlowJo軟體(TreeStar,Inc.)分析數據。細胞培養從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCellCollection)(ATCC)獲得Jurkat細胞系J77。將Jurkat細胞維持在補充有熱滅活的胎牛血清(Gibco，ref,10270-106。通過在56C水浴中進行45分鐘熱滅活FCS)的RPMI1640培養基(Gibco，ref.21875-034)中。試劑Fluo-3，AM(MolecularProbes,F14218,以1ml現成的於薦O中的lmM溶液的形式提供，在-20TC下以5pi或7.5pi的等分貯存)。Fluo-4，AM(MolecularProbes,F14217,以1ml現成的於DMS0中的1raM溶液的形式提供，在-20。C下以5pi或7.5pi的等分貯存)。PluronicF-127(MolecularProbes,P3000MP，以1ml現成的於DMSO中的20%的溶液的形式提供)。PBS-CaCl2-MgCl2(Gibco，14040-91)。抗CD3抗體(Calbiochem，217570，以1mg/ml提供)。山羊抗小鼠IgG抗體(GAM;Sigma,M8890,以6mg/ml提供)。設備流式細月包4義(Becton-Dickinson，FACSCalibur)和FlowJo⑧軟體(TreeStar,Inc.)。權利要求1.用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，c)將氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定化合物是否能夠將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離。2.權利要求1的方法，其中步驟d)包括檢測分離的磷酸化的ZAP-70或確定分離的磷酸化的ZAP-70的量。3.權利要求2的方法，其中通過質譜法或免疫檢測法，優選用抗磷酸化的ZAP-70的抗體，優選用識別磷酸化的ZAP-70的位點493上的磷酸化的抗體檢測分離的磷酸化的ZAP-7G或確定分離的磷酸化的ZAP-7G的量。4.用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成24和與給定的化合物接觸，和c)檢測步驟b)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物。5.權利要求4的方法，其中在步驟c)中通過確定氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量來進行所述檢測。6.權利要求4或5中任一項的方法，其中用幾種蛋白質製劑進行步驟a)至c)以檢測不同的化合物。7.用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步a)提供兩等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使一個等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，c)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-7G複合物形成的條件下使另一等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24和與給定的化合物接觸，和d)確定步驟b)和c)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。8.用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供兩個各自包含至少一個含有磷酸化的ZAP-70的細胞的等份，b)將一個等份與給定的化合物一起溫育，c)收穫各等份的細胞，d)裂解細胞以獲得蛋白質製劑，e)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磚酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，和f)確定步驟e)中各等份中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。9.權利要求7或8中任一項的方法，其中和不與化合物一起溫育的等分相比，與化合物一起溫育的等分中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的減少的量表明ZAP-70是該化合物的靶。10.權利要求5至9中任一項的方法，其中通過將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離，隨後檢測分離的磷酸化的ZAP-70或隨後確定分離的磷酸化的ZAP-70的量來確定氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。11.權利要求10的方法，其中通過質傳法或免疫檢測法，優選用抗磷酸化的ZAP-70的抗體，優選用識別磷酸化的ZAP-70的位點493上的磷酸化的抗體檢測磷酸化的ZAP-70或確定ZAP-70的量。12.權利要求1至11中任一項的方法，以中等或高通量篩選的形式進行。13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述化合物選自合成的化合物、或有機合成藥物，更優選小分子有機藥物和天然小分子化合物。14.權利要求1至13中任一項的方法，其中與ZAP-70相互作用的化合物是ZAP-70抑制劑。15.權利要求1至14中任一項的方法，其中固體支持物選自瓊脂糖、修飾的瓊脂糖、sepharose珠粒(例如NHS激活的sepharose)、膠乳、纖維素和亞鐵化合物顆粒或鐵磁性顆粒。16.權利要求1至15中任一項的方法，其中將氨基吡啶並嘧啶配體24共價偶聯至固體支持物。17.用於製備藥物組合物的方法，該方法包括步驟a)根據權利要求1至16中任一項鑑定與ZAP-70相互作用的化合物，和b)將所述相互作用的化合物配製成藥物組合物。18.用於純化磷酸化的ZAP-70的方法，其包括步驟a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24—磷酸化的ZAP-70複合物形成24接觸，和c)將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離。19.權利要求18的方法，該方法還包括在步驟c)之後鑑定能夠結合磷酸化的ZAP-70的蛋白質。20.權利要求18的方法，該方法還包括在步驟c)之後確定磷酸化的ZAP-70的翻譯後修飾。21.權利要求18至20中任一項的方法，其中在步驟c)之後通過質譜法或免疫檢測法表徵磷酸化的ZAP-70和/或能夠結合磷酸化的ZAP-70的蛋白質。22.權利要求1至21中任一項的方法，其中蛋白質製劑的提供包括收穫至少一個包含磷酸化的ZAP-70的細胞和裂解細胞的步驟。23.權利要求1至22中任一項的方法，其中在大體上生理條件下進行形成氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的步驟。24.氨基吡啶並嘧啶配體24用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的用途。25.氨基吡啶並嘧啶配體24用於純化磷酸化的ZAP-70的用途。26.氨基吡啶並嘧啶配體24用於製備用於慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的診斷劑的用途。27.用於CLL的診斷/預後的方法，該方法包括確定磷酸化的ZAP-70在樣品中的存在/與ZAP-70的總量相比磷酸化的ZAP-70的量的步驟，其中在來自CLL患者的樣品中，與ZAP-70的總量(未磷酸化的+磷酸化的ZAP-70)相比，磷酸化的ZAP-70的增加的量表明就CLL的侵襲形式而言具有更高的可能性。全文摘要本發明在第一方面提供了用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，c)將氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定化合物是否能夠將磷酸化的ZAP-70與固定的氨基吡啶並嘧啶配體24分離；在第二方面，本發明涉及用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供包含磷酸化ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的配體氨基吡啶並嘧啶配體24和與給定的化合物接觸，和c)檢測在步驟b)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物。在第三方面，本發明提供了用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供兩等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白質製劑，b)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使一個等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，c)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使另一等份與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24和與給定的化合物接觸，和d)確定步驟b)和c)中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量；在第四方面，本發明涉及用於鑑定與ZAP-70相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟a)提供兩個各自包含至少一個含有磷酸化的ZAP-70的細胞的等份，b)將一個等份與給定的化合物一起溫育，c)收穫各等份的細胞，d)裂解細胞以獲得蛋白質製劑，e)在允許氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物形成的條件下使蛋白質製劑與固定在固體支持物上的氨基吡啶並嘧啶配體24接觸，和f)確定步驟e)中各等份中形成的氨基吡啶並嘧啶配體24-磷酸化的ZAP-70複合物的量。文檔編號G01N33/574GK101490557SQ200780026354公開日2009年7月22日申請日期2007年6月1日優先權日2006年6月1日發明者D·埃伯哈德,G·德勒維斯,N·拉姆斯登,U·克魯澤申請人:塞爾卓姆股份公司