一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法與流程
2023-05-13 18:49:26 5
本發明涉及間充質幹細胞的製備技術，特別涉及一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源於發育早期中胚層和外胚層的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能幹細胞，其可在體外適宜條件下連續傳代培養、凍存。由於MSCs在特定條件下可分化為不同細胞，故其逐漸成為細胞治療和基因治療領域中極具實用價值的細胞來源。臍帶屬於胚胎外組織，其含有大量多向分化的幹細胞，細胞生長擴增速度快，且臍帶在胎兒娩出後成為「廢棄物」，所以取材方便，來源豐富，更無倫理學問題，可作為極佳的間充質幹細胞來源。
申請公布號為CN102021144A、申請公布日為2011年4月20日的中國專利公開了一種分離臍帶間充質幹細胞的方法，該方法包括下述步驟：臍帶去除動、靜脈，製成組織碎塊→加入含有青黴素和鏈黴素的磷酸鹽緩衝液清洗，離心棄上清→加入0.1-0.2％膠原酶NB4消化→加入透明質酸酶消化→加入乙二胺四乙酸磷酸鹽溶液混勻→用100-200目濾網過濾，收集濾過液→濾過液離心，棄去上清液，用DMEM培養基清洗2-3次，即得。
在細胞計數試驗中研究發現，通過這種方法分離臍帶間充質幹細胞時，其活細胞率受試驗批次影響較大，產品品質不穩定。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，其解決了活細胞率不穩定的問題，具有提高產品品質的效果。
本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：
一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，包括以下步驟：
i.取新生兒新鮮的離體臍帶，將其置於控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液中，保存待用；
ii.取出經步驟i處理的臍帶，用控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液多次衝洗，至無血跡殘留；
iii.在控溫為2～5℃的浸泡液環境中，剪切洗滌後的臍帶，剪切過程中剔除動靜脈；所述臍帶和浸泡液的用量比為1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、10～20g/L的乙醇，餘量為水；
iv.取剪切後的臍帶，用控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液衝洗2～3次，將其放入培養瓶後置於控溫為-80～-70℃且控真空度為10～30Pa的環境下5～20min，除去臍帶上的溶劑；
v.取培養瓶密封處理，將其置於控溫為-40～-35℃的環境中，待培養瓶的溫度升至-40～-35℃時則將培養瓶轉移至控溫為-5～0℃的環境中，待培養瓶的溫度升至-5～0℃時則將培養瓶轉移至控溫為37℃的環境中，至其內的臍帶解凍完全；
vi.取經步驟v處理的培養瓶，於其內加入含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液；其中所述臍帶和PBS液的用量比為1g:0.5～1ml，振蕩1～5min使臍帶和PBS液充分接觸；
vii.取經步驟vi處理的培養瓶，於其內加入第一混合酶溶液，振蕩處理，振蕩用的水浴控溫曲線為：0-5min，15℃恆溫→5.01-20min，勻速升溫至25℃→20.01-30min，25℃恆溫→30.01-40min，勻速升溫至37℃→40.01-75min，37℃恆溫→75.01-90min，自然冷卻至25℃；其中所述臍帶和第一混合酶溶液的用量比為1g:2～5ml，所述第一混合酶溶液包括1～2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2～3mg/g的膠原酶II、5～10mg/g的乙醇，餘量為水；
viii.取經步驟vii處理的培養瓶，於其內加入第二混合酶溶液，振蕩處理，振蕩用的水浴控溫曲線為：0-2min，25℃恆溫→2.01-10min，勻速升溫至30℃→10.01-15min，30℃恆溫→15.01-20min，勻速升溫至37℃→20.01-60min，37℃恆溫→60.01-75min，自然冷卻至25℃；其中所述臍帶和第二混合酶溶液的用量比為0.5g:2～5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5～1mg/g的膠原酶II、0.5～1mg/g透明質酸酶、0.2～0.5mg/g的DNA水解酶、2～5mg/g的乙醇，餘量為水；
IX.取經步驟viii處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和0.1g/L鏈黴素的LG-DMEM培養基，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.2～0.5ml:1～2ml:2～5ml；
X.取經步驟IX處理的培養瓶，加入含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min，棄上清；其中所述臍帶和PBS液用量比為1g:2～5ml；
XI.取經步驟X處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min，棄上清，重複2～3次；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.5～1ml:2～5ml:2～5ml；
XII.取經步驟XI處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基，混勻，即得；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.5ml:1ml:1ml。
細胞計數試驗研究發現，通過上述技術方案製備得到的樣品的活細胞率提高至97.5％以上且平行試驗結果接近，其產品品質相對穩定；
細胞表型鑑定研究發現，通過上述技術方案製備得到的樣品在擴增培養時，其細胞達80％融合時間可縮減至5天以內，增加了其培養速度；且其鼠抗人PE標記的CD73(作為間充質幹細胞的標誌性抗原)陽性率提高至90％以上，提高了間充質幹細胞純度，產品品質得到提高。
進一步優選為：經步驟i處理後的臍帶在48hr以內用步驟ii處理。
進一步優選為：步驟iii中，臍帶剪成1mm×1mm×1mm大小。
進一步優選為：步驟iii中，所述浸泡液還包括0.2～0.5g/L的L-穀氨酸。
進一步優選為：所述浸泡液包括1.0g/L的葡萄糖、0.4g/L的L-穀氨酸、18g/L的乙醇，餘量為水。
進一步優選為：步驟vi中，所述臍帶和PBS液的用量比為1g：1ml。
進一步優選為：步驟vii中，所述臍帶和第一混合酶溶液的用量比為1g:4ml，所述第一混合酶溶液包括2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、3mg/g的膠原酶II、8mg/g的乙醇，餘量為水；
步驟viii中，所述臍帶和第二混合酶溶液的用量比為0.5g:3.5ml，所述第二混合酶溶液包括0.8mg/g的膠原酶II、1mg/g透明質酸酶、0.5mg/g的DNA水解酶、5mg/g的乙醇，餘量為水。
進一步優選為：步驟IX中，所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.4ml:1.5ml:4ml；
步驟X中，所述臍帶和PBS液用量比為1g:3ml；
步驟XI中，所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.5ml:2ml:5ml。
進一步優選為：所述LG-DMEM培養基的基礎培養基包括1000mg/L的葡萄糖、4.0mM的L-穀氨酸、110mg/L丙酮酸鈉。
進一步優選為：所述LG-DMEM培養基的基礎培養基還包括25mM的HEPES。
細胞計數試驗研究發現，通過上述技術方案製備得到的樣品的活細胞率可進一步提高至99.5％以上且平行試驗結果接近，其產品品質更穩定；
細胞表型鑑定研究發現，通過上述技術方案製備得到的樣品在擴增培養時，其細胞達80％融合時間可進一步縮減至3天以內，進一步增加了其培養速度；且其鼠抗人PE標記的CD73(作為間充質幹細胞的標誌性抗原)陽性率進一步提高至95％以上，進一步提高間充質幹細胞純度，產品品質得到提高。
綜上所述，本發明具有以下有益效果：
1、細胞計數試驗研究發現，通過本申請製備得到的樣品的活細胞率得到提高且平行試驗的結果接近，其產品品質相對穩定，其中部分樣品的活細胞率可提高至99％以上；
2、細胞表型鑑定研究發現，本申請製備得到的樣品在擴增培養時，其擴增培養速度快、得到的間充質幹細胞純度高，其產品品質得到一定的提高，其中部分樣品的細胞達到80％融合時間在3天以內且鼠抗人PE標記的CD73陽性率高於93％。
具體實施方式
本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的保護範圍內都受到專利法的保護。
實施例1：各種原材料的製備
(1)臍帶：自醫院婦產科產房採集。
(2)含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液：
稱取1.42g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、8g NaCl和0.2g KCl，加入800ml去離子水攪拌溶解，加入0.06g青黴素鈉和0.1g鏈黴素，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加去離子水定容至1L，高溫高壓下滅菌，即得，保存於室溫中；該溶液中的青黴素和鏈黴素折算成效價分別為100U/ml和100U/ml；
其中，青黴素鈉和鏈黴素均購自Gibco公司。
(3)浸泡液：
按所需稱取一定量的葡萄糖、(部分添加有L-穀氨酸、)乙醇，加入部分去離子水攪拌溶解，最後用去離子水定容，即得；每個成分的具體濃度參見具體實施例。
(4)第一混合酶溶液
按所需稱取一定量的胰蛋白酶-EDTA消化液、膠原酶II、乙醇，加入部分去離子水攪拌溶解，最後用去離子水定容，即得；每個成分的具體濃度參見具體實施例，其中胰蛋白酶-EDTA消化液和膠原酶II均購自Gibco公司。
(5)第二混合酶溶液
所需稱取一定量的膠原酶II、透明質酸酶、DNA水解酶、乙醇，加入部分去離子水攪拌溶解，最後用去離子水定容，即得；每個成分的具體濃度參見具體實施例，其中膠原酶II購自Gibco公司，透明質酸酶和DNA水解酶均購自美國Amresco公司。
(6)LG-DMEM培養基的基礎培養基
購自Gibco公司，且有兩個類型，分別為含HEPES型和不含HEPES型，
其中，HEPES型中葡萄糖為1000mg/L，L-穀氨醯胺為4.0mM，丙酮酸鈉為110mg/L，HEPES為25mM；
不含HEPES型中葡萄糖為1000mg/L，L-穀氨醯胺為4.0mM，丙酮酸鈉為110mg/L且其不含HEPES。
(7)胎牛血清：購自Hyclone公司。
(8)含100U/ml青黴素和0.1g/L鏈黴素的LG-DMEM培養基、或含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基
按所需稱取一定量的與(2)來源相同的青黴素和鏈黴素，加入(6)的LG-DMEM培養基的基礎培養基分散均勻並定容，即得。
實施例2-4：一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，包括以下步驟：
i.取新生兒新鮮的離體臍帶，將其置於控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液中，保存待用；
ii.取出經步驟i處理的臍帶，用控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液多次衝洗，至無血跡殘留；
iii.在控溫為2～5℃的浸泡液環境中，剪切洗滌後的臍帶，剪切過程中剔除動靜脈；所述臍帶和浸泡液的用量比為1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、0.2～0.5g/L的L-穀氨酸、10～20g/L的乙醇，餘量為水；
iv.取剪切後的臍帶，用控溫為2～5℃且含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液衝洗2～3次，將其放入培養瓶後置於控溫為-80～-70℃且控真空度為10～30Pa的環境下5～20min，除去臍帶上的溶劑；
v.取培養瓶密封處理，將其置於控溫為-40～-35℃的環境中，待培養瓶的溫度升至-40～-35℃時則將培養瓶轉移至控溫為-5～0℃的環境中，待培養瓶的溫度升至-5～0℃時則將培養瓶轉移至控溫為37℃的環境中，至其內的臍帶解凍完全；
vi.取經步驟v處理的培養瓶，於其內加入含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液；其中所述臍帶和PBS液的用量比為1g:0.5～1ml，振蕩1～5min使臍帶和PBS液充分接觸；
vii.取經步驟vi處理的培養瓶，於其內加入第一混合酶溶液，振蕩處理，振蕩用的水浴控溫曲線為：0-5min，15℃恆溫→5.01-20min，勻速升溫至25℃→20.01-30min，25℃恆溫→30.01-40min，勻速升溫至37℃→40.01-75min，37℃恆溫→75.01-90min，自然冷卻至25℃；其中所述臍帶和第一混合酶溶液的用量比為1g:2～5ml，所述第一混合酶溶液包括1～2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2～3mg/g的膠原酶II、5～10mg/g的乙醇，餘量為水；
viii.取經步驟vii處理的培養瓶，於其內加入第二混合酶溶液，振蕩處理，振蕩用的水浴控溫曲線為：0-2min，25℃恆溫→2.01-10min，勻速升溫至30℃→10.01-15min，30℃恆溫→15.01-20min，勻速升溫至37℃→20.01-60min，37℃恆溫→60.01-75min，自然冷卻至25℃；其中所述臍帶和第二混合酶溶液的用量比為0.5g:2～5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5～1mg/g的膠原酶II、0.5～1mg/g透明質酸酶、0.2～0.5mg/g的DNA水解酶、2～5mg/g的乙醇，餘量為水；
IX.取經步驟viii處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和0.1g/L鏈黴素的LG-DMEM培養基，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.2～0.5ml:1～2ml:2～5ml；
X.取經步驟IX處理的培養瓶，加入含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min，棄上清；其中所述臍帶和PBS液用量比為1g:2～5ml；
XI.取經步驟X處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基，於20～25℃下靜置2～5min並在此溫度下離心5～8min，棄上清，重複2～3次；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.5～1ml:2～5ml:2～5ml；
XII.取經步驟XI處理的培養瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基，混勻，即得；其中所述臍帶、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培養基的用量比為1g:0.5ml:1ml:1ml；
其中，實施例2-4的具體參數如表1所示。
表1實施例2-4的原料信息
實施例5：一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，與實施例1的區別在於，步驟IX和步驟XI中，其LG-DMEM培養基的基礎培養基均為不含HEPES型。
實施例6：一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，與實施例1的區別在於，步驟iii的浸泡液組成中不含L-穀氨酸。
實施例7：一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，與實施例1的區別在於，經步驟i處理後的臍帶在保存100hr後用步驟ii處理。
實施例8：一種人臍帶間充質幹細胞的分離方法，與實施例1的區別在於，步驟iii中，臍帶剪成3mm×3mm×3mm大小。
性能表徵
(1)參照樣的製備
參照樣1，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟iii中，浸泡液組成為：葡萄糖0.45g/L、乙醇5g/L，餘量為水；且臍帶和浸泡液的用量比為1g:5ml。
參照樣2，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟iii中，浸泡液組成為：葡萄糖2g/L、乙醇40g/L，餘量為水；且臍帶和浸泡液的用量比為1g:40ml。
參照樣3，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟vii中，第一混合酶溶液的組成為：胰蛋白酶-EDTA消化液0.5mg/g、膠原酶II 1mg/g、乙醇2.5mg/g，餘量為水；且臍帶和第一混合酶溶液的用量比為1g:1ml。
參照樣4，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟vii中，第一混合酶溶液的組成為：胰蛋白酶-EDTA消化液4mg/g、膠原酶II 6mg/g、乙醇20mg/g，餘量為水；且臍帶和第一混合酶溶液的用量比為1g:10ml。
參照樣5，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟viii中，第二混合酶溶液的組成為：膠原酶II 0.25mg/g、透明質酸酶0.25mg/g、DNA水解酶0.1mg/g、乙醇1mg/g，餘量為水；且臍帶和第二混合酶溶液的用量比為0.5g:1ml。
參照樣6，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟viii中，第二混合酶溶液的組成為：膠原酶II 2mg/g、透明質酸酶2mg/g、DNA水解酶1mg/g、乙醇10mg/g，餘量為水；且臍帶和第二混合酶溶液的用量比為0.5g:10ml。
參照樣7，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟IX中，臍帶、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培養基的用量比為1:0.1:0.25:1。
參照樣8，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟IX中，臍帶、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培養基的用量比為1:1:4:10。
參照樣9，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟X中，臍帶和PBS液的用量比為1:1。
參照樣10，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟X中，臍帶和PBS液的用量比為1:10。
參照樣11，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟XI中，臍帶、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培養基的用量比為1:0.25:1:1。
參照樣12，其製備方法和實施例1的區別在於，步驟XI中，臍帶、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培養基的用量比為1:2:10:10。
參照樣13，其製備方法和實施例1的區別在於，未採用步驟v和步驟vi。
參照樣14，參照CN102021144A實施例1製備。
(2)細胞計數
試驗對象：以實施例2-8製備得到的懸液為試驗樣，以參照樣1-13為對照，進行細胞計數試驗。
試驗內容：取混勻後的1ml樣品，加入1ml購自Gibco公司的0.4％臺盼藍染液(即Trypan Blue)，混勻，染色4min；取100μL混合液用血球計數板計數，鏡下計數死細胞、活細胞數，其中死細胞被染成明顯的藍色而活細胞拒染呈無色透明狀；以活細胞率(％)＝活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100％計算活細胞率。每個樣品均平行製備5次，每次製備的樣品計數3次且其活細胞率取其平均值。
試驗結果：如表2所示。表2顯示，相比參照樣而言，實施例2-8製備得到的懸液的活細胞率較高(均高於97.5％)，且平行試驗的結果接近，其產品品質相對穩定，其中實施例2、3、4製備得到的懸浮液的活細胞率最高且平行試驗結果最接近且實施例2製備得到的懸浮液為最佳樣品。
表2細胞計數試驗中活細胞率(％)的結果
(3)細胞表型鑑定
試驗對象：以實施例2-8製備得到的懸液為試驗樣，以參照樣1-12為對照，進行細胞表型鑑定試驗。
試驗內容：取混勻後的100μL樣品(作為原代幹細胞)，將其置於無菌培養瓶中，向每個培養瓶中加入1ml的胎牛血清(購自Hyclone公司)和10ml的DMEM/F12培養基(1:1，購自Hyclone公司)，置於37℃、體積分數為5％的CO2、溼度為95％RH的環境中靜置培養；4天後換液，去除未貼壁細胞，以後每2天更換一次；待培養皿中的細胞達到80％融合，棄去培養液，PBS漂洗1次後，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2min，輕輕拍打瓶壁促進細胞從瓶底脫離，然後加入含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的PBS液、含100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素的LG-DMEM培養基終止消化，收集吹打後所得細胞，離心，棄上清，用培養液重新混勻，1∶2的比例進行傳代接種，置於37℃、體積分數5％CO2、溼度為95％RH的環境中靜置培養，每2天更換一次換液1次，待培養皿中的原代幹細胞達到80％融合用同樣方法消化傳代；
培養傳代3代後，取對數生長期第4代細胞，配製成1×109L-1懸液，用鼠抗人PE標記的CD73及同型對照10μL，4℃避光孵育30min，PBS液洗滌3次，10g/L多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測分析。每個樣品均平行製備3次，每次製備的樣品細胞表型鑑定3次且提高流式細胞儀檢測分析得到的鼠抗人PE標記的CD73陽性率取平均值。
試驗結果：如表3所示。表3顯示，相比參照樣而言，實施例2-8製備得到的懸液在經擴增培養時，其細胞達80％融合時間短、鼠抗人PE標記的CD73(作為間充質幹細胞的標誌性抗原)陽性率高且其平行試驗的結果接近，這說明實施例2-8製備得到的懸液擴增培養速度快、得到的間充質幹細胞純度高，其產品品質高於參照樣，且實施例2製備得到的懸浮液為最佳樣品。
表3細胞表型鑑定的結果