Hivnc蛋白表達載體以及用其生產nc蛋白的方法

2023-05-13 18:58:41

專利名稱：：Hivnc蛋白表達載體以及用其生產nc蛋白的方法
技術領域：
：本發明涉及一種HIVNC蛋白表達載體以及用其生產NC蛋白的方法。更具體而言，本發明涉及其中分別在NC基因的上遊和下遊依次連接有內含子序列和mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體以及用其生產NC蛋白的方法。
背景技術：
：HIV(人免疫缺陷症病毒)的核殼蛋白(下文稱為'NC，)不僅在病毒組裝中起到結構性作用，且在病毒生命周期中也起著功能性作用，其作用如下文所述。首先，NC蛋白參與病毒的基因組包裝，這種功能是歸功於由特徵性Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys基序(CCHC基序)組成的兩個鋅指結構域。已知所述結構域在所有的逆轉錄病毒中均表現高保守性，並且在HIVRNA包裝和感染性病毒的生產中是必需的。其次，已經知道NC蛋白在病毒的逆轉錄(reversetranscription,RT)過程中會促進tRNA引物的退火和鏈轉移，由此可見NC蛋白在病毒複製中發揮重要的功能。第三，NC蛋白具有病毒生命周期中所必需的核酸伴侶蛋白的活性。另外，最近還有報導稱在病毒DNA插入宿主染色體中時NC蛋白也起到特定作用。因此，可以說對NC蛋白的研究對於闡明NC蛋白在HIV生命周期中的生物功能以及開發對核心的HIV蛋白有效的抗病毒製劑有著重要的意義。了解NC蛋白的體內生物學功能的必需前提條件是開發出在動物細胞中表達NC蛋白的有效方法。但是因病毒的密碼子使用與動物細胞的密碼子使用不同，或者由於所述病毒基因中的一些內包含抑制序列(INS),從而使HIV的其他結構蛋白在動物細胞中的表達受限。問題是即便NC蛋白與HIV的其他結構蛋白不同，不包含INS,它也很難在動物細胞中表達。因此，大部分對NC蛋白的研究都是通過利用在大腸桿菌(Em//)中表達的重組NC蛋白或通過利用基因分析來進行的。同時，也有一些實例是通過將稀有密碼子替換為宿主的優選密碼子(密碼子優化)來增強異源表達水平。例如，已有報導指出將BPV(牛乳頭狀瘤病毒)的晚期基因L1和L2針對哺乳動物的密碼子使用模式(CodonUsagePattern)進行密碼子優化，導致與野生型HPV的那些序列的表達水平相比水平，它們在哺乳動物細胞(Cos-l)培養物中的表達水平增加(Zhouet.al./.Wra/73,4972-4982,1999)。在上述研究中，將與在哺乳動物中相比在BPV中的出現頻率超過2倍的每個BPV密碼子(使用率>2)以及使用率超過1.5的大部分密碼子保守性地替換為優先使用的哺乳動物密碼子。在W097/3115號、WO97/48370號及WO98/34640號PCT申請(Merck&Co.,Inc.)中，已經證明通過對HIV基因或者其片段的密碼子優化增加了蛋白質表達，並且當將所述密碼子優化序列在宿主哺乳動物中用作DNA疫苗時提高了免疫性，針對所述宿主哺乳動物對該優化進行了調整。本發明的發明人已經著眼於這些問題，並且努力開發一種用於生產能夠解決這些問題的HIVNC蛋白的方法。但是已經發現僅通過密碼子優化尚不能表達野生型NC蛋白，而通過分別在NC基因的上遊和下遊額外連接內含子序列和mRNA穩定性元件和^f吏用這種RNA優化可表達出野生型的NC蛋白，並可顯著提高其表達效率，從而完成了本發明。
發明內容技術問題鑑於上述問題，本發明旨在於提供一種其中額外連接有內含子序列以及位於NC基因下遊的mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體以及一種用其生產NC蛋白的方法。技術方案為了達到上述目的，本發明提供一種其中額外連接有內含子序列以及位於NC基因下遊的mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體。此外，本發明提供用所述載體轉化的轉化體。此外，本發明提供利用所述載體生產HIVNC蛋白的方法。4有益效果本發明的其中依次連接有內含子序列以及位於NC基因下遊的mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體，可在動物細胞中表達野生型NC蛋白，並且與現有技術相比具有提高表達效率的作用。參照附圖所舉例說明的某些示例性實施方案詳細地描述本發明的上述及其他特徵，所述附圖在下文中僅通過舉例說明的方式給出，並且因此不是對本發明的限制，其中圖1是示出了對HIVNC多核苷酸密碼子優化前後的各密碼子偏好的圖2是示出了本發明的HIVNC蛋白表達載體pCMV(-HA)NC/RRE的製造過程的示意圖3是示出了本發明HIVNC蛋白表達載體pCMV(-HA)/OptiNC的製造過程的示意圖4是示出了本發明HIVNC蛋白表達栽體pCMV(-HA)OptiNC/RRE的製造過程的示意圖5示出了蛋白質印跡的結果(A及C)以比較用本發明的HIVNC蛋白表達載體轉化的細胞中NC蛋白的表達水平，以及示出了定量化的表達水平的數值的圖(B和D);圖6是蛋白質印跡的結果，其通過HIVNC蛋白表達載體中具有P-珠蛋白內含子的載體確定了NC蛋白表達水平。具體實施方式最佳模式下面參照實施例詳細說明本發明。但是，這些實施例只是為了舉例說明，並且並非意在通過這些實施例來限制本發明。實施例1OptiNC多核苷酸的合成為了增加HIV-1NC蛋白在哺乳動物細胞中的表達，可優化RNA的二級構造、GC含量及重複密碼子。在本實施例中通過Upgene:AWeb國BasedDNACodonOptimizationAlgorhhm(WentaoGao，AlexisRzewski，HuijieSun，PaulD.RobbinsandAndreaGambotto)和GenScriptCorporation(www.genscript.con)的密碼子頻率表進行了NC密碼子優化。首先，HIV-1NC的原始鹼基序列是通過使用下表1所公開的Upgene和GenScript的密碼子使用算法進行密碼子優化的，並且將各個概率評分(probabilityscore)換算為Upgene的評分，這在下表2中示出。參照所述表1和表2，給出了4個經密碼子優化的NC多核苷酸(Genscript01、Ge獄ript02、Genscript03、Upgene),其中選擇了經密碼子優化的NC多核苷酸序列GenScript01,並且在GenScript進行了合成。在所合成的密碼子優化的NC多核苷酸(SEQ.IDNO.13)的5'末端和3'末端中額外插入H/m/in和限制性內切酶位點，以進行克隆。GenScript01、GenScript02和GenScript03分別由SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7表示，這些是通過使用GenScript的密碼子使用算法進行密碼子優化的NC多核苷酸，而通過使用Upgene的密碼子使用算法進行密碼子優化的NC多核苷酸則由SEQ.IDNO.5表示。表l評分頻率胺基酸DNAUpgeneGenscriptALAGCT1718.6GCC5228.5GCA1416GCG177，6ARGCGT94.7CGC3910，9CGA76.3CGG1811.9AGA1011.5AGG1711.4ASNAAT2216.7AAC7819.5ASPGAT3222，3GAC6826CYSTGT319.9TGC6912，2GLjNCAA1211.8CAG8834.6GIjUGAA2429GAG7640.8GIjYGGT1010-8GGC5022.8GGA1216.3GGG2816.4HISCAT2210.4CAC7814.9工LEATT1815.77tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9KAAG828282CTGT31TGC6969FTTC808080NAAT22AAC7822CTGT31TGC6969GGGC505012KAAA18AAG8282EGAA24GAG7676GGGG28GGC5050HCAC7878781ATA6ATC7676AGCC5252get17KAAA18AAG8282NAAT22AAC7878CTGC696969RAGG17CGC39egg18AGCC525252PCCT19CCC4848RAGG17CGC39aga10KAAA18AAG8282KAAG828218GGGC505050CTGT31TGC6969WTGG100100100RAGA10CGC39aga10CTGT31TGC6969GGGA12GGC5050RAGG17CGC39aga1010tableseeoriginaldocumentpage11圖1中示出上述合成的HIVNC多核苷酸(GenScripteOl)的密碼子優化前(圖1A)後(圖IB)的各密碼子偏好。圖1示出了根據哺乳動物細胞中使用的密碼子偏好，在野生型NC及密碼子優化的NC序列中使用的密碼子百分比。'實施例2HIVNC蛋白表達載體的構建2-1pCMV(-HA)NC/RRE載體的構建構建了其中依次連接有SV40SD/SA內含子序列、HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表達載體。圖2顯示的是載體的構建過程。首先，為了擴增RRE，以pLPl載體(Invitrogen)為模板並且利用正向引物(5'-GCGCTCGAGAGGAGCTTTGTTCCTTGGG-3';SEQ.IDNO.1)和反向引物(5'-TAAGGTACCAGGAGCTGTTGATCCTTTA-3';SEQ.IDNO.2)進行了PCR。設計所述正向引物和反向引物以使其分別具有ATiol和K/ml限制性內切酶位點。將擴增的RRE用AT^I和進行處理。將用所述限制性內切酶處理的片段用已經用A%oI和J[/ml處理過的pCMV(-HA)NC栽體(韓國專利第0553154號)克隆，並將所得的產物命名為pCMV(-HA)NC/RRE。2-2pCMV(-HA)/OptiNC載體的構建構建了其中依次連接有SV40SD/SA內含子序列及密碼子優化的HIVNC(OptimizedHIVNC)基因的HIVNC蛋白表達栽體。圖3示出所述載體的構建過程。將在實施例1中合成的OptiNC基因(SEQ.IDNO.5)用五c0RI/H/m/in限制性內切酶處理，然後將用所述限制性內切酶處理的片段用已經用五"RI/^i'm/ni處理的pUC57載體(Genescript公司)克隆，並將所得的產物命名為pUC57/OptiNC。將所述pUC57/OptiNC和pcDNA4/TO(Invitrogen)用H/"^/III和五oRI消化之後連接，以獲得pcDNA4/TO/OptiNC。將上述pcDNA4/TO/OptiNC用及/m/ni和iVwl處理，然後將所述經消化的DNA用克倫諾(Klenow)片段處理。將pCMV(-HA)載體(ClontechLaboratories,Inc.)用JFcoRI和iVWl處理，然後將所迷經消^匕的DNA用克倫諾(Klenow)片段處理。將上述經克倫諾(Klenow)片段處理的兩個片段連接，並將所得的產物命名為pCMV(-HA)/OptiNC。2-3pCMV(-HA)OptiNC/RRE栽體的構建構建了其中依次連接有SV40SD/SA內含子序列、密碼子優化的HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表達載體。圖4示出栽體的構建過程。首先，pLP/OptiNC載體通過下面的方法製備將pLPl栽體(Invitrogen)用屍附/IA4wIT/5印EI處理，並且剪切出GAG-POL基因。將上述實施例2-2中製造的pCMV(-HA)/OptiNC栽體用A>I/￡^RI處理以獲得OptiNC基因。將上述pLPl栽體和獲得的OptiNC基因用克倫諾片段處理以進行平頭末端連接，並將所得的產物命名為pLPOptiNC/RRE載體。將所述獲得的pLPOptiNC/RRE載體用A7miIASVic77處理以獲得其中連接有OptiNC的基因片段，然後將所獲得的片段用已經用X附fllASflci7處理的pCMV(-HA)/OptiNC載體克隆。將所得的產物命名為pCMV(-HA)OptiNC/RRE。2-4pCMV(-HA)/FLAGNC載體的構建pCMV(-HA)/FLAGNC載體通過如下方法製造將通過用限制性內切酶Bgll和Pstl處理pJCl(HIVNucleocapsidProtein;ExpressioninE.coli，Puri打cationandCharacterization.J.Biol.Chem.268，16519畫16527，1993)獲得的NC基因片段插入到經過BamHl和Pstl處理的pCMVTag2B載體(Stratagene，USA)中，從而製得pCMVFLAGNC載體。然後，將pCMV(-HA)載體與通過用限制性內切酶Sall、Klenow片段和Xhol依次處理pCMVFLAGNC栽體獲得的FLAGNC基因片段連接起來，從而製得pCMV(-HA)FLAGNC載體。實施例3HIVNC蛋白的表達3-1細胞的轉化在包含1%鏈黴素/青黴素和10%(v/v)牛胚血清(FBS)的DMEM(DulbeccomodifiedEagle'smedium)中培養293T細胞。在轉化的前一天，將培養的細胞以1乂106個細胞/孔的密度接種在12孔板中，並且培養至約60-80%匯合。將在實施例2中製得的pCMV(國HA)NC/RRE、pCMV(-HA)/OpdNC和pCMV(-HA)OptiNC/RRE各取1將，並且分別與2jil的jetPEI製劑(Polyplus-transfectionInc.)混合，並且在室溫下在200pl的無血清培養液反應了20分鐘。之後，將裝有要轉化的細胞的孔分為3組，然後將細胞培養液用1ml的無血清培養液替換。將上述載體和jetPEI製劑的混合液添加到無血清培養液中的各細胞中，並且將其在二氧化碳細胞培養箱中繼續培養4小時。繼續培養後，將細胞培養液替換為含10%(v/v)FBS的DMEM培養液，然後繼續培養2天。然後收集細胞。3-2用於確認NC蛋白表達的蛋白質印跡為確認NC蛋白在上述轉化的細胞中的表達，進行了蛋白質印跡。首先，為了從所獲得的細胞中提取蛋白質，將各細胞用裂解溶液(50mMTris誦HCL(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA、1%TyitonX國lOO、1%脫氧膽酸鈉、1%SDS、蛋白酶抑制劑混合物)溶解，然後在15000rpm下離心20分鐘。收集上清液，然後進行15。/。SDS-PAGE。然後，釆用抗NC單克隆抗體進行蛋白質印跡分析，並將表達水平用數值表示(圖5)。結果，如圖5中所示，在用包含mRNA穩定性元件的pCMV(-HA)NC/RRE栽體轉化的細胞、用包含編碼優化的NC蛋白的序列的pCMV(-HA)/OptiNC載體轉化的細胞和用同時包含編碼mRNA穩定性元件和優化的NC蛋白的序列的pCMV(-HA)OptiNC/RRE載體轉化的細胞中，表達水平分別顯示為116.28IOD、267.88IOD和557.66IOD,這表明與包含野生型NC基因的pCMV(-HA)NC相比，在含有密碼子優化的NC基因的pCMV(-HA)OptiNC中，表達水平明顯得到提高(圖5C中的泳道2和泳道3)。由此可以看出當用密碼子優化的NC多核苷酸替換野生型NC基因時可以高產量表達NC蛋白。此外，發現比起其中未在NC基因下遊插入RRE序列的pCMV(-HA)NC,在包含mRNA穩定性元件的pCMV(-HA)OptiNC/RRE中，表達明顯提高(圖5C中的泳道2和泳道4)。由此可以看出RRE對NC蛋白的表達有影響，這說明通過在內含子序列下遊連接OptiNC和RRE序列的組合可以提高NC蛋白的表達。另外，可以看出通過使用本發明的載體可表達野生型NC蛋白，所述載體與其中在NC多核苷酸上遊進一步連接有FLAG基因的pCMV(-HA)FlagNC相似。實施例4利用pLPOptiNC/RRE載體生產NC蛋白為了確認在使用P-珠蛋白內含子序列而非SV4019smRNA內含子序列及經修飾的SV4016SmRNA內含子序列作為內含子序列的情況下，提高NC蛋白表達效率的作用，將上述實施例2-3中製造的pLPOptiNC/RRE載體按照與上述實施例3-1相同的方法轉化293T細胞，然後培養。隨後，為確認NC蛋白質的表達，按照與實施例3-2相同的方式進行了蛋白質印跡分析。結果，如圖6所示，發現在使用p-珠蛋白內含子序列的情況下，可以表達野生型NC蛋白，並且NC蛋白的表達水平與其中在NC多核苷酸上遊進一步連接有FLAG基因的pCMV(-HA)FlagNC相似(圖6中的泳3和泳道5)。本發明的模式下面詳細說明本發明。HIV核殼(NC)蛋白的生產對於開發有效的抗病毒製劑非常重要，但仍然難以在動物細胞內表達HIVNC蛋白。本發明的發明人已經進行了研究以改善這一問題，並且發現通過利用其中額外連接有內含子序列以及位於NC基因下遊的mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體可顯著提高HIVNC蛋白的表達。由此，本發明提供了其中依次連接有內含子序列、HIVNC基因及mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達栽體。更具體而言，本發明提供了其中依次連接有a)選自SV4019smRNA內含子序列、經修飾的SV4016SmRNA內含子序列以及P-珠蛋白內含子序列的任一個序列，b)HIVNC基因，及c)mRNA穩定元件的HIVNC蛋白表達載體。術語"HIVNC蛋白"是指引起AIDS(獲得性免疫功能喪失症候群)的HIV(人免疫缺陷型病毒)的核殼蛋白，上述蛋白質與病毒基因組RNA強烈結合以形成核糖核蛋白核心複合物。在本發明一個實施方案中所表達的HIVNC蛋白序列來源自ARVW/SF，並且祐乂>開為GenBankNo.P03349的第380~434位胺基酸序列。另外，在本發明的一個實施方案中使用的NC基因序列源自pJCl載體(HIVNucleocapsidProtein;Expressionin￡".co//，PurificationandCharacterization,/.5!》/.Ore附.268,16519-16527,1993)。本發明所使用的術語"表達"是指蛋白質或核酸在細胞中的生產。本發明所使用的術語"表達載體"是指能夠在適當的宿主細胞中表達目標蛋白或目標RNA的載體，並且是指包含必需調節元件的基因構建體，基因插入物以可表達的方式與所述必需調節元件可操作地連接。在本發明的表達載體中，啟動子(promoter)與其中依次連接有本發明的內含子序列、HIVNC基因及mRNA穩定性元件的結構基因可操作地連接以表達HIVNC蛋白。上述"啟動子"是指在特定宿主細胞中，調節與其可操作地連接的核酸序列表達的DNA序列，並且可使用在所有時間段都能連續地誘導目標基因表達的組成型啟動子，也可以使用在特定位置和時間誘導目標基因表達的誘導型啟動子。本發明使用的術語"可操作地連接，，是指核酸表達調節序列與編碼目標蛋白或RNA的核酸序列之間以可執行一般性功能的方式的功能性連接。例如，啟動子可與編碼蛋白或者RNA的核酸可操作地連接，並且可以影響所述編碼核酸序列的表達。與重組載體的可操作地連接可通過本領域中所公知的基因重組技術來實現，位點-特異性DNA切現。，。，、，^本發明的載體的實例包括但不限於質粒載體、粘粒載體、噬菌體載體和病毒載體。優選的表達載體可包括基因表達的調節元件，如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷化信號及增強子，並可根據不同目標製備各種載體。本發明中的栽體可優選地為圖2或圖4中所記栽的pCMV(-HA)NC/RRE載體或pCMV(-HA)OptiNC/RRE栽體。在本發明中，可以使用相關領域中已知的內含子序列，例如SV4019smRNA內含子序列、經修飾的SV4016SmRNA內含子序列及P-珠蛋白內含子序列。優選地使用由SEQ.IDNO.8所表示的SV4019smRNA內含子序列、SEQ.IDNO.9所表示的經修飾的SV4016smRNA內含子序列及SEQ.IDNO.10所表示的P-珠蛋白內含子序列。本發明的一個實施方案中所用的內含子序列源自pCMV-HA載體(ClontechLaboratories,Inc.)的內含子序列(SV40剪接供體/剪接受體；以下簡稱'SV40SD/SA，)。上述載體序列的第672~702位是16SV4019SmRNA內含子序列，上述載體序列的第672~768位是經修飾的SV4016SmRNA內含子序列。同時，可以使用編碼HIVNC蛋白的任何HIVNC基因，只要它能夠表達具有胺基酸序列SEQ.IDNO.4的HIVNC蛋白，並且可以是具有選自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任何核苷酸序列或野生型HIVNC基因。優選地，對本發明的HIVNC基因進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中高度表達。更具體而言，所述基因具有選自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任何核苷酸序列。本發明所使用的術語"密碼子優化"是指用於轉化各種宿主的核酸分子的編碼區域或基因，並且還指改變所述核酸分子編碼區域或基因內的密碼子以反映所述宿主生物的典型密碼子使用，同時不改變由該DNA編碼的多肽。在本發明的上下文中，為了在哺乳動物細胞中達到最佳表達，利用表1和表2對基因及DNA編碼區域進行密碼子優化。密碼子優化可合成全部(或部分)的DNA，以去除可能存在於所述轉錄的mRNA中的二級結構的任何去穩定序列或區域；也可以合成全部(或部分)的DNA，以將鹼基組成(basecomposition)改變為所需宿主細胞中更優選的那些。在本發明中，使用Upgene:AWeb-BasedDNACodonOptimizationAlgorithm(WentaoGao，AlexisRzewski，HuijieS叫PaulD.RobbinsandAndreaGambotto)和GenscriptCorporation(www.genscrit.con)的密碼子頻率表優化NC密碼子，籍此獲得以SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7來表示的HIV-NC多核苷酸序列，所述HIV-NC多核苷酸序列經過密碼子優化以在哺乳動物細胞中高度表達(參照實施例1)。本文中所使用的"mRNA穩定性元件，，是指結合在mRNA的3'末端以增加穩定性的穩定性元件，並且優選地可能是選自RRE(Rev反應元件)、WPRE(土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件)及P肌動蛋白3，UTR(非翻譯區)及RSV穩定性元件(勞斯氏肉瘤病毒穩定性元件)的任一元件。上述mRNA穩定性元件中RRE是指Rev反應元件(RRE)。RRE是存在於HIV-1RNA的env基因內的順式作用元件，並且與Rev蛋白17直接結合。WPRE是指源於土撥鼠肝炎病毒的轉錄後調控元件(PRE)，並且是指在轉錄後水平(post-transcriptionallevel)以順式(cis)起作用和調節自細胞核到細胞質的外排以增加基因轉錄物在細胞質內蓄積的病毒序列。P肌動蛋白3，UTR及RSV穩定性元件都是調節自細胞核到細胞質的輸送或者抑制分解以增加基因轉錄物在細胞質內蓄積的序列。在本發明的一個實施方案中，使用RRE鹼基序列作為mRNA穩定性元件，上述RRE源自HIVHXB2林系並且以GenBankAccessionNo.K03455為人所知。在上述序列中，與RRE對應的第7769~8002位的序列表示為SEQ.IDNO.11。同時，使用源自土撥鼠肝炎病毒的WHV8林系的序列(JournalofVirologyApr.l999，p.2886-2892)作為WPRE，並且將上面所示的序列中，對應於WPRE的第1093~1684位的序列表示為SEQ.IDNO.12。此外，可使用下述文獻中記載的序列作為P肌動蛋白3，UTR及RSV穩定元件性(The3'-endofthehumanbeta-actingeneenhancesactivityofthebeta-actinexpressionvectorsystem-constructionofimprovedvector"JournalofBiochemical&BiophysicalMethods.36(l):63誦72，1997:A3'UTRsequencestabilizesterminationcodonsintheunsplicedRNAofRoussarcomavirus.，RNA-APublicationoftheRNASociety"12(l):102-10,2006.)。另外，在本發明的一個實施方案中，構建了其中依次連接有SV40SD/SA內含子序列、HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表達載體，並且確認NC蛋白在用所述載體轉化的轉化體中高度表達(參照實施例3-2)。本發明中使用的標準重組DNA及分子克隆技術是相關領域所廣為人知的，並且在以下出版物中有記栽(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1989);bySilhavy,T.J.，Bennan，M丄.andEnquist,L.W"ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1984);andbyAusubel，F.M.etal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987))。此外，本發明提供了一種用所述HIVNC蛋白表達栽體轉化的細胞。HIVNC蛋白表達載體的轉染可使用常規的轉染方法來進行，例如DEAE-dextran介導的轉染、磷酸鈞轉染、顯微注射、含DNA的脂質體和lipofectamine-DNA複合體，這些方法在相關領域中是已知的。根據宿主細胞選擇適合的標準技術(MolecularCloning,ColdSpringHarbor,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。對於用本發明中的栽體轉化的細胞沒有特別的規定，但優選COS-7、293T、HEK293T、CHO及HeLa細胞，並且更優選COS國7細胞和293T細胞。此外，本發明提供了一種用於生產HIVNC蛋白的方法，包括培養用所述載體轉化的細胞的步驟。在本發明的一個實施方案中，使用本領域已知的方法培養了利用本發明的HIVNC蛋白表達栽體轉化的293T細胞。結果確認了表達野生型HIVNC蛋白(實施例3-2)。轉化體中表達的蛋白可通過各種常用方法來純化，所述方法可以單獨或組合使用，例如鹽析(例如，硫酸銨沉澱、磷酸鈉沉澱等)、溶劑沉澱(例如利用丙酮、乙醇等的蛋白質分級沉澱法)、透析、凝膠過濾、色謙法(如離子交換、反相色語)及超濾(Maniatisetal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,CIodSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，N.Y.(1982);Sambrooketal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2dED.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);Deutscher，M.，GuidetoProteinPurificationMethodsEnzymology，vol.l82.AcademicPress.Inc.，SanDiego，CA(1990))。本發明還提供了一種編碼HIVNC蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸經過密碼子優化以在哺乳動物細胞中高度表達。更具體地說，本發明的多核苷酸由選自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDN0.5、SEQ.IDNO.6及SEQ.IDNO.7的任一個鹼基序列組成。工業實用性如上所述，其中在NC基因的下遊中依次連接有內含子序列和mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體可在動物細胞中表達野生型NC蛋白，且與現有技術相比具有提高表達效率的作用。已經參照優選的實施方案詳細地描述了本發明。然是，本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的原則和精神的情況下可以對這些實施方案進行改變，本發明的範圍是在所附權利要求及其等效內容中限定的。權利要求1.一種HIVNC蛋白表達載體，其中在所述載體中依次連接有a)選自SV4019smRNA內含子序列、經修飾的SV4016smRNA內含子序列以及β-珠蛋白內含子序列的任一序列，b)編碼SEQ.IDNO.4的HIVNC(核殼)蛋白的基因；及c)mRNA穩定性元件。2.根據權利要求1所述的HIVNC蛋白表達載體，其中所述SV4019smRNA內含子序列具有由SEQ.IDNO.8組成的核苷酸序列，所述經修飾的SV4016smRNA內含子序列具有由SEQ.IDNO.9組成的核苷酸序列，並且所述P-珠蛋白內含子序列具有由SEQ.IDNO.10組成的核苷酸序列。3.根據權利要求1所述的HIVNC蛋白表達載體，其中所述基因具有選自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任一核苷酸序列。4.根據權利要求1所述的HIVNC蛋白表達載體，其中所述mRNA穩定性元件為選自RRE(Rev反應元件)、WPRE(土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件)、p-肌動蛋白3，UTR(非翻譯區)及RSV穩定性元件(勞斯氏肉瘤病毒穩定性元件)的任一元件。5.根據權利要求1所述的載體，其中所述HIVNC蛋白表達載體具有圖2或圖4所示的酶切圖。6.—種利用權利要求l-5任一項中所述的載體轉化的細胞。7.#據權利要求6所述的轉化細胞，其中所述細胞是COS-7或者293T細胞。8.—種用於HIVNC蛋白的方法，包括培養權利要求6所述的轉化細胞的步驟。9.一種用於在哺乳動物細胞中高度表達的經密碼子優化的HIVNC多核苷酸，包括由選自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任一核苷酸序列表示的核苷酸序列。全文摘要本發明涉及HIVNC蛋白表達載體以及用其生產NC蛋白的方法。更具體而言，本發明涉及其中在NC基因下遊依次連接有內含子序列和mRNA穩定性元件的HIVNC蛋白表達載體以及用其生產NC蛋白的方法。本發明的HIVNC蛋白表達載體——其中在NC基因下遊依次連接有內含子序列和mRNA穩定性元件——可以在動物細胞中表達野生型NC蛋白，且與現有技術相比具有提高表達效率的作用。文檔編號C12N15/09GK101578369SQ200780049710公開日2009年11月11日申請日期2007年12月20日優先權日2006年12月20日發明者柳志昌申請人:柳志昌;艾維克西根有限公司