血漿脂蛋白磷脂酶a2的時間分辨螢光免疫檢測方法及試劑盒的製作方法

2023-05-13 20:43:21

血漿脂蛋白磷脂酶a2的時間分辨螢光免疫檢測方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種血漿脂蛋白磷脂酶A2的時間分辨螢光免疫檢測方法，採用雙抗體夾心法結合時間分辨螢光免疫檢測方法測量血漿脂蛋白磷脂酶Lp-PLA2的含量，包括如下步驟：在包被有抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板上，加入Lp-PLA2標準品或離心後獲得的血清樣本到各自的微孔中，振蕩反應後用濃縮洗液洗滌，然後加入生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B，振蕩反應後濃縮洗液洗滌；加入鑭系元素標記的鏈黴親和素，然後振蕩反應後用濃縮洗液洗滌；加入增強液振蕩後，在紫外光的激發下發射螢光，用時間分辨螢光儀測定其螢光強度cps，對照標準曲線即可確定待測樣品中Lp-PLA2含量。本發明可定量測定樣本中Lp-PLA2的含量，具有靈敏度高、分析範圍寬、穩定性好、檢測快速且易於自動化的特點。
【專利說明】血漿脂蛋白磷脂酶A2的時間分辨螢光免疫檢測方法及試 劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體地涉及血漿脂蛋白磷脂酶A2 (LP-PLA2)的時 間分辨螢光免疫檢測方法。

【背景技術】
[0002] Lp-PLA2屬於磷脂酶A2超家族，主要由炎症細胞（如巨噬細胞、淋巴細胞等）分 泌。Lp-PLA2是由441個胺基酸組成的蛋白質，相對分子量約為45400,與磷脂酶A2家族其 餘成員不同的是，Lp-PLA2不需要鈣離子維持其催化活性。Lp-PLA2具有降解血小板活化因 子的活性，因此也被稱為血小板活化因子乙醯水解酶，它在動脈粥樣硬化部位大量存在，並 可被炎症介質調節，具有促動脈粥樣硬化的作用。Lp-PLA2是一種新的炎症反應標誌物，是 反映血管炎症的特異性標記物。
[0003] 目前用於檢測Lp-PLA2的試劑主要為酶聯免疫吸附法、化學發光免疫分析法、膠 乳增強比濁法與膠體金法原理產品。但酶聯免疫法存在檢測時間長，重複性差，自動化程度 不高等缺陷。化學發光免疫分析法存在穩定性與重複性差，檢測成本高等缺陷。膠乳增強 比濁法具有線性範圍窄，靈敏度差等缺陷。而膠體金法也存在靈敏度弱的缺陷。
[0004] 時間分辨螢光免疫分析法是以鑭系元素標記抗原或抗體，並與時間分辨測定技術 相結合而建立起來的一種新型非放射性微量分析技術，具有靈敏度高、發光穩定、突光壽命 長、自然螢光幹擾少、標準曲線範圍寬等特點。目前已在臨床檢測中廣泛應用。目前還沒有 報導專門用於檢測LP-PLA2的時間分辨螢光分析的免疫檢測方法，也沒有相應的試劑盒提 供。


【發明內容】

[0005] 發明目的：為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種建立一種基於時間分 辨螢光分析的血漿脂蛋白磷脂酶A2的時間分辨螢光免疫檢測方法，為Lp-PLA2的臨床分析 提供一種靈敏度高、分析範圍寬、穩定性好、檢測快速且易於自動化的檢測技術。
[0006] 技術方案：為實現上述技術目的，本發明建立了一種血漿脂蛋白磷脂酶A2的時間 分辨螢光免疫檢測方法，其特徵在於，採用雙抗體夾心法結合時間分辨螢光免疫檢測方法 測量血漿脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的含量，包括如下步驟：在包被有抗Lp-PLA2單克隆 抗體A的微孔板上，加入Lp-PLA2標準品或離心後獲得的血清樣本到各自的微孔中，振蕩反 應後用洗滌液洗滌，然後加入生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B，振蕩反應後洗滌液洗 滌；加入鑭系元素標記的鏈黴親和素，然後振蕩反應後用洗滌液洗滌；加入增強液振蕩後， 在紫外光的激發下發射螢光，用時間分辨螢光儀測定其螢光強度cps，對照標準曲線即可確 定待測樣品中Lp-PLA2含量。
[0007] 其中，所述的鑭系元素選自Eu3+、Tb3+、Sm 3+、Nd3+和Dy3+中的任意一種。優選地，所 述的鑭系元素為Eu3+。
[0008] 具體地，包被於微孔板上的Lp_PLA2單克隆抗體A與用生物素標記的抗Lp_PLA2 單克隆抗體B分別識別Lp-PLA2的不同表位且互不影響，其中，Lp-PLA2單克隆抗體A、B通 過單克隆雜交瘤細胞技術製備或者通過噬菌體抗體技術篩選獲得。
[0009] 所述的洗滌液為含0? 05wt% TWEEN-20的0? OlM磷酸鹽緩衝液（I XPBST)。
[0010] 所述的增強液包括如下組分：1L pH 3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液含 15 ii mol ￠-萘甲醯三氯丙酮、50 ii mol三正辛基氧化膦TOPO和IML曲拉通X-100。
[0011] 本發明的方法同樣可以用固相競爭法或固相抗原競爭法來代替。具體地，當使用 固相抗體競爭法時，將LP-PLA2和Eu3+標記抗原與固相抗體發生競爭結合，溫育洗滌後在固 相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含量呈負相關。
[0012] 當使用固相抗原競爭法時，將Lp-PLA2和固相抗原競爭性結合定量的Eu3+標記抗 體，溫育洗滌後在固相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含 量呈負相關。
[0013] 本發明同時提出了一種血漿脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的時間分辨螢光免疫檢 測試劑盒，其包括如下部分：包被有抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板、濃縮洗液、增強液、 鑭系元素標記的鏈黴親和素和生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B，其中，所述的包被有 抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板和用生物素標記的Lp-PLA2單克隆抗體B通過如下方法 製備：
[0014] (I) Lp-PLA2單克隆抗體A和Lp-PLA2單克隆抗體B的製備和純化：
[0015] 以增量培養法擴增雜交瘤細胞，所得細胞液經辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得 到單克隆抗體。
[0016] ⑵微孔板的包被：
[0017] 將純化後Lp-PLA2單克隆抗體A用包被液稀釋至l-10ng/ml，，96微孔板各孔加 100ul，4°C放置過夜；棄去包被液，用含0. 05wt% TWEEN-20的0. OlM磷酸鹽緩衝液衝洗兩 次，加150ul封閉液封閉，4°C放置過夜。棄去封閉液，真空抽乾，板條密封后放置_20°C冷凍 保存；
[0018] ⑶Lp-PLA2單克隆抗體B的生物素標記：將純化後Lp-PLA2單克隆抗體B使用磷 酸鹽緩衝液稀釋至1-lOng/ml，然後將Lp-PLA2單克隆抗體B與NHS活化的生物素按1:1混 合，避光反應30min，用50kDa的超濾膜柱去除可能未參與標記的NSH-Biotin,得到生物素 標記的Lp-PLA2單克隆抗體B。
[0019] 其中，包被於微孔板上的Lp-PLA2單克隆抗體A與用生物素標記的抗Lp-PLA2單 克隆抗體B分別識別Lp-PLA2的不同表位且互不影響，其中，Lp-PLA2單克隆抗體A、B通過 單克隆雜交瘤細胞技術製備或者通過噬菌體抗體技術篩選獲得。
[0020] 具體地，所述的包被液為pH9. 6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩衝液，所述的封閉液為 含0? 05wt% TWEEN-20、3g/L BSA的磷酸鹽緩衝液。
[0021] 所述的濃縮洗液為含Iwt % TWEEN-20的0. 2M磷酸鹽緩衝液（20 X PBST)。
[0022] 所述的鑭系元素選自Eu3+、Tb3+、Sm3+、Nd 3+和Dy3+中的任意一種。優選地，所述的 鑭系元素為Eu3+。
[0023] 所述的增強液包括如下組分：1L pH 3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液含 15 ii mol ￠-萘甲醯三氯丙酮、50 ii mol三正辛基氧化膦TOPO和IML曲拉通X-100。
[0024] 有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0025] (l)Lp-PLA2的臨床cut-off值為175ng/ml，包含在本試劑盒的檢測範圍內，可滿 足臨床需要；
[0026] (2)分析範圍廣，檢測範圍50-3000ng/ml ;
[0027] ⑶測量快速，易於自動化；
[0028] (4)使用鑭系元素進行標記，無放射性汙染
[0029] (5)抗幹擾能力強，根據鑭系元素螯合物的發光特點，可有效地排除非特異螢光 的幹擾。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖I :Lp_PLA2的時間分辨螢光分析檢測標準曲線圖；
[0031] 圖2 :Lp-PLA2時間分辨螢光分析方法檢測反應示意圖。其中，A:Lp-PLA2單克隆 抗體；B:Lp-PLA2蛋白；C:生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體；D:Eu3+-鏈黴親和素複合 物。

【具體實施方式】
[0032] 實施例是對本發明所提供的Lp-PLA2時間分辨螢光分析檢測方法的進一步說明， 但發明的實施不限於此，任何功能相同的替換均屬於本發明的保護範圍。
[0033] 實施例lLp-PLA2時間分辨螢光分析檢測試劑盒的製備。
[0034] (1)實驗溶液的配製：
[0035] 濃縮洗液：含lwt% TWEEN-20的0? 2M磷酸鹽緩衝液（20XPBST);
[0036] 洗滌液：含0. 05wt% TWEEN-20的0. OlM磷酸鹽緩衝液；該洗滌液由濃縮洗液稀釋 而得；
[0037] 增強液：1L pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液含ISiimoW-萘甲醯三氯丙酮 (3 -NTA)、50 ii mol 三正辛基氧化膦 TOPO 和 ImL 曲拉通 X-100 (Triton X100)。
[0038] (2) Lp-PLA2單克隆抗體A和Lp-PLA2單克隆抗體B的製備的製備與純化：
[0039] Lp-PLA2單克隆抗體A和Lp-PLA2單克隆抗體B為分別識別Lp-PLA2的不同表位 且互不影響，其中，Lp-PLA2單克隆抗體A和B均可以通過單克隆雜交瘤細胞技術製備或者 通過噬菌體抗體技術篩選獲得。本實施例中直接採用是市售的、識別Lp-PLA2不同表位的 兩種單抗。其中，Lp-PLA2單克隆抗體A選擇抗人脂蛋白磷脂酶A2 (Lp-PLA 2)單克隆抗體 (貨號CLM0019006,購買自深圳市常量醫學工程有限公司），Lp-PLA2單克隆抗體B選擇抗 人脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA 2)單克隆抗體（貨號CLM0019005,購買自深圳市常量醫學工程 有限公司），兩種單克隆抗體分別識別Lp-PLA2的不同表位。當然，兩種單克隆抗體可以交 換使用，只要保證兩種單克隆抗體識別Lp-PLA2的不同表位即可。
[0040] 分別以增量培養法擴增雜交瘤細胞，所得細胞液經辛酸-飽和硫酸銨法進行純 化，得到單克隆抗體。
[0041] (3)包被板的製備：
[0042] 將純化後Lp-PLA2單克隆抗體A用50mmol/L Na2C03-NaHC03PH9. 6緩衝液稀釋至 8ng/ml，96微孔板各孔加lOOul，4°C放置過夜。棄去包被液，用洗滌液（含0. 05% TWEEN-20 的磷酸鹽緩衝液（IXPBST))衝洗兩次，加150ul含3g/LBSA的上述緩衝液封閉，4°C放置過 夜。棄去封閉液，真空抽乾，板條密封后放置-20°C冷凍保存。
[0043] (5)抗體生物素標記：
[0044] Lp-PLA2單克隆抗體B的生物素標記：將純化後Lp-PLA2單克隆抗體B使用磷酸 鹽緩衝液稀釋至8ng/ml，然後將Lp-PLA2單克隆抗體B與NHS活化的生物素按1:1混合，避 光反應30min，用50kDa的超濾膜柱去除可能未參與標記的NSH-Biotin。
[0045] (5)測試：
[0046] A :樣品的準備：採集病人血液樣本，1500r/min離心5分鐘
[0047] B :檢測：
[0048] 雙抗體夾心法：取包被抗體的微孔板板條，加入100 陽性質控品Lp-PLA2標準 品或離心後獲得的血清樣本到各自的微孔中，陰性對照孔用PBS代替。37°C振蕩Ih後，洗 滌液洗3次。每孔加入IOOul生物素標記的Lp-PLA2單克隆抗體，37°C振蕩Ih後，滌液洗 3次。每孔加入IOOul Eu3+-鏈黴親和素複合物，37°C振蕩Ih後，洗滌液洗3次。每孔加入 200ul增強液，37°C振蕩15min，與時間分辨分析儀讀數。從標準曲線計算樣品中的Lp-PLA2 含量，見圖1。
[0049] 在測定前需要注意：使用之前將所有的試劑回升至室溫（18-30°C );使用之後立 即將所有的試劑放回2-8°C ;如果樣品量大建議使用多通道移液器；在所有恆溫孵育過程 中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。
[0050] 可能的替換方案：
[0051] 固相抗體競爭法：將Lp_PLA2和Eu3+標記抗原與固相抗體發生競爭結合，溫育洗漆 後在固相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含量呈負相關。
[0052] 固相抗原競爭法：將Lp-PLA2和固相抗原競爭性結合定量的Eu3+標記抗體，溫育洗 滌後在固相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含量呈負相 關。
[0053] 實施例2Lp-PLA2時間分辨螢光分析檢測試劑盒的精確度、準確度和穩定性測試。
[0054] 1.試劑盒的準確度、精確度分析實驗：
[0055] 對207ng/ml Lp-PLA2的標準溶液（pH7. 4、0. 05M的磷酸鹽緩衝液）進行20次檢 測。207ng/ml是Lp-PLA2預測心腦血管疾病高發病風險的臨界值，方法的高精確度有利於 對發病風險的準確判斷。20次檢測結果的平均值為204. 64ng/ml，標準差為8. 26,變異率 為4. 03%。結果顯示，檢測結果與實際濃度較為接近，準確度較高，同時變異率〈5 %，具有 較好的精確度。
[0056] 2.試劑盒穩定性試驗：
[0057] 試劑盒保存條件為2_8°C，保存6個月後，測定試劑盒的各項指標，發現均在正常 範圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37°C保存的條 件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑 盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-20°C冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全 正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2-8°C至少可以保存6個月以上。
[0058] 實施例3Lp-PLA2時間分辨螢光分析檢測試劑盒與ELISA檢測試劑盒的比較。
[0059] 選擇高、中、低三個濃度的Lp-PLA2標準品溶液，以本試劑盒和ELISA檢測試劑盒 同時進行分析，每個濃度檢測5次，將所得結果進行比較，確定兩種方法的一致性。高濃度 選擇1000ng/ml，中濃度選擇300ng/ml，低濃度選擇80ng/ml。得到的檢測結果如下表：
[0060]

【權利要求】
1. 一種血漿脂蛋白磷脂酶A2的時間分辨螢光免疫檢測方法，其特徵在於，採用雙抗 體夾心法結合時間分辨螢光免疫檢測方法測量血漿脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的含量，包 括如下步驟：在包被有抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板上，加入Lp-PLA2標準品或離心 後獲得的血清樣本到各自的微孔中，振蕩反應後用洗滌液洗滌，然後加入生物素標記的抗 Lp-PLA2單克隆抗體B，振蕩反應後洗滌液洗滌；加入鑭系元素標記的鏈黴親和素，然後振 蕩反應後用洗滌液洗滌；加入增強液振蕩後，在紫外光的激發下發射螢光，用時間分辨螢光 儀測定其螢光強度cps，對照標準曲線即可確定待測樣品中Lp-PLA2含量。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的鑭系元素選自Eu3+、Tb3+、Sm 3+、 Nd3+和Dy3+中的任意一種。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，包被於微孔板上的Lp-PLA2單克隆 抗體A與用生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B分別識別Lp-PLA2的不同表位且互不影 響，其中，Lp-PLA2單克隆抗體A、B通過單克隆雜交瘤細胞技術製備或者通過噬菌體抗體技 術篩選獲得。
4. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的洗滌液為含0.05wt % TWEEN-20的0. 01M磷酸鹽緩衝液。
5. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的增強液包括如下組分：1L pH 3. 2的鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液含15 y mol 0 -萘甲醯三氯丙酮、50 y mol三正辛基氧化膦 T0P0 和 1ML 曲拉通 X-100。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的雙抗體夾心法可以用固相抗體競 爭法或者固相抗原競爭法替代： 其中，當用固相抗體競爭法替換時，將Lp-PLA2和Eu3+標記抗原與固相抗體發生競爭結 合，溫育洗滌後在固相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含 量呈負相關。 當用固相抗原競爭法替換時，將Lp-PLA2和固相抗原競爭性結合定量的Eu3+標記抗體， 溫育洗滌後在固相中加入螢光增強液，測定螢光強度，所測得的螢光強度與Lp-PLA2含量 呈負相關。
7. -種血漿脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的時間分辨螢光免疫檢測試劑盒，其特徵在 於，包括如下部分：包被有抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板、濃縮洗液、增強液、鑭系元 素標記的鏈黴親和素和生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B，其中，包被於微孔板上的 Lp-PLA2單克隆抗體A與用生物素標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體B分別識別Lp-PLA2的 不同表位且互不影響，所述的包被有抗Lp-PLA2單克隆抗體A的微孔板和用生物素標記的 Lp-PLA2單克隆抗體B通過如下方法製備： (1) Lp-PLA2單克隆抗體A和Lp-PLA2單克隆抗體B的製備和純化： 以增量培養法擴增雜交瘤細胞，所得細胞液經辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，分別得 到Lp-PLA2單克隆抗體A和Lp-PLA2單克隆抗體B ; (2) 微孔板的包被： 將純化後Lp-PLA2單克隆抗體A用包被液稀釋至1?10ng/ml，96微孔板各孔加100ul， 4°C放置過夜；棄去包被液，用含0. 05wt% TWEEN-20的磷酸鹽緩衝液衝洗兩次，加150ul封 閉液封閉，4°C放置過夜。棄去封閉液，真空抽乾，板條密封后放置_20°C冷凍保存； (3) Lp-PLA2單克隆抗體B的生物素標記：將純化後Lp-PLA2單克隆抗體B使用磷酸鹽 緩衝液稀釋至1?l〇ng/ml，然後將Lp-PLA2單克隆抗體B與NHS活化的生物素按1:1混 合，避光反應30min，用50kDa的超濾膜柱去除可能未參與標記的NSH-Biotin，得到生物素 標記的Lp-PLA2單克隆抗體B。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的包被液為pH9. 6、5 Ommo 1 /L Na2C03-NaHC03緩衝液，所述的封閉液為含0. 05wt% TWEEN-20、3g/LBSA的磷酸鹽緩衝液。
9. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的濃縮洗液為含lwt% TWEEN-20 的0. 2M磷酸鹽緩衝液。
10. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的增強液包括如下組分：1L pH 3. 2的鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液含15 y mol 0 -萘甲醯三氯丙酮、50 y mol三正辛基氧化膦 T0P0 和 1ML 曲拉通 X-100。
【文檔編號】G01N33/68GK104360074SQ201410609662
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】楊子學 申請人:楊子學