製備多能心血管前體細胞及維持其心血管分化能力的方法
2023-05-13 20:49:46 1
製備多能心血管前體細胞及維持其心血管分化能力的方法
【專利摘要】本發明涉及製備多能心血管前體細胞及維持其心血管分化能力的方法。首次揭示一種高效誘導多能幹細胞分化為多能心血管前體細胞的方法，包括採用抗壞血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制劑進行誘導。本發明還提供了穩定培養多潛能心血管前體細胞的方法，包括採用BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑使之穩定生長和傳代。本發明獲得的多潛能心血管前體細胞，能夠進一步分化為心血管譜系的一些細胞如心肌細胞、血管平滑肌細胞或血管內皮細胞，可用於心臟疾病的治療和心肌再生研究、藥物心血管細胞毒性檢測、心臟藥物的開發。
【專利說明】製備多能心血管前體細胞及維持其心血管分化能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞生物學領域；更具體地，本申請涉及誘導多能幹細胞衍生多能心血管前體細胞及維持心血管前體細胞心血管分化能力的方法。
【背景技術】
[0002]人多能幹細胞(human pluripotent stem cells (hPSCs)),包括人胚胎幹細胞(embryonic stem cells,ESCs)和誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，因為其可在體外無限增殖及具有分化成心臟主要細胞類型的能力，為心血管研究、藥物研發和安全性測試和基於細胞治療的再生醫學提供了一個全新的機遇。但為避免其直接移植的致瘤性，必須將這類細胞定向誘導分化成組織前體細胞和組織細胞。因此，在過去的十多年中，研究者們為了將人多能幹細胞定向分化為心血管細胞，特別是分化到成熟心血管細胞類群，諸如心肌細胞、平滑肌細胞、內皮細胞，進行了不懈的探索，並取得了一定的進展，但是在這方面仍存在諸多問題。如，誘導過程耗時長(2~4周)，在組織細胞的產出和純度方面，不同細胞系之間存在巨大的差異；而且在分化體系中殘留的未分化細胞有致瘤性潛能增加了其臨床應用安全的新顧慮；更重要的是對於受損心臟的移植研究發現這種細胞療法僅能實現瞬時弱小的功能改善。這可能是由於這些完全分化的心肌細胞的不成熟性和有限的增殖能力、以及血管形成不夠完善導致的氧氣和養分供給不足造成的(Lam，J.T.等(2009)，Pediatr.Cardiol.30，690-698)。
[0003]心臟發育是一個高度精密調控的過程，涉及程序性誘導中胚層、多能心血管前體細胞(或稱為心血管祖細胞，cardiovascular progenitor cells (CVPCs)以及功能性心血管細胞。多能心血管前體細胞可從人多能幹細胞分化而來，理論上具有在體外多次傳代的潛能，並且沒有致瘤性，從而為心肌再生提供了一個極具吸引力的替代途經。更重要的是，當CVPCs在體內暴露於心臟的旁分泌微環境中能夠分化成具有完善橫紋結構的成熟心肌細胞。用人胚胎幹細胞(Yang，L.等(2008) ；Nature 453，524-528)和小鼠誘導多能性幹細胞(Mauritz, C.等(2011) ；Eur.Heart J.32，2634-2641)分化得來的 CVPCs 進行移植研究發現，反映左心室射血分數的心臟功能的改善程度分別達到了 31%和39-69%，遠高於單純心肌細胞注射的(5%-10%)療效。因此，人多能幹細胞分化得來的CVPCs對於心臟再生醫學和心血管系統的發育生物學和幹細胞生物學有著良好應用價值。
[0004]已有的文獻報導從人胚胎幹細胞誘導分化CVPCs需要經4~6天內程序性加入五種生長因子，通過調節多種信號轉導通路，包括骨形態發生蛋白(BMP)，成纖維細胞生長因子(FGF)、激活素(Activin)/Nodal、血管內皮生長因子(VEGF)和Wnt，採用類胚體、牛血清或滋養層細胞共培養可達到10-60%的分化效率(Yang et al.,2008 ；Bu et al.,2009 ；Blinet al.,2010b ；Kattman, S.J.等(2011).CellStem Cell 8,228-240)。本發明人在之前等研究中已發現，絲裂原活化蛋白激酶(MEK)-ERK1/2信號通路的激活在抗壞血酸(AA)促進iPSC衍生CVPCs/心肌前體細胞的過程中起著至關重要的作用(Cao，F.等(2008).PLoS.0ne.3, e3474)。[0005]然而，簡單且可重複的、無需經過細胞分選並在無滋養層細胞/無血清的條件下高效轉化hPSCs成均一的CVPCs仍然充滿挑戰，且對於CVPCs的自我更新與分化決定的調控和分子基礎仍然知之甚少，在體外穩定擴增由HPSC衍生的CVPCs，使其長期維持自我更新和定向分化為心血管細胞的潛能仍是領域內的一項重大的挑戰。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供誘導多能幹細胞衍生多潛能心血管前體細胞及維持心血管前體細胞心血管分化能力的方法。
[0007]在本發明的第一方面，提供一種製備心血管前體細胞(誘導多能幹細胞分化為心血管前體細胞)的方法，包括:以抗壞血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制劑誘導多能幹細胞，使之分化為心血管前體細胞。
[0008]在一個優選例中，所述的抗壞血酸(AA)的工作濃度為20-100 μ g/ml (較佳的為30-80 μ g/ml ;更佳的為40-60 μ g/ml);所述的骨形成蛋白4(BMP4)的工作濃度為10-80ng/ml (較佳的為15_60ng/ml ;更佳的為20_40ng/ml);或所述的糖原合成酶激酶3抑制劑的工作濃度為1-6 μ M(較佳的為1.5-5 μ M ;更佳的為2-4 μ Μ)。
[0009]在另一優選例中，所述的多能幹細胞用含有Rho激酶抑制劑的CIM培養基培養15-30小時(較佳的20-28小時；更佳的22-26小時)；之後用不含Rho激酶抑制劑的CM培養基繼續培養40-60小時(較佳的42-55小時；更佳的44-52小時)；其中，所述的CIM培養基是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了:
[0010]0.8-5%(較佳的為1-4% ;更佳的為1.5-3%) ν/ν Β27添加物，
[0011]0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) v/v L-穀氨醯胺，
[0012]0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) ν/ν青-鏈黴素，
[0013]100-800 μ M(較佳的為 200-600 μ M ;更佳的為 300-500 μ Μ) α-硫代甘油，
[0014]20-100 μ g/ml (較佳的為 30-80 μ g/ml ;更佳的為 40-60 μ g/ml)抗壞血酸(AA),
[0015]10_80ng/ml (較佳的為15_60ng/ml ;更佳的為20_40ng/ml)骨形成蛋白4,和
[0016]1-6 μ M(較佳地為1.5-5 μ M ;更佳地為2_4 μ Μ)糖原合成酶激酶3抑制劑。
[0017]在另一優選例中，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑包括CHIR99021。
[0018]在另一優選例中，所述的多能幹細胞包括:胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞；或所述的多能幹細胞是人多能幹細胞。
[0019]在另一優選例中，獲得心血管前體細胞之後，還包括步驟:穩定培養心血管前體細胞，包括:在心血管前體細胞的培養基中加入BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑，使之穩定生長或傳代(即:維持增殖、不發生顯著分化)。
[0020]在另一優選例中，所述的BMP抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且
[0021]所述dorsomorphin的工作濃度為0.5-8 μ M(較佳的1-6 μ M ;更佳的1.5-4 μ Μ)；
[0022]所述的Α83-01的工作濃度為0.1-2 μ Μ(較佳的0.2-1.2 μ M ;更佳的0.3-1 μ Μ)；
[0023]所述的CHIR99021的工作濃度為0.8-8 μ Μ(較佳的1-6 μ M ;更佳的2-4 μ Μ)。
[0024]在另一優選例中，穩定培養心血管前體細胞的培養基是CPM培養基，其是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了:
[0025]0.8-5%(較佳的為1-4% ;更佳的為1.5-3%) ν/ν Β27添加物，
[0026]0.4-3%(較佳的為 0.5-2% ;更佳的為 0.8-1.5%) ν/ν Ν2 添加物，
[0027]0.3-3%(較佳的為 0.5-2% ;更佳的為 0.8-1.5%) (v/v) L-穀氨醯胺，
[0028]0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (ν/ν)非必需胺基酸儲存液，
[0029]0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (ν/ν)青-鏈黴素，
[0030]0.05-0.3mM(較佳的 0.06-0.2mM ;更佳的 0.08-0.15mM) β -巰基乙醇
[0031]100-800 μ M(較佳的為 200-600 μ M ;更佳的為 300-500 μ Μ) α-硫代甘油，
[0032]0.5-8 μ Μ(較佳的 1-6 μ M ;更佳地 1.5-4 μ M) dorsomorphin,
[0033]0.1-2 μ M(較佳的 0.2-1.2μΜ ;更佳的 0.3-1 μ Μ) Α83-01，和
[0034]0.8-8 μ Μ(較佳的 1-6μΜ ;更佳的 2-4yM)CHIR99021。
[0035]在本發明的另一方面，提供一種穩定培養心血管前體細胞的方法，包括:在心血管前體細胞的培養基中加入BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑 製劑，使之穩定生長或傳代(即:維持增殖但不發生顯著分化)。
[0036]在一個優選例中，所述的BMP信號通路抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且所述dorsomorphin的工作濃度為0.5-8 μ M(較佳的1-6 μ M ;更佳的1.5-4 μ Μ);所述的Α83-01的工作濃度為0.1-2 μ Μ(較佳的0.2-1.2 μ M ;更佳的0.3-1 μ Μ);所述的CHIR99021的工作濃度為0.8-8 μ Μ(較佳地1-6 μ M ;更佳的2-4 μ Μ)。
[0037]在本發明的另一方面，提供一種用於製備心血管前體細胞的培養基，其是DMEM/F12培養基，且包括20-100 μ g/ml (較佳的為30-80 μ g/ml ;更佳地為40-60 μ g/ml)抗壞血酸(AA), 10_80ng/ml (較佳的為15_60ng/ml ;更佳地為20_40ng/ml)骨形成蛋白4,和
1-6 μ M(較佳的為1.5-5 μ M ;更佳的為2-4 μ Μ)糖原合成酶激酶3抑制劑。
[0038]在另一優選例中，所述的用於製備心血管前體細胞的培養基還包括:2%ν/ν量Β27添加物，0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (v/v) L-穀氨醯胺，0.3_3%(較佳的為 0.5-2% ;更佳的為 0.8-1.5%) (ν/ν)青-鏈黴素，100-800 μ Μ(較佳的為 200-600 μ M ;更佳的為300-500 μ Μ) α -硫代甘油。
[0039]在另一優選例中，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑包括CHIR99021。
[0040]在本發明的另一方面，提供所述的用於製備心血管前體細胞的培養基的用途，用於誘導多能幹細胞分化為心血管前體細胞。
[0041]在本發明的另一方面，提供一種用於穩定培養心血管前體細胞的培養基，其是DMEM/F12培養基，且包括:ΒΜΡ信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑。
[0042]在另一優選例中，所述用於穩定培養心血管前體細胞的培養基中，所述的BMP信號通路抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01,所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且所述的dorsomorphin的濃度為0.5_8μΜ(較佳的
1-6 μ M ;更佳的1.5-4 4]?)，所述的483-01的濃度為0.1_2 4]?(較佳的0.2-1.2μΜ ;更佳的
0.3-1 μ Μ)Α83-01，所述的 CHIR99021 的濃度為 0.8-8 μ Μ(較佳的 1-6 μ M ;更佳的 2-4 μ Μ)CHIR99021。[0043]在另一優選例中，所述的用於穩定培養心血管前體細胞的培養基，中還包括:2%v/V量B27添加物，P/ov/v量N2添加物，0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (v/V)L-穀氨醯胺，0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (v/v)非必需胺基酸儲存液，0.3-3%(較佳的為0.5-2% ;更佳的為0.8-1.5%) (v/v)青-鏈黴素，0.05-0.3mM(較佳的0.06-0.2mM ;更佳的 0.08-0.15mM) β -巰基乙醇，100-800 μ M(較佳的為 200-600 μ M ;更佳的為300-500 μ Μ) α -硫代甘油。
[0044]在本發明的另一方面，提供所述用於穩定培養心血管前體細胞的培養基的用途，用於穩定培養心血管前體細胞。
[0045]在本發明的另一方面，提供一種含心血管前體細胞的細胞群，其通過前面任一所述的方法製備獲得。[0046]在本發明的另一方面，提供所述的含心血管前體細胞的細胞群的用途，用於製備心肌細胞、血管平滑肌細胞或血管內皮細胞。
[0047]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0048]圖1、人多能性幹細胞衍生的心血管祖細胞的誘導(CVPCs)。
[0049](A)分化方法概要。CM，CVPC誘導培養基，Y，Υ27632。
[0050](B)在各種條件下SSEAl+細胞的百分比和3天的分化後的總細胞數，(平均值土SEM，η=3時)。NC，無細胞因子的對照；-表示撤除。CHIR，CHIR99021 ;ΑΑ，抗壞血酸，Cluster表示以細胞團塊替代單細胞。*P〈0.01，與NC相比較。# P〈0.01，與CM相比較。
[0051](C)免疫螢光分析顯示CM處理的細胞在分化第3天表達CVPC標記物。比例尺=25微米。
[0052](D-E)定量PCR(D)和流式細胞術(E)分析在心血管誘導的過程中多能性標誌物的表達下調和CVPC標記物的表達上調(N=3)。
[0053](F)不同的人多能性幹細胞系的CVPCs誘導效率。百分數(%)表示細胞群中攜帶相應表面標記的細胞的比例。
[0054]圖2、H9人類胚胎幹細胞系誘導衍生的均質CVPCs的特徵。
[0055](A)相差圖像顯示H9人類胚胎幹細胞系在CVPC誘導培養基處理誘導CVPC分化過程中細胞形態。比例尺=100微米。
[0056](B)免疫螢光分析顯示細胞在CM處理3天後表達心血管祖細胞(CVPC)的標記ISL1，但不表達內胚層標記S0X17。比例尺=25微米。
[0057]圖3、CVPCs維持和擴增的條件檢測。
[0058](A)相差圖像顯示在10種信號抑制劑條件下P2代(passage 2，指擴增第2代)或p8代(passage 8,指擴增第8代)CVPCs形成的克隆形態。比例尺=100 μ m.[0059](B)相差圖像顯示在PD，SU或FGF2存在或不存在的條件下p5代CVPCs的克隆形態。PD，絲裂原活化蛋白激酶抑制劑H)0325901 ;SU，成纖維細胞生長因子受體抑制劑SU5402。表示去除；+,表示加入。比例尺=100微米。
[0060]圖4、人多能性幹細胞衍生的心血管祖細胞長期維持培養。[0061](A-C)CVPCs在各種條件下培養5天後，相差圖像(A，上圖)，MESPl+細胞百分比(A，下圖)，總細胞數(B，N=3)，CVPC，心肌，平滑肌，和內皮細胞標記物的表達(C)。Basal，基礎培養基；CPM，CVPC 擴增培養基；D0R, Dorsomorphin ο *Ρ〈0.01 與 Basal 相比較;# Ρ〈0.01與CPM相比較。
[0062](D-E) CVPCs典型形態的圖像(D，左側圖)，流式細胞術展示SSEAl和MESPl的表達(D，中間和右側圖)，和免疫組化(E)展示ISLl和MESPl在第15代CVPC克隆中的表達。
[0063](F-G) CVPCs的生長曲線(F)，平均倍增時間(G組，η=3)。*Ρ〈0.05與Ρ3相比較。
[0064](H)細胞劑量反應顯示CVPCs的種植數目和克隆形成數目之間的關係示意圖。Ν=3。比例尺=100微米。
[0065]圖5、CVPCs的致瘤性分析。
[0066](A)代表圖像顯示小鼠左腿在注射Η9胚胎幹細胞後畸胎瘤形成(左圖);右腿在注射PO或Ρ15代的Η9衍生的CVPCs後畸胎瘤缺失(右圖)。
[0067](Β)Η9胚胎幹細胞和PO或P15CVPCS的畸胎瘤形成能力的概括。
[0068]圖6、CVPCs的體外分化潛能。
[0069]⑷誘導CVPC分化的條件概要
[0070](Β)Ρ15代的C VPCs的心肌細胞，平滑肌細胞和內皮細胞的分化潛能的相差圖像和免疫組化分析。比例尺=50微米。
[0071 ] (C) PO和P15CVPCS分別按特定的分化方案處理12天，處理之前和之後的cTnT+(心肌細胞)，a -SMA+(平滑肌)和PECAMl+(內皮細胞)的代表圖(左圖)和平均類群分析。n=3。*P〈0.01與CVPC相比較。
[0072](D) RT-PCR分析顯示各組之間心血管衍生物的標誌物的表達。
【具體實施方式】
[0073]本發明人經過長期而廣泛的研究，首次揭示一種高效誘導多能幹細胞分化為多潛能心血管前體細胞的方法，包括採用抗壞血酸(AA)、骨形成蛋白4(ΒΜΡ4)和糖原合成酶激酶3抑制劑進行誘導。本發明還提供了穩定培養多潛能心血管前體細胞的方法，包括採用BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑使之穩定生長和傳代。本發明獲得的多潛能心血管前體細胞，能夠進一步分化為心血管譜系的一些細胞如心肌細胞、血管平滑肌細胞或血管內皮細胞，可用於心臟疾病的治療和心肌再生研究、藥物心血管細胞毒性檢測、心臟藥物的開發。
[0074]幹細胞的定向分化的難點在於:①定向分化效率低分化的目的細胞純度低，難於富集；③分化的細胞的真實性。本發明人針對這三個難題，對幹細胞向心血管前體細胞的分化進行了深入探索和優化，成功獲得含高比例心血管前體細胞的細胞群，並通過細胞表面分子的分析確證了所獲得的細胞群的真實性。
[0075]本發明中，以胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞作為初始細胞來製備心血管前體細胞。胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞的培養是本領域人員已知的技術。
[0076]如本發明所用，所述的胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞是哺乳動物的胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞；或是通過商業途徑購買的，而並非通過破壞胚胎的方式獲得的胚胎幹細胞。所述的胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞例如是人或非人哺乳動物的胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞，所述的非人哺乳動物如兔、鼠、羊、豬、猴。較佳的，所述的胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞優選的是人胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞。
[0077]早在1998年人胚胎幹細胞和胚胎生殖細胞就已經建系成功，例如1998年Thomson領導的小組從14個囊胚中最終建立起5個人類ES細胞系:H1、H13、H14、H7和H19 ；Gearhart領導的小組從5_9周齡的流產胎兒的性腺嵴及腸繫膜中分離原始的幹細胞，以期避免因直接利用胚胎所造成的倫理學上的麻煩。見晁嵐等，「人胚胎幹細胞的研究進展」，《現代婦產科進展》，2003年7月第12卷第4期。基於上述工作，在2000年的2月份，Wisconsin Alumni ResearchFoundation (WARF)建立了 WiCell, WiCell 是一家非官方的、非盈利性的附屬機構，它以低費用向合格的科學家分配人胚胎幹細胞。此外，提供這種現成的人胚胎幹細胞的機構還包括NSCB(National Stem Cell Bank)、ES CELLINTERNATIONAL.novcell、TECHN10N-H0ME TO ISRAEL』 S NOBELSCIENTISTS, UCSF(University of CaliforniaSan Fransi sco)等機構。
[0078]製備心血管前體細胞的方法
[0079]本發明提供一種製備心血管前體細胞的方法，所述方法包括:以抗壞血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制劑誘導多能幹細胞，使之分化為心血管前體細胞。
[0080]以往，通過4~6天內程序性加入五種生長因子來誘導心血管前體細胞，步驟複雜且誘導效率不高。本發明人在深入研究中意外地發現，抗壞血酸(AA)、骨形成蛋白4(BMP4)和糖原合成酶激酶3抑制劑協同發揮作用，非常有效地誘導胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞定向分化為心血管前體細胞，誘導效率顯著提高。
[0081]作為本發明的優選方式，所述的抗壞血酸(AA)的工作濃度為20-100 μ g/ml ;所述的骨形成蛋白4(BMP4)的工作濃度為10-80ng/ml ;所述的糖原合成酶激酶3抑制劑的工作濃度為1_6μΜ。較佳地，所述的抗壞血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制劑被包含在誘導培養基(CM)中；更佳地，所述的CM培養基是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了:Β27添加物，L-穀氨醯胺，青-鏈黴素，α-硫代甘油，抗壞血酸，骨形成蛋白4，和CHIR99021。
[0082]維持心血管前體細胞穩定的方法
[0083]本發明還提供了一種穩定培養心血管前體細胞，包括:在心血管前體細胞的培養基中加入BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑，使之穩定生長或傳代(即:不發生顯著分化)。較佳地，所述的BMP抑制劑是Dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01,所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021。更佳地，所述Dorsomorphin的工作濃度為0.5-8 μ M ;所述的Α83-01的工作濃度為0.1-2 μ M ;所述的CHIR99021的工作濃度為0.8-8 μ Μ。
[0084]細胞群
[0085]本發明還包括採用前述的製備方法獲得的含心血管前體細胞的細胞群。所述的細胞群中，心血管前體細胞數量佔細胞整體數量的70%以上，較佳地佔細胞整體數量的80%以上；更佳地佔細胞整體數量的85%以上(以表面標記物SSEAl或MESPl陽性的細胞統計)。
[0086]獲得了含心血管前體細胞的細胞群之後，利用RT-PCR以及其它基因表達分析技術，能夠實現心血管前體細胞的鑑定。[0087]可以採用本領域技術人員已知的方法來鑑定或分離或富集心血管前體細胞。較為經典的方法如螢光激活的細胞分選技術(FACS)或磁性細胞分選法，也即利用抗心血管前體細胞特定表面分子的抗體從總的細胞群中分離表達心血管前體細胞特定表面分子的細胞群。優選的方法例如是FACS法。各種細胞都有相應的表面分子表達方式，通過免疫螢光標記技術將細胞表面分子同標記有特異染料或螢光的一種或以上特異性抗體結合後，在流式細胞儀同一雷射光源激發下可產生一種或集中特異螢光色，由螢光檢測器對每個細胞的體積、結構、螢光種類及性質等多種參數同時測定，從而可分析得到細胞群體的多種表面分子的表達情況，或分選出特定細胞。FACS法是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的細胞分析或分選技術，利用合適的細胞表面分子，通過FACS法來分析或分選細胞是本領域人員熟知的技術。
[0088]因此，本發明還包括經過分選技術分離出來的心血管前體細胞含量更高的細胞群。優選地，所述的細胞群是細胞表面SSEAl分子陽性、MESPl分子陽性、MEF2C分子陽性、GATA4分子陽性或ISLl分子陽性的細胞群。
[0089]培養基
[0090]本發明還提供了一種用於誘導多能幹細胞分化為心血管前體細胞的培養基，所述的分化培養基是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了抗壞血酸、骨形成蛋白4和CHIR99021。所述的DMEM/F12培養基是本領域人員已知的培養基。
[0091]如本文所用，所述的「含有」，「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由……構成」、「基本上由……構成」、和「由……構成」;「主要由……構成」、「基本上由……構成」和「由……構成」屬於「含有」、 「具有」或「包括」的下位概念。
[0092]作為本發明的優選方式，所述的培養基中含有20-100 μ g/ml，10_80ng/ml骨形成蛋白 4 和 1-6 μ M CHIR99021。
[0093]作為本發明的更優選方式，所述的分化培養基還含有:按照體積0.8-5%量Β27添加物，按照體積0.3-3%L-穀氨醯胺，按照體積0.3-3%青-鏈黴素，100-800 μ M α -硫代甘油。
[0094]本發明還提供了一種用於穩定培養心血管前體細胞的培養基，其是以DMEM/F12 培養基為基礎，且包括:0.5-8μΜ Dorsomorphin，0.1-2 μ M Α83-01，和 0.8-8 μ MCHIR99021。更佳地，其中還包括:按照體積0.8-5% (v/v)量B27添加物，按照體積
0.4-3%(v/v)量N2添加物，0.3-3%L-穀氨醯胺，0.3-3%非必需胺基酸儲存液，0.3-3%青-鏈黴素，0.05-0.3mM β -巰基乙醇，100-800 μ M α-硫代甘油。
[0095]本發明所述的培養基中，各組分均可以通過商購的途徑獲得。因此，根據本發明人提供的配方，可以方便地配製出培養基。
[0096]本發明的主要優點在於:
[0097](I)本發明提供了一種從人多能幹細胞高效、簡便獲得非致瘤性、均一的心血管前體細胞的方法，並建立了在體外較長時間維持和擴增所獲得的心血管前體細胞的方法。利用這些方法獲得的細胞產品可用於心臟疾病的治療和心肌再生研究、藥物心血管細胞毒性檢測、心臟藥物的研發；產生心血管前體細胞的體系可用於研究心臟的早期發育。
[0098](2)本發明提供的方法，具有誘導條件簡單，重複性高；誘導效率高的優點。
[0099]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0100]材料與方法
[0101]1、人多能幹細胞的培養及向心血管前體細胞的分化
[0102]1.1材料和試劑
[0103](I)本發明中涉及的多能幹細胞包括胚胎幹細胞和誘導性多能幹細胞。使用的人胚胎幹細胞(hES，或稱為hESC(s))系Hl和H9由美國威斯康星大學麥迪遜分校WiCell研究所提供。人誘導性多能幹細胞(hiPSC(s)系hAFDC-1PS-36獲自中國科學院上海生命科學研究院健康科學研究所(參見Li，C.等，Hum.Mol.Genet.18，4340-4349)。
[0104](2)人心血管前體細胞誘導培養液(CM培養基):DMEM/F12溶液加入2%(v/ν)1ΧΒ27添加物(不包含維生素A，Sigma)，l%(v/v)L-穀氨醯胺儲存液(Gibco)，1%(ν/V)青-鏈黴素儲存液(Gibco) ,400 μ M α-硫代甘油(Sigma), 50 μ g/ml抗壞血酸(AA)(Sigma)，25ng/ml骨形成蛋白4 (BMP4, R&D)，和3 μ M糖原合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑CHIR99021(Stemgent)，用0.22μπι濾器抽濾後備用。其中，抗壞血酸(AA) +骨形成蛋白
4(ΒΜΡ4) + CHIR99021三種成分構成了 CM，含有它們的培養基稱為CM培養基。[0105]1.2人多能幹細胞的培養及擴增
[0106]復甦凍存的未分化人多能幹細胞，接種到鋪有人工細胞外基質Matrigel (BDBioscience)的6孔培養皿中(Corning),加入商品化人多能幹細胞培養液mTeSRl (購自Stem Cell Technologies),每天換液,5_6天長滿後傳代。傳代前1_2小時更換新鮮培養液。
[0107]1.3誘導人多能幹細胞向心血管前體細胞分化
[0108](I)PBS清洗長滿的人多能幹細胞後用Accutase (Stem Cell Technologies)溶液消化5分鐘，吸取細胞懸液離心後用加入了 5 μ M Rho激酶抑制劑Υ27632 (Calbiochem)的CIM培養基重懸細胞後，按50000細胞/cm2的密度接種至鋪有人工細胞外基質Matrigel的培養板中，放入培養箱中培養24小時。
[0109](2) 24小時後將培養液換為新鮮的不含Y27632的CIM培養基，繼續培養48小時。
[0110]2.人心血管前體細胞的穩定培養和分化
[0111]2.1材料和試劑
[0112](I)人心血管前體細胞擴增培養液(CPM培養基):DMEM/F12溶液加入2%v/vI X B27添加物(不包含維生素A)，l%v/v I X N2添加物(Sigma)，1%v/vL-穀氨醯胺儲存液，1%ν/ν非必需胺基酸儲存液(Sigma)，1%ν/ν青-鏈黴素儲存液，0.1mM β -巰基乙醇儲存液，400 μ M α-硫代甘油，2 μ M BMP 抑制劑 dorsomorphin, 0.5 μ M Activin/Nodal 抑制劑A83-01和3 μ M糖原合成酶激酶3抑制劑CHIR99021，用0.22 μ m濾器抽濾後備用。
[0113](2)心肌細胞誘導液1:DMEM/F12溶液加入1XB27添加物(不包含維生素A)，1%L-穀氨醯胺儲存液，1%青-鏈黴素儲存液，400 μ M α -硫代甘油，50 μ g/ml抗壞血酸，4mg/ml 聚乙烯醇(Sigma), 10ng/ml BMP4 和 10ng/ml 成纖維生長因子 2(FGF2),用 0.22 μ m濾器抽濾後備用。
[0114](3)心肌細胞誘導液2:DMEM/F12溶液加入1XB27添加物(不包含維生素A)，1%L-穀氨醯胺儲存液，1%青-鏈黴素儲存液，400 μ M α -硫代甘油，50 μ g/ml抗壞血酸，
5μ M Wnt通路抑制劑IWR-1 (Calbiochem),用0.22 μ m濾器抽濾後備用。
[0115](4)血管平滑肌細胞誘導液:DMEM / F12溶液加入I XB27添加物(不包含維生素A),l% L-穀氨醯胺儲存液，I %青-鏈黴素儲存液，400 μ M α -硫代甘油，50 μ g / ml抗壞血酸，IOng / ml PDGF-BB (R&D)和 2ng/ml TGF β I (R&D)，用 0.22 μ m 濾器抽濾後備用。
[0116](5)血管內皮細胞誘導液:DMEM / F12溶液加入1XB27添加物(不包含維生素A), 1% L-穀氨醯胺儲存液，I %青-鏈黴素儲存液，400 μ Ma-硫代甘油，50 μ g/ml抗壞血酸，50ng/ml VEGF (R&D)(含 10ng/ml FGF2)，用 0.22 μ m 濾器抽濾後備用。
[0117]2.2人心血管前體細胞的培養及擴增
[0118]PBS清洗由CM培養基誘導得到的人心血管前體細胞後用Accutase溶液消化5分鐘，吸取細胞懸液離心後用CPM培養基重懸細胞後，以1: 3比例接種至鋪有人工細胞外基質Matrigel的培養板中，放入培養箱中培養24小時。每天換液，3-4天長滿後傳代，傳代前
1-2小時更換新鮮培養液。傳前5代時加入5 μ M Rho激酶抑制劑Υ27632以提高細胞存活率，5代之後則不需要繼續添加。
[0119]用於體外維持心血管前體細胞的信號通路抑制劑，其購買途徑，針對的靶信號通路以及工作濃度列於表3。
[0120]表3
【權利要求】
1.一種製備心血管前體細胞的方法，包括:以抗壞血酸、骨形成蛋白4和糖原合成酶激酶3抑制劑誘導多能幹細胞，使之分化為心血管前體細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的抗壞血酸的工作濃度為20-100μ g/ml ； 所述的骨形成蛋白4的工作濃度為10-80ng/ml ;或 所述的糖原合成酶激酶3抑制劑的工作濃度為1-6 μ M0
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的多能幹細胞用含有Rho激酶抑制劑的CIM培養基培養15-30小時；之後用不含Rho激酶抑制劑的CM培養基繼續培養40-60小時； 其中，所述的CIM培養基是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了: . 0.8-5%ν/ν Β27 添加物， .0.3-3%v/v L-穀氨醯胺， . 0.3_3%ν/ν青-鏈黴素， . 100-800 μ M α-硫代甘油， . 20-100 μ g/ml抗壞血酸， . 10-80ng/ml骨形成蛋白4,和 . 1-6 μ M糖原合成酶激酶3抑制劑。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑包括CHIR99021。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的多能幹細胞包括:胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞；或 所述的多能幹細胞是人多能幹細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，獲得心血管前體細胞之後，還包括步驟:穩定培養心血管前體細胞，包括:在心血管前體細胞的培養基中加入BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑，使之穩定生長或傳代。
7.如權利要求6所述的方法,其特徵在於，所述的BMP抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且 所述dorsomorphin的工作濃度為0.5-8 μ M ； 所述的Α83-01的工作濃度為0.1-2 μ M ; 所述的CHIR99021的工作濃度為0.8-8 μ Μ。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，穩定培養心血管前體細胞的培養基是CPM培養基，其是以DMEM/F12培養基為基礎，加入了: .0.8-5%ν/ν Β27 添加物， .0.4-3%ν/ν Ν2 添加物， . 0.3-3%v/v L-穀氨醯胺， . 0.3-3%ν/ν非必需胺基酸儲存液， . 0.3_3%ν/ν青-鏈黴素， . 0.05-0.3mM β-巰基乙醇100-800 μ M α-硫代甘油，
.0.5-8 μ M dorsomorphin,
.0.1-2 μ M Α83-01，和
.0.8-8 μ M CHIR99021。
9.一種穩定培養心血管前體細胞的方法，包括:在心血管前體細胞的培養基中加入BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑，使之穩定生長或傳代。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的BMP信號通路抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01,所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且 所述dorsomorphin的工作濃度為0.5-8 μ M ； 所述的Α83-01的工作濃度為0.1-2 μ M ; 所述的CHIR99021的工作濃度為0.8-8 μ Μ。
11.一種用於製備心血管前體細胞的培養基，其特徵在於，其是DMEM/F12培養基，且包括: 20-100 μ g/ml抗壞血酸， 10-80ng/ml骨形成蛋白4,和 1-6 μ M糖原合成酶激酶3抑制劑。
12.如權利要求11所述的用於製備心血管前體細胞的培養基，其特徵在於，還包括: 2%ν/ν Β27添加物， .0.3-3%v/v L-穀氨醯胺， .0.3_3%ν/ν青-鏈黴素，
100-800 μ M α-硫代甘油。
13.如權利要求11所述的用於製備心血管前體細胞的培養基，其特徵在於，所述的糖原合成酶激酶3抑制劑包括CHIR99021。
14.權利要求11-13任一所述的培養基的用途，用於誘導多能幹細胞分化為心血管前體細胞。
15.一種用於穩定培養心血管前體細胞的培養基，其特徵在於，其是DMEM/F12培養基，且包括: BMP信號通路抑制劑，Activin/Nodal信號通路抑制劑和糖原合成酶激酶3信號通路抑制劑。
16.如權利要求15所述的培養基，其特徵在於，所述的BMP信號通路抑制劑是dorsomorphin,所述的Activin/Nodal抑制劑是A83-01,所述的糖原合成酶激酶3抑制劑是CHIR99021 ;且 所述的dorsomorphin的濃度為0.5-8 μ Μ, 所述的Α83-01的濃度為0.1-2 μ M Α83-01， 所述的 CHIR99021 的濃度為 0.8-8 μ M CHIR99021。
17.如權利要求15或16所述的用於穩定培養心血管前體細胞的培養基,其特徵在於，還包括:.2%v/v B27添加物， . 1%ν/ν N2添加物， .0.3-3%v/v L-穀氨醯胺， .0.3-3%v/v非必需胺基酸儲存液， .0.3_3%v/v青-鏈黴素， .0.05-0.3mM β-巰基乙醇，. .100-800 μ M α-硫代甘油。
18.權利要求15-17任一所述的培養基的用途,用於穩定培養心血管前體細胞。
19.一種含心血管前體細胞的細胞群，其通過權利要求1-10任一所述的方法製備獲得。
20.權利要求19所述的含心血管前體細胞的細胞群的用途，用於製備心肌細胞、血管平滑肌細胞或血管內皮細胞。
【文檔編號】C12N5/074GK103834613SQ201210491649
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2012年11月27日
【發明者】楊黃恬, 曹楠, 梁賀 申請人:中國科學院上海生命科學研究院