類胡蘿蔔素羥化酶的製作方法

2023-05-14 01:28:26 3

專利名稱：：類胡蘿蔔素羥化酶的製作方法
技術領域：
：本發明屬於分子生物和微生物領域。更具體地，本發明涉及編碼用於環狀的鞋化類胡蘿蔔素化合物的微生物製備的酶的核酸分子。
背景技術：
：類胡蘿蔔素是在自然界普遍存在的色素，由所有光合作用生物合成，並且在一些異養細菌和真菌中合成.類胡蘿蔔素給花、植物、昆蟲、魚類和鳥類提供顏色。類胡蘿蔔素的顏色從黃色到紅色，具有棕色和紫色的變異，作為維生素A的前體，類胡蘿蔔素是我們的飲食的基本成分，它們在人類健康中起額外的重要作用。由於動物不能從頭合成類胡蘿蔔素，它們必須通過飲食手段獲得類胡蘿蔔素。因此，植物或細菌中類胡蘿蔔素生產和組成的操作可以提供類胡蘿蔔素的新的或改進的來源。類胡蘿蔔素的工業用途包括藥物、食品添加劑、動物原料添加劑和化妝品中的著色劑，等等。儘管在自然界鑑定出了超過600種不同的類胡蘿蔔素的存在，但在工業上，僅僅有少數類胡蘿蔔素被用於食品色素、動物原料、藥物和化妝品。這很大程度是由於生產的困難。目前，用於工業目的的大多數類胡蘿蔔素是通過化學合成而生產的；但是，非常難以化學製備這些化合物(NelisandLeenheer，Appl.Bacteriol.70:181-191(1991))。可以通過提取植物材料或通過微生物合成而獲得天然類胡蘿蔔素。但是，僅僅有少數植物被廣泛用於商業化的類胡蘿蔔素生產，並且這些植物中的類胡蘿蔔素生產能力是相對低的，因此，從這些植物生產的類胡蘿蔔素是非常昂貴的，增加類胡蘿蔔素生物合成的生產能力的一種途徑是應用重組DNA技術(綜述於MisawaandShimada，J.Biotech.,59:169-181(1998))。需要在非產類胡蘿蔔素細菌和酵母中生產類胡蘿蔔素，從而能夠控制質量、數量和選擇最合適和有效的生產生物。後者對於消費者的商業化生產經濟學(因此對於可獲得性)特別重要。CrtZ型類胡蘿蔔素羥化酶是一類將羥基導入環狀類胡蘿蔔素如P-胡蘿蔔素或角黃素的p-芷香稱環，以產生羥化的類胡蘿蔔素的酶.所述類胡蘿蔔素的實例包括蝦青素、P-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、3,-幾基海膽酮、adonirubin、adonixanthin、四幾基-P，P'-胡蘿蔔素-4，4'-二稱、四羥基-卩，P'-胡蘿蔔素-4-鯛、眉藻黃素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黃素、3-羥基個胡蘿蔔素、3-羥基-4-鑭基個胡蘿蔔素、細菌玉紅黃素、bacteriorubixanthinal和黃體素。已經報導了類胡蘿蔔素羥化酶基因來自多種細菌、真菌、藻類和植物物種。一些物種的實例包括但不限於斯氏泛菌(WO03/016503;WO02/079395)、虔夏孢歐文氏菌(EP393690Bl;Misawaetal.，J.Bacteriol"172(12):6704-6712(1990))、草生歐文氏菌(Hundleetal"Mol，GenGenet，245(4):楊-416(1994);Hundleetal.，FEBSLett，315(3):329-334(1993》Sch證retal"FEMSMicrobiol.Lett,78(2-3):157-161(1991);和US5684238)、Agrobacteriumaurantiacum(Misawaetal"JBacteriol.，177(22):6575-6584(1995);US5811273)、產鹼菌物種(US5811273)、黃桿菌物種(US6677134;US6291204;US2002147371;WO2004029275;和Pasamontesetal"Gene,185(1):35-41(1997))，副球菌物種(CN1380415)、Haematococcuspluvialis(WO00/061764;Linden,H.，BiochimicaetBiophysicaActa,1446(3):203-212(1999))，和植物物種，如擬南芥(Tian，L.andDellaPenna，D"PlantMol.Biol"47(3):379-388(2001);US2002102631)。在微生物宿主細胞中重組表達了許多這些|3-胡蘿蔔素羥化酶基因，但是，需要鑑定用於對商業上適於生產羥化類胡蘿蔔素，如蝦青素和玉米黃素的微生物進行遺傳工程化的新cWZ羥化酶基因。此外，特別需要鑑定具有相對低到中度核酸序列同一性(即<70%的核酸同一性)的Crtz羥化酶，用於穩定表達多種羥化酶基因，因為高度同源的基因將難以整合，並且容易導致遺傳不穩定性(即不需要的同源重組)。具有趨異核苷酸序列(相對於彼此)的CWZ基因最適於在單個宿主細胞中表達多種羥化酶。當羥化酶活性成為類胡蘿蔔素生物合成途徑中的限速步驟時，這特別重要。假定可獲得的底物池不是限制性的，預計增加可以在生產宿主中同時表達的cr,Z基因數目，可以增加類胡蘿蔔素產量。當優化需要的產物(即類胡蘿蔔素)的重組生產時，這特別重要.因此，要解決的問題是提供用於類胡蘿蔔素(即玉米黃素和蝦青素)的工程化生產的新cWZ羥化酶基因。發明概述本發明也通過提供從泡囊短波單胞菌DC263分離的新cWZ基因而解決了上述問題，所述基因可以用於在重組宿主細胞中生產類胡蘿蔔素。此外，已經發現以前鑑定為編碼具有未知功能的假定蛋白的、來自Novosphingobiumaromaticivorans的基因編碼類胡蘿蔔素輕化醉。也提供了用本發明的CrtZ羥化酶生產羥化類胡蘿蔔素的方法.因此，本發明提供了編碼類胡蘿蔔素羥化酶的分離的核酸分子，其選自(a)編碼SEQIDNO:17所示胺基酸的分離的核酸分子；(b)包含第一核苷酸序列的分離的核酸分子，所述第一核苷酸序列編碼與包含SEQIDNO:17所示胺基酸的多肽具有至少95%同一性的類胡蘿蔔素羥化酶；(c)在以下雜交條件下與(a)雜交的分離的核酸分子0.1XSSC，0.1%SDS,651C和用2XSSC，0.1%SDS洗滌，然後用0.1XSSC，0.1%SDS洗滌；和(d)與(a)、(b)或(C)互補的分離的核酸分子。此外，本發明提供了由本發明的核酸分子編碼的多肽以及包含所述多肽的遺傳嵌合體和轉化的宿主.在一種實施方案中，本發明提供了獲得編碼類胡蘿蔔素輕化酶的核酸分子的方法，該方法包括(a)合成至少一種相應於SEQIDNO:16所示序列的一部分的寡核苷酸引物；和(b)用步驟(a)的寡核苷酸引物擴增存在於克隆栽體中的插入片段；其中擴增的插入片段編碼類胡蘿蔔素羥化酶.在另一種實施方案中，本發明提供了生產羥化類胡蘿蔔素化合物的方法，該方法包括(a)提供生產具有至少一個P-芷香嗣型環的環狀類胡蘿蔔素的宿主細胞；(b)用編碼本發明的類胡蘿蔔素羥化醃的核酸分子轉化(a)的宿主細胞；和(c)在合適的條件下使(b)的轉化的宿主細胞生長，從而生產幾化類胡蘿蔔素。在另一種實施方案中，本發明提供了調節生物中環狀的羥化類胡蘿蔔素生物合成的方法，該方法包括(a)提供包含類胡蘿蔔素生物合成途徑的宿主細胞，所述宿主細胞生產具有至少一個P-芷香胡型環的環狀類胡蘿蔔素；(b)用編碼本發明的類胡蘿蔔素幾化酶的核酸分子轉化(a)的宿主細胞；和(c)使(b)的轉化的宿主細胞在使羥化類胡蘿蔔素生物合成受到調節的條件下生長。附圖簡述、序列說明和生物保藏圖1顯示了通過酮酶從多種可能的前體製備奸青素的途徑，和從p-胡蘿蔔素進行的羥化酶反應。圖2顯示由泡囊短波單胞菌DC263和SphingomonasmelonisDC18生產的天然類胡蘿蔔素的HPLC分析。圖3顯示由生產玉米黃素的大腸桿菌菌林生產的類胡蘿蔔素的HPLC分析，所述菌林表達來自泡囊短波單胞菌DC263或NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的c/tZ基因。圖4顯示由生產蝦青素的大腸桿菌和甲基單胞菌種16a菌林生產的類胡蘿蔔素的HPLC分析，所述菌株表達來自泡嚢短波單胞菌DC263的cWZ基因.圖5顯示由生產蝦青素的大腸桿菌和甲基單胞菌種16a菌林生產的類胡蘿蔔素的HPLC分析，所迷菌林表達來自aromaticivoransATCCNo.700278的cr/Z基因。下列序列遵循37C.F，R.§1.821-1.825("對含有核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求一序列規則")，並符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理說明的規則5.2和49.5(a-bis)，以及第208節和附錄C)。應用於核苷酸和胺基酸序列信息的符號和格式遵循37C.F.R.§1.822所述規則。SEQIDNO:1是用於16SrRNA基因測序的引物("HK12")的核苷酸序列。SEQIDNO:2是用於16SrRNA基因測序的引物("JCR14")的核苷酸序列.SEQIDNO:3是用於16SrRNA基因測序的引物("JCR15")的核苷酸序列。SEQIDNO:4是泡囊短波單胞菌DC26316SrRNA基因的核苷酸序列，SEQIDNO:5是SphingomonasmelonisDC1816SrRNA基因的核苷酸序列。SEQIDNO:6是來自腸桿菌科DC260(US10/808979)的cr化XI7及Z類胡蘿蔔素合成基因簇的核苷酸序列。SEQIDNO:7是引物pWEB260F的核苷酸序列.SEQIDNO:8是引物pWEB260R的核苷酸序列，SEQIDNO:9是引物pWEB404F的核苷酸序列。SEQIDNO:10是引物pWEB404R的核苷酸序列。SEQIDNO:11是來自成團泛菌DC404(US10/808807)的cr&油'17醜類胡蘿蔔素合成基因簇的核苷酸序列。SEQIDNO:12是泡嚢短波單胞菌DC263crtW酮酶(US60/531310)的核苷酸序列。SEQIDNO:13是SphingomonasmelonisDC18C酮酶(US60/531310)的核苷酸序列.SEQIDNO.*14是引物pEZ263-F的核苷酸序列。SEQIDNO:15是引物pEZ263-R的核苷酸序列。SEQIDNO:16是泡囊短波單胞菌DC263c/tZ類胡蘿蔔素羥化酶的核苷酸序列.SEQIDNO:17是泡囊短波單胞菌DC263CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶的推導的胺基酸序列。SEQIDNO:18是AgrobacteriumaurantiacumCrtZ類胡蘿蔔素鞋化酶的胺基酸序列.SEQIDNO:19是NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278(GenBankZP—00094836.1)CrtZ類胡蘿蔔素幾化酶的核苷酸序列。SEQIDNO:20是NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278(GenBankZP_00094836.1)CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶的胺基酸序列.SEQIDNO:21是引物crtZ-DC263_F的核苷酸序列。SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO第一引物。SEQIDNO第二引物。SEQIDNOSEQIDNO22是引物crtZ-DC263—R的核苷酸序列，23是引物41ZSPH一F的核苷酸序列。24是引物SPH一ZR的核苷酸序列.25是引物crt-260—F的核苷酸序列。26是引物crt-260SOE_R的核苷酸序列.27是引物crt-260SOE_F的核苷酸序列28是引物crt-260RI_R的核苷酸序列。29是引物crt-260RI_F的核苷酸序列。30是引物crt-260_R的核苷酸序列。31是引物crtW-263_F的核苷酸序列。32是引物crtW-263—R的核苷酸序列。33是引物crt\V-263_F2的核苷酸序列.34是引物crtW-263_R2的核苷酸序列。35是用於擴增來自甲基單胞菌16a的p/i/w7啟動子的36是用於擴增來自甲基單胞菌16a的/^/w/啟動子的37是引物crtW—sphingo—F的核苷酸序列。38是引物crt\V_sphingo_R的核苷酸序列。申請人:業已按照布達佩斯條約有關用於專利程序的微生物保藏的國際認可的規定進行了以下生物學保藏tableseeoriginaldocumentpage11在本文中，"ATCC"表示美國典型培養物保藏中心，位於10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，U.S.A."國際保藏號"是由ATCC為保藏的培養物確定的保藏號。所列出的保藏物應當在指明的國際保藏機構保藏至少30年，並且在披露它的專利獲得授權之後可以公眾可以得到。所述保藏物的可獲得性並不構成許可以損害通過政府行為授予的專利權的形式來實施本發明。發明詳述本發明的crtZ基因及其表達產物，即類胡蘿蔔素羥化酶，可以用於建立具有生產羥化類胡蘿蔔素化合物的能力的重組生物.從命名為泡嚢短波單胞菌DC263的細菌菌林分離了編碼類胡蘿蔔素羥化醉的新核酸分子。此夕卜，將來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278(GenBankZP—00094836.1)的一種假定蛋白鑑定為類胡蘿蔔素羥化酶，其可以用於採用本發明的方法生產羥化類胡蘿蔔素化合物。在經過工程化以生產合適底物(如P-胡蘿蔔素或角黃素)的轉基因微生物宿主中表達了本發明的cWZ羥化酶基因。通過在異源宿主中生產羥化類胡蘿蔔素(例如玉米黃素或蝦青素)而測量基因的功能表達。本發明的類胡蘿蔔素羥化醉基因可以用於多種生產或調節環狀的羥化類胡蘿蔔素化合物的途徑中。本發明的c"Z羥化酶基因可以用於在具有生產合適底物的能力的異源宿主中生產類胡蘿蔔素。此外，本發明的c"Z羥化酶基因可以與異源宿主中的一種或多種趨異的類胡蘿蔔素羥化酶基因同時共表達，以優化羥化類胡蘿蔔素的生產。由於本發明的cWZ基因與其它已知crtZ輕化酶具有相對低到中度的核苷酸序列同一性，同時表達所述cr/Z基因應該是可能的。相對低/中度核苷酸序列同一性增加了多種CrtZ羥化酶在微生物生產宿主中穩定表達以便進行最優的類胡蘿蔔素生產的可能性。此處描述的基因和基因序列使得人們能夠將輕化類胡蘿蔔素的生產直接摻入工業上合適的微生物宿主細胞中。這方面使得任何摻入了這些基因的微生物菌林成為更理想的生產宿主。生產的類胡蘿蔔素可以從生產宿主分離，用於多種應用中，包括動物原料.任選地，可以將重組微生物宿主細胞直接摻入動物原料(無類胡蘿蔔素分離步驟)，這是因為存在已知加入需要的著色和健康益處的類胡蘿蔔素。魚(如鮭魚和縛魚)和蝦水產養殖是本發明的特別有用的應用，因為類胡蘿蔔素著色對於這些生物的價值是特別重要的(F.ShahidiandJ.A.Brown,CriticalReviewsinFoodScience,38(1):1-67(1998))。具體地，作為一種類胡蘿蔔素的蝦青素目前被用於水產養殖業。在本公開內容中，應用了大重術語和縮寫。相關定義如下所述。"可讀框"縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應"縮寫為PCR。此處用到的"分離的核酸分子"是RNA或DNA的聚合物，它們是單鏈或雙鏈的，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基。DNA聚合物形式中的分離的核酸分子可以包含cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個片段，此處用到的術語"pBHR-crtl"是指產生|3-胡蘿蔔素的質粒。該質粒是通過將來自斯氏泛菌(ATCC8199)的cW五XJ7B類胡蘿蔔素基因簇克隆到pBHRl(MoBioTech，Goettingen，Germany;參見WO02/18617，其相應於USO9/941947，在此引入作為參考)中而構建的。得到的質粒含有在氯黴素抗性基因啟動子控制下表達的斯氏泛菌基因簇。此處用到的術語"pDCQ300"是指生產p-胡蘿蔔素的質粒。該質粒是通過將來自斯氏泛菌(ATCCNo.8199)的類胡蘿蔔素基因簇cW五FJfi克隆到pTrcHis2-Topo栽體(Invitrogen，Carlsbad,CA)中而構建的.此處用到的術語"pDCQ301"是指生產p-胡蘿蔔素的質粒，該質粒是通過將含有CJ5T/5基因簇的pDCQ300的4.5kBEco/I片段克隆到栽體pBHRl(MoBiTec)的唯一￡"a^I位點中而構建的，在pDCQ301中，將唯一的M/el位點工程化到c/tE和cWF的基因間區域中。此處用到的術語"pDCQ329"是指生產P-胡蘿蔔素的質粒。該質粒是通過將分離自腸桿菌DC260的cW￡XI75基因簇克隆到寬宿主範圍的栽體pBHRl(US10/808979)中而構建的。此處用到的術語"pDCQ330"是指生產p-胡蘿蔔素的質粒。該質粒是通過將來自成團泛菌DC404的""/rf,T/醜類胡蘿蔔素基因蔟克隆到寬宿主範閨的栽體pBHRl(US10/808807和US60/527083)中而構建的.此處用到的術語"pDCQ340"是指表達來自腸桿菌DC260的c/tJST/fi基因簇的質粒。去除了天然基因簇中的cwa:基因.將基因簇克隆到栽體pBHRl中。此處用到的術語"pDCQ342"是指表達m^ET/J基因簇的質粒。將來自泡囊短波單胞菌的cWW編碼序列克隆到pBHRl中來自腸桿菌DC260的cr^T/5基因簇的上遊，此處用到的術語"pDCQ342TA"是指表達來自泡嚢短波單胞菌DC263的cW^基因的質粒，該基因克隆到pTrcHis2-TOPO栽體(Invitrogen)中。此處用到的術語"pDCQ344"是指表達cWZ^ET/5基因簇的質粒。將來自泡囊短波單胞菌DC263的cr"編碼序列克隆到pDCQ342的cW附I7B基因簇的上遊，得到生產奸青素的質粒。此處用到的術語"pDCQ352"是指表達來自泡囊短波單胞菌DC263的cWZ基因的質粒，該基因克隆到pTrcHis2-TOPO栽體(Invitrogen)中。此處用到的術語"pDCQ363"是指包含從甲基單胞菌種16a擴增並且克隆到pBHRl中的//i/w7啟動子的質粒。此處用到的術語"pDCQ364"是指包含克隆到質粒pDCQ363中的來自Novosphingobiumaromaticivorans的cr/Z基因的編碼序歹'J的質粒。此處用到的術語"pDCQ365"是指包含克隆到質粒pDCQ364中的來自SphingomonasmelonisDC18的crt『基因的編碼序列的質粒。來自SphingomonasmelonisDC18的基因的編碼序列和來自Novosphingobiumaromaticivo頃sATCCNo.700278的CZ基因的編碼序列在來自甲基單胞菌種16a的p/ips/啟動子的控制下作為一個轉錄單位共表達。此處用到的術語"pDCQ366"是指包含克隆到p-胡蘿蔔素合成質粒pDCQ330中的來自pDCQ365的c"WZ轉錄單位的質粒，得到能夠生產蝦青素的質粒。此處用到的術語"pDCQ370TA"是指表達克隆到pTrcHis2-TOPO栽體(Invitrogen)中的來自泡囊短波單胞菌DC263的cWZ基因的質粒。其摻入了側翼於pDCQ352中的cWZ基因的不同的限制位點。此處用到的術語"pTrc-His2-crtZ(Sphingo)"是指表達克隆到pTrcHis2-TOPO栽體(Invitrogen)中的來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的cr"基因的編碼序列的質粒.此處用到術語"類異戊二烯"或"薛類化合物"是指這樣的化合物，它們是衍生自類異戊二烯途徑的任何分子，包括10碳碎類化合物及其衍生物，如類胡蘿蔔素和葉黃素。此處用到的術語"類胡蘿蔔素"只指包含由五碳異戊二烯單元縮合形成的多烯主鏈的化合物.類胡蘿蔔素可以是非環狀的，或以一個(單環)或兩個(雙環)環狀端基終止.術語"類胡蘿蔔素"可以包括胡蘿蔔素和葉黃素."胡蘿蔔素"是指烴類的類胡蘿蔔素.包含羥基-、甲氣基-、氧代-、環氣-、羧基-或搭官能團形式，或糖苷、糖苷酯或硫酸酯內的一個或多個氧原子的胡蘿蔔素衍生物被通稱為"葉黃素"，特別適於本發明的類胡蘿蔔素是單環和雙環類胡蘿蔔素。此處用到術語"類胡蘿蔔素生物合成途徑"是指包含上遊類異戊二烯途徑和/或下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的成員的基因。此處用到的術語"上遊類異戊二烯途徑"、"類異戊二烯途徑"和"上遊途徑"可以互換使用，並且是指參與將丙酮酸和甘油醛-3-碲酸轉化為法呢基焦磷酸(FPP)的酶，編碼這些酶的基因包括，但不限於類異戊二烯途徑中的"&s"基因(編碼l-脫氧木胴糖-5-磷酸合酶);"rfxr"基因(編碼l-脫氧木酮糖-5-褲酸還原異構酶)；"&/;/)"基因(編碼2C-曱基-D-赤蘚糖醇胞苷醯轉移酶；也稱作yg6屍)；"/印五"基因(編碼4-二磷酸胞苷醯-2-C-甲基赤蘚糖醇激酶;也稱作^Zi5);"/印F"基因(編碼2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環狀二礴酸合酶；也稱作j^65);"/y;rG"基因(編碼CTP合蘇)；參與二甲基烯丙基二磷酸酯形成的"lytB"基因；參與2-C-甲基-D-赤蘚糖醇扣磚酸合成的"gc/^"基因；'7rf/"基因(負責IPP在分子內轉化為二甲基烯丙基焦褲酸)；和"ispA"基因(編碼香葉基轉移酶或法呢基二砩酸合酶)。此處用到的術語"下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑"和"下遊途徑"可以互換使用，是指將FPP轉化為一組類胡蘿蔔素的醉。這些包括酶包括參與diapophytoene(其合成代表C3類胡蘿蔔素的生物合成中特有的第一步)或八氫番茄紅素(其合成代表Cj。類胡蘿蔔素的生物合成中特有的第一步)合成的基因和基因產物。導致產生多種C3(rC40類胡蘿蔔素的所有後續反應包括在下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑中，這些基因和基因產物包括所有基因，包括但不限於cWM，cWiV,c/tiV2,cr"，C/tKCT",C/Y取C賦C/tW,C/t0,C/tC,CT必,c"屍々Ct7。最後，術語"下遊類胡蘿蔔素生物合成酶"是開放式的術語，是指下遊途徑中的任何和所有酶，包括但不限於CWM,OtiV,CWiV2,CW￡",cwkcw/,o訪，cwz;cc必，cwt^c"C3。diapocarotenoids"由6個類異戊二烯單元組成，它們的連接方式使得類異戊二烯羊元的排列在分子的中心反轉，使得兩個中心甲基處於l，6-位置關係，其餘的非末端甲基處於1,5-位置關係。所有<:30類胡蘿蔔素可以從形式上衍生自具有共軛雙鍵的長中心鏈的非環狀C3oH42結構，所述衍生是通過(i)氫化，(ii)脫氬，(iii)環化，(iv)氧化，(v)酯化/糖基化，或這些過程的任意組合."四碎烯"或"C卯類胡蘿蔔素"由8個類異戊二烯單元組成，它們的連接方式使得類異戊二烯單元的排列在分子的中心反轉，使得兩個中心甲基處於1，6-位置關係，其餘的非末端甲基處於1，5-位置關係。所有C訓類胡蘿蔔素可以從形式上衍生自非環狀C4oHs6結構。C糾類胡蘿蔔素的非限定性實例包括八氫番茄紅素，番茄紅素，P-胡蘿蔔素，玉米黃素，蝦青素和角黃素。此處用到的術語"CrtE"是指由cW五基因編碼的香葉基香葉基焦磷酸合酶，其將反式-反式-法呢基二褲酸和異戊烯基二碑酸轉化為焦礴酸和香葉基香葉基二罅酸。此處用到的術語"Idi"是指由基金編碼的異戊烯基二磷酸異構酶(E.G.5.3.3.2)。此處用到的術語"CrtY"是指由基因編碼的番茄紅素環化酶，其將番茄紅素轉化為P-胡蘿蔔素.此處用到的術語"Crtl"是指由ct"基因編碼的八氫番茄紅素去飽和酶.Crtl通過導入4個雙鍵，經過六氫番茄紅素、C-胡蘿蔔素和四氫番茄紅素的中間體，將八氫番茄紅素轉化為番茄紅素。此處用到術語"CrtB"是指由cW5基因編碼的八氫番茄紅素合酶，其催化從prephytoenediphosphate到/\氫番茶紅素的反應。此處用到的術語"CrtZ"是指由cWZ基因編碼的類胡蘿蔔素羥化酶(如P-胡蘿蔔素羥化酶)，也稱作3，3'p-芷香稱羥化酶，其催化幾化反應。氧化反應將羥基加入3和/或3'位置具有P-芷香酮型環的環狀類胡蘿蔔素.該反應分別將環狀類胡蘿蔔素，如P-胡蘿蔔素或角黃素加入羥化類胡蘿蔔素玉米黃素或蝦青素。該過程中的中間體典型地包括P-隱黃素和adonirubin。已知CrtZ羥化酶典型地表現出底物靈活性，使得能夠依賴於可獲得的底物，產生多種羥化類胡蘿蔔素.此處用到的術語"CrtW"是指由cr,W基因編碼的p-胡蘿蔔素嗣酶，其催化氧化反應，該反應中將嗣基導入環狀類胡蘿蔔素的P-芷香嗣型環。術語"類胡蘿蔔素嗣酶，，或"稱醃"是指可以將嗣基加入環狀類胡蘿蔔素的P-芷香嗣型環的4和/或4，位置的一組酶.此處用到的術語"CrtX"是指由cWX基因編碼的玉米黃素葡糖基轉移酶，其將玉米黃素轉化為玉米黃素-P-二葡糖苷。此處用到的術語"羥基"是指單價自由基或基團，其包含一個氧和一個氫原子("-OH")。此處用到的術語"嗣基"是指這樣的基團，其中的羰基與兩個碳原子鍵合R200(兩個R都不是H)。此處用到的術語"酮基類胡蘿蔔素"是指在環狀類胡蘿蔔素的芷香飼環上具有至少一個嗣基的類胡蘿蔔素。嗣基類胡蘿蔔素的實例包括角黃素和蝦青素。此處用到的術語"環狀類胡蘿蔔素"是指具有至少一個能夠被本發明的CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶幾化的p-芷香酮環或p-芷香酮環衍生物的類胡蘿蔔素。此處用到的術語"類胡蘿蔔素羥化酶"、"P-胡蘿蔔素羥化酶"、"羥化酶"和"CrtZ鞋化酶"可互換使用，是指由crtZ基因編碼的類胡蘿蔔素羥化酶，其催化在環狀類胡蘿蔔素的P-芷香酮環上添加羥基。此處用到的術語"羥化類胡蘿蔔素"是指在環狀類胡蘿蔔素的芷香酮環上具有至少一個羥基的類胡蘿蔔素。羥化類胡蘿蔔素的實例包括玉米黃素和蝦青素。此處用到的"基本相似"是指這樣的核酸分子，其中一個或多個核苷酸鹼基的改變導致一個或多個胺基酸的取代，但不影響由DNA序列編碼的蛋白的功能特性。"基本相似"也指這樣的核酸分子，其中一個或多個核苷酸鹼基的改變不影響核酸分子介導由反義或共阻抑技術導致的基因表達改變的能力。"基本相似"也指對本發明的核酸分子的修飾，例如一個或多個核苷酸鹼基的缺失或插入基本不影響得到的轉錄物的功能特性，因此，可以理解，本發明不僅僅包括具體舉例的序列。例如，本領域公知，導致在特定位點產生化學上等同的胺基酸但不影響編碼的蛋白的功能特性的基因改變是常見的.為了本發明的目的，取代定位為在以下5組之一中進行的交換1.小的脂族、非極性或微極性殘基Ala，Ser，Thr(Pro,Gly);2.極性、帶負電的殘基和它們的醯胺Asp，Asn，Glu，Gln;3.極性、帶正電的殘基His，Arg，Lys;4.大的脂族、非極性殘基Met，Leu，Ile，Val(Cys);和5.大的芳香族殘基Phe，Tyr，Trp。因此，一種疏水性胺基酸丙氨酸的密碼子可以被編碼另一種疏水性較低的殘基(如甘氨酸)或疏水性更高的殘基(如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代.類似地，也可以預計導致用一種帶負電的殘基取代另一種殘基(如天冬氨酸取代穀氨酸)或一種帶正電的殘基取代另一種殘基(如賴氨酸取代精氨酸)的改變可以產生功能等同的產物。在很多情況下，預計導致蛋白N-末端和C-末端部分改變的核苷酸改變也不會改變蛋白的活性。提出的每種修飾都是本領域技術人員公知的，這是通過保留編碼的產物的生物活性而確定的，此外，本領域技術人員可以理解，本發明包括的基本相似的序列也由它們在嚴格條件下(0.1XSSC,0.1%SDS，651C，用2XSSC，0.1%SDS洗滌，然後用0.1XSSC，0.1%SDS洗滌)與此處舉例的序列雜交的能力而確定。本發明的優選的基本相似的核酸分子是DNA序列與此處報導的核酸分子的DNA序列具有至少80%同一性的核酸分子.更優選的核酸分子是與此處報導的核酸分子的DNA序列具有至少90%同一性的核酸分子。最優選的是與此處報導的核酸分子的DNA序列具有至少95%同一性的核酸分子。當單鏈形式的核酸分子可在合適的溫度和溶液離子強度條件下退火至另一個核酸分子時，該核酸分子與所述另一個核酸分子，諸如cDNA、基因組DNA或RNA分子是"可雜交的"。雜交和洗滌條件眾所周知，實例參見Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(1989),尤其是其中的第11章和表11.1(此處稱作"Maniatis"),溫度和離子強度的條件決定了雜交的"嚴格性".可調節嚴格條件，以篩選中度相似的分子(諸如遠緣相關生物來源的同源序列)，乃至高度相似的分子(諸如可複製近緣相關生物來源的功能酶的基因)，雜交後的洗滌決定了嚴格條件.一組優選條件採用了系列洗滌步驟，首先於室溫用6XSSC、0.5。/oSDS洗滌15分鐘，接著於45C用2XSSC、0.5%SDS重複洗滌30分鐘，再於50TC用0.2XSSC、0.5%SDS洗滌30分鐘並重複2次。更優選的一組嚴格條件採用了較高溫度，其中的洗滌步緣除了最後兩次用0.2XSSC、0.5%SDS洗滌30分鐘的溫度提高至60TC外，其它條件與上述一致。另一組優選的高度嚴格條件所採用的最後兩次洗滌是於651C在0.1XSSC、0.1V。SDS中進行。雜交要求兩個核酸含有互補序列，但根據雜交的嚴格性，鹼基之間仍然可能出現錯配。使核酸雜交所需的合適嚴格性取決於雜交核酸的長度和互補程度，這些變量是本領域所熟知的。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，含有這些序列的核酸雜合體的rm值越高，核酸雜交的相對穩定性(相應於較高Tm)按照下列次序降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。業已推導出計算長度大於100個核苷酸的雜合體的Tm的方程式(參見，Maniatis，^Li:，9.50-9.51)。錯配位置對較短核酸，即寡核苷酸的雜交而言更為重要，且該寡核苷酸的長度決定了其特異性(參見Maniatis，/^J:，11.7-11.8)。在一種實施方案中，可雜交核酸的長度至少為大約10個核苷酸。可雜交核酸的優選最小長度是至少大約15個核苷酸；更優逸的是至少大約20個核苷酸；最優選長度是至少大約30個核苷酸。此外，技術人員應認識到的是，可根據諸如探針長度等因素的需要調節溫度和洗滌液的鹽濃度。胺基酸或核苷酸序列的"主要部分"指包括了多肽的特定胺基酸序列或基因的特定核苷酸序列的部分，通過本領域技術人員對這些特定序列的人工評估，或者通過利用諸如BLAST的算法進行的計算機自動序列比對和鑑定，便足以根據這些特定序列推斷上述多肽或基因的同一性(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul，S.F.，etal"丄Mol.Biol.215:403-410(1993))。通常，為了推定多肽或核酸序列與已知蛋白或基因的同源性，序列必須包括10個或以上的相鄰胺基酸或30個或以上的核苷酸。此外，就核苷酸序列而言，包括20-30個相鄰核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針可被應用在基因鑑定(例如DNA雜交)和分離(例如細菌菌落或噬斑的原位雜交)的序列依賴性方法中。還可將具有12-15個鹼基的短寡核苷酸作為擴增引物應用於PCR,以獲得包括該引物的特定核酸片段.因此，核苷酸序列的"主要部分"包括足夠的序列，以便特異性地鑑定和/或分離包括該序列的核酸分子。本說明書描述了編碼一種或多種特定微生物蛋白的部分或完整胺基酸和核苷酸序列。了解本文所報導序列優勢的技術人員可將全部公開序列或其主要部分應用在本領域技術人員已知的許多方面.本發明相應包括附帶序列表所提供的完整序列，以及上述序列的主要部分。術語"互補"被用於描述能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係.例如，就DNA而言，腺苷與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嚷呤互補。本發明因此包括與附帶序列表所報導的完整序列互補的分離核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列，正如本領域所知，術語"同一性百分比"指兩個或以上的多肽序列或兩個或以上的多核苷酸序列之間的關係，是通過對這些序列進行比較而得以確定的。在本領域中，"同一性"還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，在該情況中，可根據這些序列之間的匹配情況得以確定。通過已知方法，向.括但X限幹-ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.，Ed.)OxfordUniversity:NY(1988);Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects(Smith,D.W"Ed.)Academic:NY(1993);ComputerAnalysisofSequenceData，PartI(Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.，Eds.)Humana:NJ(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.，Ed.)Academic(1987);以及SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.andDevereux，J,，Eds.)Stockton:NY(1991)中所描述的那些方法，可快速計算"同一性"和"相似性"。確定同一性的優選方法被設計用於提供受檢序列之間的最佳匹配。確定同一性和相似性的方法被編成了公用電腦程式。序列比對和同一性百分比計算可利用LASERGENE生物信息處理系統(DNASTARInc.，Madison，WI)的Megalign程序或VectorNTlv.7.0(Informax，Inc.,Bethesda,MD)的AlignX程序進行，序列多重比對可以利用Clustal比對法(HigginsandSharp,CABIOS.5:151-153(1989))並採用默認參數(GAPPENALTY-IO，GAPLENGTHPENALTY-10)進行。利用Clustal法進行兩兩比對的默認參數是KTYPLE1、GAPPENALTY=3、W歸OW-5和DIAGONALSSAVED-5.合適的核酸分子(本發明的分離多核苷酸)編碼與本文所報導的胺基酸序列具有至少大約80%同一性的多肽.更優選的核酸分子編碼與本文所報導的胺基酸序列具有大約卯％同一性的氛基酸序列，甚至更優選的核酸片段編碼與本文所報導的胺基酸序列具有至少大約95%同一性的胺基酸序列.本發明的合適的核酸分子不僅具有上述同源性，還典型地編碼具有至少大約161個胺基酸的多肽.此處用到的術語"趨異基因"、"趨異羥化酶"和"趨異序列"可以互換使用，並且是指在CrtZ羥化酶之間缺乏核酸分子分子序列同一性。2個或更多cWZ基因之間的核苷酸序列比較使得能夠對序列同一性的相關程度方面的關係進行分類。高度同源(即具有高核苷酸序列同一性)基因的同時表達容易導致遺傳不穩定性.中度或高度趨異基因的表達容易導致穩定的共表達。用於共表達的優選的cWZ羥化酶基因是當通過序列比對進行比較時具有小於約75%同一性的那些。用於共表達的更優選的cWZ羥化酶基因是當通過序列比對進行比較時具有小於約65%同一性的那些。用於共表達的甚至更優選的crtZ羥化酶基因是當通過序列比對進行比較時具有小於約60%同一性的那些。用於共表達的最優選的cWZ羥化酶基因是當通過序列比對進行比較時具有小於約55%同一性的那些此處用到的術語"密碼子簡併"指遣傳密碼允許核苷酸序列變異而不影響被編碼多肽的胺基酸序列的特性.因此，本發明涉及編碼胺基酸序列的全部或主要部分的任何核酸分子，所述胺基酸序列編碼SEQIDNOs:17和20所示的本發明的微生物多肽，技術人員熟知特定宿主細胞在選擇核普酸密碼子以確定特定胺基酸方面所表現的"密碼子偏倚性"。因此，當合成一種基因，使其提高在宿主細胞內的表達時，理想的方法是對該基因進行設計，使其密碼子選擇頻率接近該宿主細胞的優選密碼子選擇頻率。"合成基因"可從利用本領域技術人員已知方法化學合成的寡核苷酸構件裝配而得.將這些構件連接並使它們退火形成可繼續通過酶促方法被裝配並構建完整基因的基因片段。與DNA序列相關的"化學合成的"指在體外裝配組分核苷酸，DNA的人工化學合成可通過已完善的方法實現；或者可以利用許多商業可提供機器進行自動化學合成。因此，可以在優化核苷酸序列以反映宿主細胞密碼子偏倚性的基礎上，對所述基因進行相應調整，使其實現最佳的基因表達。技術人員知道當密碼子選擇偏向宿主所偏好的那些密碼子時基因表達成功的可能性。可根據對宿主細胞來源的基因的調查確定優選密碼子，其中的序列信息是已知的。"基因"指可表達特定蛋白的核酸片段。此處用到的該術語可能包括或不包括在編碼序列之前(5，非編碼序列)和之後(3，非編碼序列)的調節序列。"天然基因"指被發現存在於自然界中並具有自身調節序列的基因。"嵌合基因"指並非天然基因且包括被發現無法同時存在於自然界中的調節和編碼序列的所有基因。因此，嵌合基因可包括不同來源的調節序列和編碼序列，或來源相同但排列方式不同於在自然界中所發現方式的調節序列和編碼序列。"內源基因"指位於生物基因組內的天然位置上的天然基因。"外源"基因指通常不存在於宿主生物內，而是通過基因轉移被導入該宿主生物內的基因。外源基因可包括被插入非天然生物內的天然基因，或嵌合基因。"轉基因"指通過轉化方法已被導入基因組內的基因。術語"遣傳構建體"是指用於改變生物基因型的一系列連續核酸。遺傳構建體的非限定性實例包括但不限於核酸分子和可讀框、基因、質粒等。"編碼序列"指編碼用於特定胺基酸序列的DNA序列。此處用到的"合適的調節序列"指位於編碼序列上遊(5，非編碼序列)、內部或下遊(3，非編碼序列)並影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻譯的核苷酸序列。調節序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點和莖-環結構。"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的DNA序列。編碼序列通常位於啟動子序列的3，端。啟動子可能全部來源於天然基因，或者包含來源於自然界存在的不同啟動子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域技術人員應理解的是，不同啟動子可引導基因在處於不同組織或細胞類型內、或不同發育期或反應於不同環境或生理條件的表達.可使基因在大部分細胞類型中的大部分時間內表達的啟動子通常被稱為"組成型啟動子"。應進一步認同的是，由於大多數情況是調節序列的準確邊界尚未被完整定義，因此不同長度的DNA片段可能具有一致的啟動子活性."3，非編碼序列"指位於編碼序列下遊的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列(正常情況下限於真核生物)及其它編碼調節信號的序列，該調節信號能夠影響mRNA加工或基因表達.聚腺苷酸化信號的特徵通常在於可影響mRNA前體3，末端添加聚腺苷酸束(正常情況下限於真核生物)."RNA轉錄物"指DNA序列在RNA聚合酶催化下轉錄的產物。當RNA轉錄物是所述DNA序列的完全互補拷貝時，它被稱為一級轉錄物，或者當其可能是所述一級轉錄物的轉錄後加工衍生的RNA序列時，則被稱為成熟RNA。"信使RNA(raRNA)"指無內含子並且可被細胞翻譯成蛋白的RNA。"cDNA"指與mRNA互補和由其衍生的雙鏈DNA。"有義"RNA指包括上述mRNA並因此可被細胞翻譯成蛋白的RNA轉錄物。"反義RNA"指與把一級轉錄物或mRNA的全部或一部分互補並可阻斷靶基因表達的RNA轉錄物(U.S.5，107，065;WO99/28508)。反義RNA可能與特定基因轉錄物的任意部分，即5'非編碼序列、3，非編碼序列或編碼序列均具有互補性。"功能RNA"指反義RNA、核糖酶RNA或其它不被翻譯但仍然影響細胞過程的RNA。術語"可操作連接"指核酸序列與單個核酸片段的連接使二者之一的功能受另一方的影響。例如，當啟動子能夠影響宿主編碼序列的表達時，該啟動子與該編碼序列是可操作連接的(即該編碼序列受該啟動子的轉錄控制)。編碼序列可與調節序列按有義或反義方向可操作連接。本文所用術語"表達"指來源於本發明所述核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積.表達還可指mRNA翻譯成多肽."轉化"指將核酸分子轉移進宿主生物內，獲得遺傳穩定的遺傳。在本發明中，宿主細胞的基因組包括染色體和染色體外(如質粒)基因。含有該轉化的核酸分子的宿主生物被稱為"轉基因"或"重組"或"轉化"生物."接合"是指特定類型的轉化，其中發生DNA(如來自細菌質粒)從一個細菌細胞(即"供體")向另一個細菌細胞(即"受體")的單方向轉移.該過程涉及細胞與細胞的直接接觸，術語"碳底物"是指能夠被本發明的宿主生物代謝的碳源，並且特別是選自單糖、二糖、多糖和一碳底物或其混合物的碳源.術語"C,碳底物"是指任何缺乏碳-碳鍵的含碳分子。非限定性實例是甲烷、甲醇、甲眵、甲酸、甲酸鹽、甲基化的胺(如單胺、二胺和三甲胺)、甲基化硫醇和二氧化碳.特別優選的是能夠代謝甲烷和/或甲妹的那些生物。術語"d代謝者"是指具有利用單碳底物作為其唯一的能量和生物量來源的微生物。Q代謝者典型地是甲基營養生物和/或甲烷營養生物。術語"C,代謝菌"是指具有利用單碳底物作為其唯一的能量和生物量來源的細菌。C,代謝菌是d代謝者的亞組，其典型地是甲基營養生物和/或甲烷營養生物。術語"甲基營養生物"是指能夠氧化不含碳-碳鍵的有機化合物的生物。當甲基營養生物能夠氣化CBU時，甲基營養生物也是甲烷營養生物。一方面，微生物宿主細胞是在作為主要碳源的甲烷和/或甲醇上生長的甲基營養生物。術語"甲烷營養生物"或"曱烷營養菌"表示能夠利用甲烷作為其主要碳源和能量源的原核生物。甲烷完全氧化為二氧化碳是通過有氧降解途徑進行的.用於本發明的甲烷營養生物的典型實例包括(但不限於)甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、甲基球菌屬和甲基彎曲菌屬.一方面，甲烷營養生物是在甲烷和/或甲醇上生長的高生長甲烷營養菌林。另一方面，甲烷營養生物是甲基單胞菌種16a(ATCCPTA-2402)及其衍生物。術語"高生長甲烷營養菌林"是指能夠利用甲烷或甲醇作為唯一碳源和能量源進行生長，並且具有功能性Embden-Meyerhof碳流途徑，導致高速度生長和每克代謝的C,底物的高細胞團產率(US6689601)的細菌。此處描述的具體"高生長甲烷營養菌林"是指"甲基單胞菌16a"、"16a"或"甲基單胞菌種16a"，所述術語可以互換使用，並且是指用於本發明的甲基單胞菌菌林(曱基單胞菌種16aATCCPTA-2402)。此處用到的術語"CrtNl"是指由cr/A7基因編碼的酶，其在甲基單胞菌種16a的天然類胡蘿蔔素生物合成途徑中是有活性的.該基因位於包含c/^V2和aW的操縱子中。此處用到的術語"ALD"是指由flW基因編碼的酶，其在甲基單胞菌種16a的天然類胡蘿蔔素生物合成途徑中是有活性的.該基因位於包含crtA7和cr^V2的操縱子中。此處用到的術語"CrtN2"是指由c/^V2基因編碼的酶，其在甲基單胞菌種16a的天然類胡蘿蔔素生物合成途徑中是有活性的.該基因位於包含cr,A7和fl/rf的操縱子中。此處用到的術語"CrtN3"是指由cW7VJ基因編碼的酶，其影響甲基單胞菌種16a的天然類胡蘿蔔素生物合成途徑，該基因不是位於cW基因簇中，而是位於甲基單胞菌基因組的不同位置.此處用到的術語"MWM1200(」cW簇啟動子+4cWA^)"或"MWM1200"是指甲基羊胞菌種16a的突變菌株，其中c/t簇啟動子和cWJV3基因被破壞.天然C3o類胡蘿蔔素生物合成途徑的破壞導致對C40類胡蘿蔔素生產進行工程化的合適背景(無色素)。甲基單胞菌MWM1200菌株是以前建立的，其是合適的類胡蘿蔔素生產宿主(US10/997844;在此引入作為參考)。術語"無色素"或"白色突變體"是指甲基單胞菌種16a，其中不產生天然的粉色色素(如C3o類胡蘿蔔素)。因此，細菌細胞看起來是白色的，而不是粉色。術語"質粒"、"栽體"和"盒"指通常攜帶了不屬於細胞中樞代謝部分的基因，並且通常為環狀雙鏈DNA分子形式的額外染色體元件。這種元件可能是任意來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線型或環狀的單或雙鏈DNA或RNA，其中的許多核苷酸序列已被加入或重組進獨特構建體中，該獨特構建體能夠將用於選定的基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3，非翻譯序列一起導入細胞。"轉化盒"指除了含有外源基因之外還含有有利於轉化特定宿主細胞的其它元件的特異性栽體。"表達盒"指除了含有外源基因之外還含有可增強該基因在外源宿主內的表達的其它元件的特異性栽體。術語"改變的生物學活性"指與微生物核苷酸序列編碼的蛋白有關並可通過分析方法測定的活性，且該活性高於或低於天然序列的相關活性。"增強的生物學活性"指經過改變後比天然序列的相關活性高的活性."降低的生物學活性"指經過改變後比天然序列的相關活性低的活性。術語"序列分析軟體"指用於分析核苷酸或胺基酸序列的所有計算機算法或軟體程序。"序列分析軟體"可通過商業渠道或自主研發獲得。典型的序列分析軟體包括但不限於GCG系列程序(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，Wl)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschuletal"丄Mol.Biol.215:403-410(1990);和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.ParkSt.Madison，W裡53715USA);以及編入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes"Proc.Int.Symp.l(1994)，MeetingDate1992，111-20.Editor(s):Suhai，Sandor.Publisher:Plenum,NewYork,NY)，VectorNTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher(TM)v.4,05,應當理解的是，在本申請的上下文中，如無另外指明，序列分析軟體均被用於分析，且分析結果將基於上述程序的"默認值"。本文所用的"默認值"指軟體製造商最初在軟體首次初始化時便加栽的所有數值或參數組.本發明提供了從泡囊短波單胞菌DC263(US11/015433)分離的、新發現的CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶.此外，本發明中將來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo,700728的假定蛋白(GenBankZP_00094836.1;SEQIDNO:20)的功能表徵為具有類胡蘿蔔素羥化酶活性。證明了兩種類胡蘿蔔素羥化酶都通過本發明的方法生產羥化類胡蘿蔔素本發明的序列可以體外和體內用於重組宿主中，以便從環狀的類胡蘿蔔素化合物生產羥化類胡蘿蔔素.泡囊短波單胞菌DC263cwZ核苷酸鹼基和推導的胺基酸序列與公共資料庫的比較發現最相似的已知序列與此處報導的胺基酸序列在161個胺基酸的長度上具有大約51%的同一性，所述同一性是用BLASTP檢索的BLOSUM62矩陣確定的(表3),用VectorNTI中的AlignX獲得表4中報導的成對比較值。因此，優選的胺基酸片段與此處的序列具有至少約80%的同一性，更優選的胺基酸序列與此處報導的胺基酸片段具有至少約90%的同一性，甚至更優選的胺基酸序列與此處報導的胺基酸片段具有至少約95%的同一性，最優選的胺基酸序列與此處報導的胺基酸片段具有至少約99%的同一性，類似地，優選的cr"基因包含編碼活性蛋白，並且與此處報導的本發明的核酸序列具有至少80%同一性的核酸序列.更優選的cr"核酸分子與此處的核酸序列具有至少90%的同一性.甚至更優選的cWZ核酸分子與此處的核酸序列具有至少95%的同一性.最優選的c/tZ核酸分子與此處報導的核酸分子具有至少99%的同一性.同源物的分離本發明的核酸分子可被用於分離編碼來源於相同或其它微生物物種的同源蛋白的基因，利用序列依賴性方案分離同源基因是本領域熟知的。序列依賴性方案的實例包括，但不限於核酸雜交法和可通過核酸擴增技術的多種應用進行示例的DNA和RNA擴增法(例如聚合酶鏈反應(PCR)，Mullisetal,US4,683,202);連接酶鏈反應(LCR)，Tabor,S.etal.,Proc.Acad.Sci.USA82:1074(1985));或鏈置換擴增(SDA，Walker,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:392(1992))。例如，通過利用本領域技術人員熟知的方法，並以本發明核酸分子或其部分作為DNA雜交探針篩選任意來自需要的細菌的文庫，便可直接分離編碼與本發明的蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基因。基於本發明核酸序列的特異性寡核苷酸探針可通過本領域已知的方法設計併合成(Maniatis，同上)。此外，通過採用本領域技術人員已知的方法(例如隨機引物DNA標記、切口翻譯、末端標記技術)，可將該完整序列直接用於合成DNA探針，或者是通過利用可獲得的體外轉錄系統將其用於合成RNA探針。此外，可設計特異性引物並將其用於擴增本發明所述序列的一部分或其全長.所獲擴增產物可在擴增反應期間被直接標記，或是在擴增反應後被標記，並被用作探針，以在合適的嚴格條件下分離全長DNA片段在PCR型擴增技術中，引物典型地具有不同序列，並且彼此不互補。根據預期的試驗條件，應對引物序列進行設計，以有效並可靠地複製靶核酸。PCR引物的設計方法是本領域技術人員常用並熟知的(TheinandWallace,"TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",HumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.DavisEd.，(1986)pp.33-50IRLPress,Herndon，Virginia);Rychlik,W.(1993)White,B.A.(ed.)，MethodsinMolecularBiology.Vol.15，pages31-39，"PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications",HumaniaPress,Inc.，Totowa，NJ.),本發明所述序列的兩個短片段通常可被應用在聚合醃鏈反應方案中，以擴增編碼DNA或RNA來源的同源基因的較長核酸片段。聚合酶鏈反應還可基於克隆核酸片段的文庫進行，其中一種引物的序列來源於本發明所述的核酸片段，另一種引物的序列則利用編碼微生物基因的mRNA前體的3，末端存在的聚腺苷酸束。在缺乏聚腺苷酸化mRNA的微生物基因的情況下，可以使用隨機引物。隨機引物也可以用於DNA擴增。或者，笫二種引物序列可基於克隆栽體來源的序列，例如，技術人員可遵循RACE程序(Frohmanetal.,PNASUSA85:8998(1988))，通過PCR擴增介於轉錄物中的單個位點與3，或5，末端之間的特定區域的拷貝，生成cDNAs。由本發明所述序列可設計出以3，和5，方向定向的引物。可利用商業可提供的3，RACE或5，RACE系統(BRL，Gaithersburg,MD)分離特定3，或5，cDNA片段(Oharaetal.，PNASUSA86:5673(1989);Lohetal.,Science243:217(1989))。或者，本發明的序列可作為雜交試劑被用於鑑定同源物。核酸雜交試驗的基本組成包括探針、疑似含有目的基因或基因片段的樣品以及特異性雜交方法。本發明的探針典型地是與待檢核酸序列互補的單鏈核酸序列。探針與待檢核酸序列是"可雜交的".探針長度的變化範圍是5個到數萬個鹼基，這將取決於待進行的特定實驗。典型的合適探針長度為大約15到大約30個鹼基。該探針分子只需要一部分與待檢核酸序列互補。此外，探針與靶序列之間無需完全互補。不完全互補分子之間雜交的結果是雜交區內某一部分的鹼基與正確互補鹼基不配對。業已明確定義了雜交方法。探針和樣品典型地必須在允許核酸雜交的條件下混合。這包括使探針和樣品在合適的溫度和合適濃度的無機或有機鹽存在條件下接觸，探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時間，以使該探針和樣品核酸之間所有可能的雜交均可發生.混合物中的探針或靶的濃度決定發生雜交所需的時間。探針或靶的濃度越高，所需的雜交溫育時間越短。可任選地加入離液劑.離液劑通過抑制核酸酶活性使核酸穩定，此外，離液劑可使短寡核苷酸探針在室溫下實現靈敏和嚴格雜交(VanNessandChen,Nucl，AcidsRes,19:5143-5151(1991)),合適的離液劑包括氯化胍、疏氛酸胍、硫氛酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鍾和三氟乙酸銫等。離液劑的終濃度典型地為大約3M。如果需要，可將甲醯胺加入雜交混合物中，其濃度典型地為30-50%(v/v),可應用多種雜交溶液。這些溶液典型地包括大約20-60%體積，優選30%體積的極性有機溶劑。常用雜交溶液應用了大約30-50%v/v甲耽胺，大約0.15-1M氯化鈉、大約0.05-0.1M緩衝劑(例如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH範圍大約6-9))、大約0.05-0.2%去汙劑(例如十二烷基硫酸鈉)，或0.5-20mMEDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(大約300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(大約250-500kdal)和血清白蛋白。典型雜交溶液還可包括大約0.1-5mg/mL的未標記栽體核酸、片段化的核DNA(例如小牛胸腺或鮭魚精子DNA或酵母RNA)，並任選地含有重量體積比約為0.5-2%的甘氨酸，還可包括其它添加劑，諸如體積排阻劑，包括多種極性水溶性或可膨脹劑(例如聚乙二醇)、陰離子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和陰離子糖聚合物(例如硫酸葡聚糖)。核酸雜交可適用於多種試驗形式。其中一種最適形式是夾心試驗。夾心試驗尤其適用於非變性條件下的雜交。夾心型試驗的主要成分是固相支持物。該固相支持物通過吸附或共價偶聯方式固定了未被標記並與所述序列的一部分互補的核酸探針，本發明所述核苷酸和推導胺基酸序列的可獲得性有利於對DNA表達文庫的免疫學篩選。可以合成代表本發明所述胺基酸序列的若干部分的合成肽。這些肽可被用於使動物免疫，以生成對包括該胺基酸序列的肽或蛋白具有特異性的多克隆或單克隆抗體.接著，這些抗體便可被用於篩選DNA表達文庫，進而分離被關注的全長DNA克隆(Le匿r，R.A.Adv.Immunol.36:1(1984);Maniatis，同上)。重組表達-微生物表達可以在異源宿主細胞，特別是在微生物宿主細胞中製備本發明的序列的基因和基因產物.在重組微生物宿主中的表達可以用於表達多種途徑中間體，用於調節宿主中已經存在的途徑，或用於合成用所述宿主至今不能合成的新產物。用於本發明基因和核酸分子的優選的異源宿主細胞是微生物宿主，這些宿主可以存在於真菌或細菌家族，並且能夠在大範圍的溫度，pH值，和溶劑耐受性條件下生長.例如，考慮任何細菌、酵母和絲狀真菌將是表達本發明核酸分子的合適宿主.由於無論細胞原料如何，轉錄、翻譯和蛋白生物合成裝置都是相同的，因此無論用於產生細胞生物量的碳原料如何，都表達功能基因.大規模的微生物生長和功能基因表達可以使用多種簡單的或複雜的碳水化合物，有機酸和醇(即甲醇)，並且對於光合或化學自養宿主來說還可以使用諸如甲烷或二氧化碳的飽和烴，不過，所述功能基因可以通過特殊的生長條件進行調節、阻抑或抑制，該條件包括氮，碑，硫，氧，碳或任何微量微營養成分(包括小的無機離子)的形式和數量，另外，功能基因的調控可以通過特殊調節分子的存在或缺乏實現，所述分子被添加到培養物中，並且通常不被認為是營養物或能源。生長速度可能同樣是基因表達的重要調節因子。合適的宿主菌林的例子包括，但不局限於真菌或酵母物種，如麴黴屬、木黴屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬，或細菌物種，如沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、發酵單胞菌屬、土壤桿菌屬、赤桿菌屬、綠菌屬、著色菌屬、黃桿菌屬、噬纖維菌屬、紅細菌屬、紅球菌屬、鏈黴菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、異常球菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、曱基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基微菌屬、甲基孢囊菌屬、產鹼菌屬、集胞藍細菌屬、聚球藍細菌屬、魚腥藍細菌屬、硫桿菌屬、甲烷桿菌屬、克氏桿菌屬和粘球菌屬。優選的宿主菌林包括埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬和甲基單胞菌屬。最優選的細菌宿主菌抹包括甲基單胞菌種16a及其衍生物(即衍生自甲基單胞菌種16aATCCPTA-2402的突變體)。包括能指導外源蛋白高水平表達的調節序列的微生物表達系統和表達栽體為本領域技術人員所熟知。可以將任何這樣的系統和栽體用於構建嵌合基因，以便表達本發明的類胡蘿蔔素鞋化酶.然後可以通過轉化將所述嵌合基因導入合適的微生物，以便提供所述酶的高水平表達。因此，預計例如將編碼本發明的細菌醉的嵌合基因導入合適啟動子的控制下，將證明增加的或改變的羥化類胡蘿蔔素生產.考慮其可以用於在天然宿主細胞和異源宿主種表達本發明的基罔.將本發明的crtZ基因導入天然宿主，將導致羥化類胡蘿蔔素生產的水平改變.此外，本發明的基因也可以導入非天然宿主細菌，其中可以操作存在的類胡蘿蔔素途徑。通過本發明的生產的特定的鞋化類胡蘿蔔素包括但不限於玉米黃素、蝦青素、p-隱黃素、3-羥基海膽稱、3'-羥基海膽嗣、adonirubin、adonixanthin、四羥基-P，P'-胡蘿蔔素-4，4'-二嗣、四鞋基-P，p'-胡蘿蔔素-4-稱、眉藻黃素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黃素、3-鞋基-，胡蘿蔔素、3-羥基-4-稱基個胡蘿蔔素、細菌玉紅黃素、bacteriorubixanthinal和黃體素.特別感興趣的是蚱青素和玉米黃素的生產，其合成示於圖l。本發明的CrtZ酶的特異性底物是具有至少一個(J-芷香稱型環的環狀類胡蘿蔔素.環狀類胡蘿蔔素是本領域公知的，並且可以商購。優選的CrtZ羥化酶底物包括但不限於p-胡蘿蔔素、角黃素、p-隱黃素、^羥基海膽稱、3'-羥基海膽酮、海膽稱、adonirubin、Y-胡蘿蔔素、4-酮基-Y-胡蘿蔔素、脫氧-屈曲黃素和ot-胡蘿蔔素.可用於轉化合適的宿主細胞的栽體或盒為本領域所熟知。通常，所述栽體或盒包括指導相關基因轉錄或翻譯的序列，選擇標記，使得能夠自主複製或染色體整合的序列.合適的栽體包括位於所述基因5'的區，它具有轉錄起始控制，以及位於DNA片段的3'的區，由它控制轉錄終止。當這兩個控制區來自與轉化過的宿主細胞同源的基因時是最優選的，不過，可以理解的是，這些控制區不一定來自被選擇用作生產宿主的特定物種的天然基因。用於驅動本發明的ORF在需要的宿主細胞中表達的起始控制區或啟動子是多種多樣的，並且為本領域技術人員所熟知。基本上能夠驅動所述基因的任何啟動子都是適用於本發明的，包括，但不局限於CTC7,脂3,G/4"，G^ZJO，4Z)i/7,PGK,04屍D仏77屍/,t/^A,77，/(用於在糖酵母屬中表達)；^OV7(用於在畢赤酵母屬中表達)；和/"c,a/"a,W,//p,77,似c，和rrc(用於在大腸桿菌中表達)以及fl附y,apr,啟動子和可用於在芽孢桿菌屬中表達的各種噬菌體啟動子，以及用於在甲基單胞菌屬中表達的分離自g/"5，m狄F,g(y狄//，似pG和A/w基因的啟動子(USSN10/689200;在此引入作為參考)。此外，諸如氯黴素抗性基因啟動子(屍caO的啟動子也可以用於在甲基單胞菌屬中表達.終止控制區還可以來自所述優選宿主的各種天然基因。任選地，終止位點可能是不必要的，不過，最優選的是包括這樣的位點.對本發明基因的序列的了解可以用於在具有類胡蘿蔔素生物合成途徑的任何生物中操作該途徑，所述生物特別是甲基單胞菌種16a和大腸桿菌。操作遣傳途徑的方法是常見的，並且是本領域公知的。特定途徑中的選定的基因可以被多種方法上調或下調。此外，可以通過基因破壞和相似的技術消除或提純竟爭途徑生物，一旦鑑定了關鍵的遺傳途徑並且進行了測序，就可以上調特定基因，並且增加途徑的輸出。例如，可以將額外拷貝的被靶定的基因導入宿主細胞中的多拷貝質粒，如pBR322上。任選地，可以通過染色體表達多種編碼CrtZ羥化酶的基因，以增加類胡蘿蔔素的產量。但是，多種基因的穩定染色體表達通常需要採用的基因的編碼序列包含彼此具有低到中度序列特異性的核苷酸序列。本發明的類胡蘿蔔素羥化酶基因與所有以前報導的cWZ基因相比表現出相對低到中度的核苷酸序列同一性。或者，可以修飾靶基因，以便使其處於非天然啟動子的控制下。當需要在細胞周期中的特定點或在發酵過程中操作一種途徑時，可以用受調節或誘導型啟動子代替耙基因的天然啟動子。類似地，在某些情況下，可以修飾天然或內源啟動子，以增加基因表達。例如，可以通過突變、缺失和/或取代而體內改變內源啟動子(參見Kmiec，US5，565，350;Zarlingetal"PCT/US93/03868)。或者，可能需要減少或消除靶途徑或竟爭途徑中某些基因的表達，所述竟爭途徑可能導致能量或碳的竟爭性減少，可以採用為此目的進行的下調基因的方法。當要破壞的基因的序列已知時，最優有效的基因下調方法之一是被靶定的基因的破壞，其中將外源DNA插入結構基因，以便破壞轉錄。這可以通過建立基因盒而實現，所述基因盒包含要插入的DNA(通常是遣傳標記)，其側翼是與要破壞的基因的一部分具有高度同源性的序列.所迷盒在宿主細胞中的導入導致了外源DNA通過細胞的天然DNA複製機制導入了結構基因中(HamiUonetal"J.Bacteriol.，171:4617-4622(1989);Balbasetal.，Gene，136:211-213(1993);Gueldeneretal.，NucleicAcidsRes,，24:2519-2524(1996);和Smithetal"MethodsMol.Cell.Biol"5:270-277(1996)),當靶基因序列已知時，反義技術是另一種下調基因的方法。該方法的實現是通過克隆需要的基因的核酸片段，並將其與啟動子可搮作連接，從而得以轉錄RNA的反義鏈，接著將該構建體導入宿主細胞中，生成RNA的反義鏈.反義RNA通過阻止編碼目的蛋白的mRNA的累積而抑制了基因表達.本領域技術人員將了解的是，為了降低特定基因的表達所需考慮的特殊因素與反義技術的應用有關。例如，反義基因的合適表達水平可能需要利用不同的嵌合基因，其中應用到本領域技術人員已知的不同調節元件.雖然靶定的基因破壞和反義技術提供了當序列已知時有效下調基因的方法，人們仍然研發了另一些特異性較差並且不以序列為基礎的方法例如，可使細胞暴露於UV輻射，接著篩選需要的表型，用化學劑進行的誘變還有助於生成突變體，通常採用的物質包括可影響非複製型DNA的化學制刑(例如HNCh和NH2OH)，以及可影響複製型DNA的試劑(例如可導致移碼突變的吖啶染料)。本領域有文獻詳細記錄了利用放射或化學試劑產生突變體的特定方法。參見例如ThomasD.Brock在SinauerAssociates:Sunderland,MA出版的第二版Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology(1989)(下文稱作"Brock")中的才艮道；或Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol"36:227(1992)(下文稱作"Deshpande")。另一種非特異性的基因破壞方法是利用可轉座元件或轉座子。轉座子是可被隨機插入DNA但稍後可基於序列將其重新獲得並從而確定其插入位置的遺傳因子。體內和體外轉座方法均是已知的.這兩種方法均包括將可轉座元件與轉座酶結合應用.當可轉座元件或轉座子在轉座酶存在條件下與核酸分子接觸時，可轉座元件將被隨機插入該核酸分子中。該技術有助於隨機誘變和基因分離，因為可以基於可轉座元件的序列鑑定已破壞的基因。用於體外轉座的試劑盒可通過商業渠道獲得(參見例如可獲得自PerkinElmerAppliedBiosystems，Branchburg，NJ的以酵母Tyl元件為基礎的PrimerIslandTransposition試劑盒；可獲得自NewEnglandBiolabs，Beverly,MA的以細菌轉座子Tn7為基礎的GenomePrimingSystem;和可獲得自EpicentreTechnologies,Madison,WI的以Tn5細菌轉座因子為基礎的EZ::TNTransposonInsertionSystems),作為微生物宿主的甲基營養生物和甲基單胞菌種16a儘管從重組微生物來源(如用於生產番茄紅素的大腸桿菌和產朊假絲酵母(Farmer，W.R.andLiao，L.C.，Biotechnol.Prog"17:57-61(2001);Wang,etal.，BiotechnolProg.，16:922-926(2000);Misawa，N.andShimada，H.，J.Biotechnol"59:169-181(1998》Shimada，H.etal.Appl.Environm.Microbiol.64:2676-2680(1998));用於生產卩-胡蘿蔔素的大腸桿菌、產肌假絲酵母和Pfaffiarhodozyma(Albrecht，M.etal.，Biotechnol.Lett.21:791-795(1999);Miura，Y.etal"Appl.Enviro亂Microbiol.64:1226-1229(1998);US5,691,190);用於生產玉米黃素的大腸桿菌和產朊假絲酵母(Albrecht，M,etal.，同上文；Miura，Y.etal.,同上文)；用於生產蝦青素的大腸桿菌和Pfaffiarhodozyma(US5,466,599;US6，015，684;US5，182，208;US5,972,642);也參見US5，656，472，US5，545，816，US5，530，189，US5，530，188，US5,429,939和US6，124，113)生產了多種類胡蘿蔔素，但這些用不同cW基因的多種組合生產類胡蘿蔔素的方法的缺點是低產率和依賴於相對昂貴的原料。因此，需要鑑定在微生物宿主中從便宜的原料，如甲烷和甲醇生產較高產率的類胡蘿蔔素的方法.存在許多利用單碳底物作為它們的唯一能量源的微生物。所述微生物在此稱作"C,代謝者"。這些生物的特徵在於它們利用缺乏碳-碳鍵的碳底物作為唯一的能量和生物量來源的能力.這些碳底物包括甲烷、甲醇、甲酸鹽、甲醛、甲酸、甲基化的胺(如單胺、二胺和三甲胺)、甲基化硫醇、二氧化碳和多種其它的缺乏碳-碳鍵的還原的碳化合物。優選的底物包括甲烷和/或甲醇。所有C,代謝微生物通常分類為甲基營養生物。甲基營養生物可以定義為能夠氧化不含碳-碳鍵的有機化合物的任何生物。但是，兼性甲基營養生物、專性甲基營養生物和專性甲烷營養生物都是甲基營養生物的各種亞型.具體地-兼性甲基營養生物具有氧化不含碳-碳鍵的有機化合物的能力，但也可以利用其它碳底物，如糖類和複合碳水化合物得到能量和生物量。兼性甲基營養細菌存在於許多環境中，但最常見是從土壤、垃圾和廢物處理站分離。大多數兼性甲基營養生物是泛菌的P和Y亞族的成員(Hansonetal"Microb.GrowthCICompounds.,[Int.Symp.l，7th(1993)，pp285-302.Murrell，J.CollinandDonP.Kelly,Eds.Interc印t:Andover，UK;Madiganetal"BrockBiologyofMicroorganisms,8thed.，PrenticeHall:UpperSaddleRiver,NJ(1997)),-專性甲基營養生物是限於利用不舍碳—碳鍵的有機化合物來產生能量的生物。-專性甲烷營養生物是具有氧化甲烷的獨特能力的專性甲基營養生物。此外，利用單碳底物的能力不限於細菌，也延伸到酵母和真菌。許多酵母屬都能夠利用單碳底物作為除更複雜物質之外的能量源(即甲基營養酵母)。儘管已知大量的所述甲基營養生物，這些微生物中只有很少數在物質合成的工業過程中被成功利用。並且，儘管單碳底物是經濟的能量源，但這些微生物的遺傳操作的困難以及關於它們的遺傳機制的信息缺乏將它們的用途主要限制在了天然產物的合成，儘管有這些困難，很多甲烷營養生物含有固有的類異戊二烯途徑，使得這些生物能夠合成色素，並且提供了預計將這些微生物工程化而用於生產多種非內源類異戊二烯化合物的潛能。由於甲烷營養生物能夠利用單碳底物(即甲烷和/或甲醇)作為能量源，以低成本在這些生物中生產類胡蘿蔔素是可能的，將甲烷營養生物工程化以生產P-胡蘿蔔素的一個這樣的實例描述於US09/941947，在此引入作為參考。提供了用於在能夠利用單碳底物作為唯一能量源的微生物中表達參與類胡蘿蔔素化合物生物合成的基因的方法.宿主微生物可以是具有合成法呢基焦磷酸(FPP)作為類胡蘿蔔素的代謝前體的能力的任何G代謝者.更具體地，適於本發明的兼性甲基營養細菌包括但不限於嗜甲基菌屬、甲基菌屬、甲基桿菌屬、生絲微菌屬、黃色桿菌屬、芽孢桿菌屬、副球菌屬、諾卡氏菌屬、節桿菌屬、紅假單胞菌屬和假單胞菌屬.用於本發明的具體甲基營養酵母包括但不限於假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬和紅酵母屬.示例的甲烷營養生物包括但不限於甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬和甲烷單胞菌屬.本發明特別感興趣的是具有能量上有利的碳流途徑的髙生長專性甲烷營養生物.例如，具有一些途徑特徵的甲烷營養生物的特定菌林使其特別適用於碳流操作.該菌株稱作甲基單胞菌16a(ATCCPTA2402)(US6689601).這種特定菌林和其它相關的甲基營養生物是用於表達本發明的基因產物的優選微生物(即用於生產C仰類胡蘿蔔素)。已經建立了甲基單胞菌種16a的優化形式，並且命名為甲基單胞菌種16aMWM1200(US10/997844;在此引入作為參考)。敲除內源性<:30類胡蘿蔔素途徑(4基因被重新命名為/印P，作為/sp基因襄的一部分(SwissProtein編號Q46893)。隨後，可以通過K^必基因編碼的酶在ATP依賴性反應中將4-二砩酸胞苷醯JC-甲基-D-赤蘚糖醇的第2位的羥基磷酸化。YchB將4-二磷酸胞苷醯-2C-曱基-D-赤蘚糖醇礴酸化，得到4-二磾酸胞苷醯-2C-甲基-D-赤蘚糖醇2-辨酸.將K/^基因重新命名為/s/7E，其也是/印基因簇(SwissProtein編號P24209)的一部分。YgbB以CTP依賴性方式將4-二磷酸胞苷醯-2C-甲基-D-赤蘚糖醇2-磷酸轉化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環二磷酸。最近也對該基因進行了重新命名，其屬於/^基因簇。具體地，jg6B基因的新名稱是/印F(SwissProtein編號P36663)。認為由gcpE(ispG)和lytB(/印/0基因(也許還有其它基因)編碼的酶參與導致形成異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的反應。IPP也可以通過IPP異構酶異構為DMAPP，該異構酶由/rf,'基因編碼。但是，該酶不是存活所必須的，並且可能不存在於利用2C-甲基-D-赤蘚糖醇4-辨酸(MEP)途徑的一些細菌中。最近的證據表明，MEP途徑在IPP之前分支，並且獨立地經過/，W基因產物產生IPP和DMAPP。除了在補加了IPP和DMAPP的培養基中，Z^fi敲除突變在大腸桿菌中是致死的。FPP的合成是通過IPP異構為二甲基烯丙基焦磚酸而發生的。該反應之後是由催化的一系列的兩個異戊二烯基轉移酶反應，導致產生香葉基焦磷酸(GPP;—種10碳分子)和法呢基焦磷酸(FPP;—種15碳分子)。已知編碼上遊途徑的元件的基因來源於多種植物、動物和細菌來源，如表l所示。tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45X82542,法呢基二磷酸合酶(FPS1)的P.argentatummRNAXB2543，法呢基二磷酸合酶(FPS2)的P.argentatum邁RNABC010004,人，法呢基二礴酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移醃)，克隆MGC15352IMAGE,4132071,mRNA,完整cdsAF234168，Dictyosteliumdiscoideum法呢基二碑酸合酶(Dfps)L46349,擬南芥法呢基二磷酸合醉(FPS2)mRNA,完整cdsL46350,擬南芥法呢基二磷酸合酶(FPS2)基因，完整cdsL46367,擬南芥法呢基二磷酸合酶(FPS1)基因，可變產物，完整cdsM89945,大鼠法呢基二磷酸合酶基因，外顯子l-8NM-002004,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS)，m腿，U36376,黃花蒿法呢基二磷酸合酶(fpsl),mRNA，完整cdsXM-001352,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS),禮AXNL034497,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS)'mRNAXM—034498，人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二曱基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS),mRNAXM—034499,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS),m固XM-0345002,人法呢基二礴酸合酶(法呢基焦確酸合成酶，二甲基烯丙基轉移酶，香葉基轉移酶)(FDPS),mRNA下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑上遊類異戊二烯途徑和下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的區分某種程度上是主觀的，由於FPP合成在生產類胡蘿蔔素和不生產類胡蘿蔔素的細菌中是共有的，下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的第一個步艱被認為是以將法呢基焦磷酸(FPP)轉化為香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的異戊烯基轉移酶反應而開始的，編碼GGPP合成酶的crW基因負責該異戊烯基轉移酶反應，該反應將IPP添加到FPP，以產生20碳分子GGPP'兩個分子的GGPP的縮合反應形成八氫番茄紅素(PPPP)，即下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的第一個40碳分子。該醉促反應由編碼八氫番茄紅素合酶的c/t5催化.番茄紅素是通過4個連續的脫氫反應從八氫番茄紅素製備的，所述反應除去8個氫原子，該反應是由基因cw/(編碼八氫番茄紅素去飽和酶)催化的。該反應的中間體是六氫番茄紅素、c-胡蘿蔔素和鏈孢紅素。番茄紅素環化酶(crtY)將番茄紅素轉化為|3-胡蘿蔔素但是，可以用其它基因生產多種其它類胡蘿蔔素。例如，通過來自P-胡蘿蔔素羥化酶(由cWZ基因編碼)的活性的羥化反應將p-胡蘿蔔素轉化為玉米黃素。P-隱黃素是該反應的中間體，可以通過c"『、Mr或c"O基因編碼的p-胡蘿蔔素嗣酶將p-胡蘿蔔素轉化為角黃素，海膽嗣典型地是該反應的中間體。然後可以通過cWZ基因編碼的P-胡蘿蔔素羥化酶將角黃素轉化為蝦青素。Adonbirubrin是該反應的中間體。可以將玉米黃素轉化為玉米黃素-P-二葡糖苷。該反應是由玉米黃素葡糖基轉移酶(crtX)催化的。已知編碼下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的元件的基因來源於多種植物、動物和細菌來源，如表2所示。表2編碼下遊類胡蘿蔔素生物合成途徑的基因的來源tableseeoriginaldocumentpage48tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50tableseeoriginaldocumentpage51非cWZ類胡蘿蔔素基因的優選來源是斯氏泛菌(ATCC8199;WO02/079395)、成團泛菌DC404(US10/808807;在此引入作為參考)、腸桿菌DC260(US10/808979;在此引入作為參考)、泡囊短波單胞菌DC263(US11/015433;在此引入作為參考)，和SphingomonasmelonisDC18(US11/015433;在此引入作為參考)。採用本發明的方法生產羥化類胡蘿蔔素的優選cWZ基因來源是泡囊短波單胞菌DC263(SEQIDNO:16)或NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278(SEQIDNO:19)。通過採用表2所示基因和本發明的優選cr《Z基因的組合，可以用本發明的方法製備多種不同的類胡蘿蔔素和類胡蘿蔔素衍生物，前提是宿主生物中存在足夠的FPP來源.例如，基因簇cr"X17B使得能夠生產P-胡蘿蔔素.將cr《Z加入cr^AT/B，使得能夠生產玉米黃素。實施例下述實施例進一步定義了本發明，應當理解的是，這些實施例雖然指出了本發明的優選實施方案，但僅用於例證，通過上文的論述和這些實施例，本領域技術人員可確定本發明的基本特徵，並且在不背離本發明精神和範疇的前提下，可對其進行多種改變和改進，使其適用於多種用途和條件。通用方法應用在實施例中的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的，並且描述於Maniatis(同上文)和T,J.Silhavy，M.L.Bennan，andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及Ausubel，F.M.etal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,pub.byGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)。適用於細菌培養的維持和生長的材料和方法是本領域熟知的。適用於下述實施例的才支術可參見ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,eds)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.(1994))，或Brock(同上文)或Deshpande(同上文)。如無另外指明，用於細菌細胞的生長和維持的所有試劑、限制酶和材料獲自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、DIFCOLaboratories/BDDiagnostics(Sparks,MD)、Promega(Madison，Wl)、NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)、GIBCO/BRLLifeTechnologies(Carlsbad,CA)或SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)。用Sequencher程序進行序列編輯和比對。nr資料庫中的序列檢索用採用BLOSUM62矩陣的BLASTP進行。用VectorNTI中的AlignX進行核苷酸和胺基酸序列的逐對序列比對.當在這些或其它程序中未提示程序參數時，使用默認值，縮寫詞的含義如下"h"指小時、"min"指分鐘、"sec"指秒、"d"指天、"mL"指毫升、"|iL"指微升、"L"指升、"g"指克、"mg"指毫克、"jig"指微克、"ng"指納克、"ppm"指每百萬的份數。實施例1生產類胡蘿蔔素的細菌菌林的分離和表徵本實施例描述了兩種細菌菌株，即泡囊短波單胞菌DC263和SphingomonasmelonisDC18的分離和它們的天然類胡蘿蔔素的初步分析.菌林分離和分型為了分離天然的類胡蘿蔔素生產菌林，從環境樣品的集合中分離了有顏色的微生物.將來自Wilmington,Delaware的一個院子的大約lg的表面土壌重懸於10mL自來水中。將10ML滿環的水劃線到Luria-Broth(LB)板上，將板在30TC下溫育。挑選具有不同菌落外觀的有顏色的細菌，並且劃線兩次到在LB板上均勻，在30*0下溫育。在這些菌落中，形成橙色-粉色菌落的一個菌落被命名為菌林DC263(US11/015433)。從賓夕法尼亞的溪流中分離了菌林DC18。將含水樣品的系列稀釋液(l(T2，IO"和10_6)鋪板到具有富含胰化蛋白腖和酵母的基本培養基的大245x245mm15%瓊脂板上。基本培養基的成分(每升)是NH4C10.8g，KH2P040.5g，MgCl26H200.2g，CaCl22H200.1g，NaN031.3g，和NazS040.5g'儲液1的成分是(每升)次氮基三乙酸12.8g，FeCl2.4H200.3g，CuCl2,2H200.0254g,MnCl2.4H20O,lg，CoCl2.6H200.312g，ZnCl2O.lg，H3B030.01g，Na2Mo04.2H200.01g和NiCl2.6H200.184g。將10毫升儲液1加入每1升基本培養基。用濃度為10g/L的胰化蛋白腖和5g/L的酵母提取物補充培養基。將培養基pH調節為7。在室溫下溫育平板，將單菌落劃線到相同平板上兩次。選擇形成橙色菌落的一個菌林，命名為菌林DC18(US11/0154")。用DC263和DC18進行16SrRNA基因測序.具體地，用引物HK12:5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG畫3'(SEQIDNO:1)和JCR14:5-ACGGGCGGTGTGTAC-3'(SEQIDNO:2)，通過PCR擴增菌林的16SrRNA基因。根據製造商的說明書(Qiagen，Valencia,CA)，用QIAquickPCR純化試刑盒純化擴增的16SrRNA基因，並且在自動化的ABI測序儀(AppHedBiosystems，FosterCity，CA)上測序，用引物HK12、JCR14和JCR15:5，-GCCAGCAGCCGCGGTA-3，(SEQIDNO:3)起始測序反應。將DC263的組裝的1268bp16SrRNA基因序列(SEQIDNO:4)和DC18的1291bp16SrRNA基因序列(SEQIDNO:5)用作對GenBank⑧進行的BLASTN檢索(Altschuletal"NucleicAcidsRes.，25:3389-3402(1997))的詢問序列，DC263的16SrRNA基因序列表現出與短波單胞菌林的基因序列的同源性，最高命中為與泡嚢短波單胞菌的99%同一性，該菌林命名為泡囊短波單胞菌DC263,DC18的16SrRNA基因序列表現出與鞘氨醇單胞菌林的同源性，最高命中為與Sphingomonasmelonis的98%同一性。因此將該菌林命名為SphingomonasmelonisDC18。類胡蘿蔔素分析按照對菌林分離的描述，使泡囊短波單胞菌DC263在100mLLB中生長。使SphingomonasmelonisDC18在100mL相同培養基中生長。使兩種菌株都在30TC振蕩下生長過夜。通過4000g離心15分鐘使細胞沉澱，用10mL丙酮提取細胞沉澱。將提取物在氮氣中乾燥，重新溶解於1-2mL丙胡中。用AcrodiscCR25mm注射過濾器(PallCorporation,AnnArbor，MI)過濾提取物.然後將其在0.1mL10%丙酮+90%乙腈中濃縮，以便用AgilentSeries1100LC/MSDSI(Agilent,FosterCity,CA)進行HPLC分析。將樣品(20pL)加入150mmx4.6mmZORBAXC18(3.5顆粒)柱(AgilentTechnologies,Inc.),柱溫保持在40TC。流速是1mL/min，而採用的溶劑運行程序是0-2min:95%緩衝液A和5%緩衝液B;2-10min:從95%緩沖液A和5%緩衝液B到60%緩衝液A和40%緩衝液B的線性梯度；10-12min:從60%緩衝液A和40%緩衝液B到50%緩衝液A和50。/o緩衝液B的線性梯度12嗎18min:50。/o緩衝液A和50o/o緩衝液B，以及5418-20min:95。/。緩衝液A和5%緩衝液B。緩沖液A是95%乙猜和5%dH20;緩衝液B是100%四氫呋喃。圖2顯示分別在DC263和DC18中生產的類胡蘿蔔素的HPLC圖語。LC-MS分析確定了DC263中的主要類胡蘿蔔素的分子量是628，DC18中的主要類胡蘿蔔素的分子量是614。基於HPLC洗脫時間、吸收謙和分子量，預測DC263中的主要類胡蘿蔔素是四羥基-P，P'-胡蘿蔔素-4，4'-二嗣，預測DC18中的主要類胡蘿蔔素是四羥基-P，P，-胡蘿蔔素-4-酮。確定了DC263和DC18中的主要類胡蘿蔔素的性質，與文獻中對這些類胡蘿蔔素才艮道的性質一致(Yokoyamaetal.，Biosci.Biotech.Biochem.，60:200-203(1996);Kleinigetal，HelveticaChimicaActa,60:254-258(1977))。實施例2構建p-胡蘿蔔素合成質粒在此應用中採用兩種P-胡蘿蔔素合成質粒。質粒pDCQ329用作篩選小的插入片段文庫的報導質粒，以克隆羥化酶基因。該質粒含有分離自類胡蘿蔔素生產菌林DC260(US10/8089")的c"五AT/JS基因簇。從腸桿菌菌林DC260分離類胡蘿蔔素基因簇和構建質粒pDCQ329以前描述於US10/808979;在此引入作為參考。用質粒pDCQ330證實新基因的類胡蘿蔔素羥化酶活性。該質粒其含有分離自成團泛菌DC404的基因簇。從成團泛菌菌抹DC404分離類胡蘿蔔素基因簇和構建質粒pDCQ330以前描述於US10/808807;在此引入作為參考。DC260和DC404是從Wilmington,Delaware的環境中分離的類胡蘿蔔素生產菌抹。從住宅房屋朝西的牆上的一塊磚的表面分離了腸桿菌菌株DC260。從住宅的菜園中的土壤分離了成團泛菌菌林DC404。洗滌樣品，將10pL滿環的重懸液劃線到Luria-Broth(LB)板上，將板在30TC下溫育。挑選具有不同菌落外觀的有顏色的細菌，並且劃線兩次到在LB板上均勻，在30TC下溫育。從這些菌落中，分離了形成淺黃色光滑透明菌落的DC260和DC404。從DC260和DC404構建粘粒文庫，以便按照製造商的說明用Epicentre(Madison,WI)的pWEB粘粒克隆試劑盒克隆P-胡蘿蔔素合成基因。經過注射器針頭剪切基因組DNA。使剪切的DNA末端修復，通過與40kB標準物比較，在低熔點瓊脂糖凝膠上進行大小選擇。純化大小為大約40kB的DNA片段，連接到平端化的chming-readypWEB粘連栽體中，用超高效MaxPlaxTMLambdaPackagingExtracts(EpicentreTechnologies,Madison,WI)對文庫進行包裝，鋪到EPIlOO大腸桿菌細胞上.從每個粘粒文庫鑑定了兩個黃色菌落，在此稱作p\VEB-260(含有c"五AT/fiZ基因蔟；SEQIDNO:6)和pWEB-404。對兩個粘粒上的類胡蘿蔔素基因簇進行測序，並且亞克隆到pBHRl栽體(MoBiTec，Goettingen，Germany)上，用引物pWEB260F:5'國GAATTCACCAACCATGGATAGCCATTATGAC-3，(SEQIDNO:7)和pWEB260R:5'-GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA-3'(SEQIDNO:8)從pWEB-260擴增含有cr必AT/醜基因的片段。用引物pWEB404F:5-GAATTCACTAGTCGAGACGCCGGGTACCAACCAT-3'(SEQIDNO:9)和pWEB404R:5國GAATTCTAGCGCGGGCGCTGCCAGA-3'(SEQIDNO:IO)從pWEB-404擴增含有c"JS7rf,T/5基因(SEQIDNO:ll)的片段.用P/wTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)進行PCR，採用以下熱循環儀條件92"C(5min);94TC(1min)，60TC(1min)，72TC(9min)進行25個循環;和721C(10min)。將Taq聚合酶(PerkinEl邁er)用於10分鐘的72K反應，以將額外的3，腺苷核苷酸加入片段，以便TOPO⑧克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Caiisbad，CA)中。轉化到大腸桿菌TOP10細胞後，一些菌落表現出黃色，表明它們生產類胡蘿蔔素化合物。然後將基因簇亞克隆到寬宿主範圍的栽體pBHRl中，並且電穿孔到大腸桿菌10G細胞(Lucigen，Middletown，WI)中'在含有50pg/mL卡那黴素的LB培養基上選擇含有各個得到的質粒，即pDCQ329或pDCQ330的轉化體。通過限制酶消化證實這些轉化體，並且顯示出生產P-胡蘿蔔素。實施例3從泡囊短波單胞菌DC263和SphingomonasmelonisDC18分離類胡蘿蔔素酮酶基因本實施例描述了從細菌菌株泡嚢短波單胞菌DC263和SphingomonasmelonisDC18構建小插入片段文庫，並且從每種菌林克隆酮醉基因(參見US11/015433)。文庫構建和篩選按照實施例1的描述生長DC263和DC18的細胞.利用Qiagen基因組DNA製備試劑盒從細胞製備基因組DNA.通過隨機剪切方法製備菌林DC263和DC18的小插入片段文庫.經過291/2G胰烏素注射器(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)約300次，以剪切DC263和DC18的基因組DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠上分離.從凝膠上切下4-6kb的級分，用QiagenMinEluteTMGel-Extraction試劑盒(Qiagen)提取'用LucigenDNATerminator⑧修複試劑盒修復提取的DNA的末端。用pEZSeqTMBlunt克隆試刑盒(Lucigen)將修復的DNA插入片段連接到pEZseqTM栽體中。將連接混合物電穿孔到新製備的大腸桿菌IOG感受態細胞，該細胞含有P-胡蘿蔔素生產質粒pDCQ329(US10/808979)。將轉化體鋪板到含有100jLig/mL氨節青黴素和50Mg/mL卡那黴素的LB板上。從每個文庫獲得大約50，000-IOO，OOO個轉化體。從每個文庫的數萬個黃色菌落中鑑定一些橙色菌落。這些陽性克隆鑑定為可能含有將P-胡蘿蔔素轉化為嗣基類胡蘿蔔素的鑭酶基因.類胡蘿蔔素酮酶基因的分離通過選擇氨節青審素抗性和卡那黴素敏感克隆，從P-胡蘿蔔素報導質粒分離基於pEZ的質粒.通過用EZ-TN〈TET-l〉試劑盒(Epicentre，Madison,WI)和/或引物步移進行隨機轉座子插入，對基於pEZ的質粒上的插入片段進行測序。用SequencherTM程序(GenecodesCorp"AnnArbor,MI)組裝序列。通過進行BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul，S.F.，etal"J.Mol.Biol.215:403-410(1993))鑑定編碼CrtW酮酶的基因，所述BLAST可檢索與BLAST"nr"資料庫(包含所有非冗餘的GenBankCDS翻譯，來源於三維結構BrookhavenProteinDataBank，SWISS-PROT蛋白序列資料庫，EMBL和DDBJ資料庫的序列)中含有的序列的相似性，來自泡囊短波單胞菌DC263和SphingomonasmelonisDC18的crtW基因的編碼序列分別列為SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。57實施例4類胡蘿蔔素羥化酶基因的分離本實施例描速了從兩個細菌菌林，即泡囊短波單胞菌DC263和No雨phingobiumaro邁aticivoransATCCNo.700278(以前命名為Sphingomonasaromaticivorans)分離類胡蘿蔔素鞋化酶基因。從泡囊短波單胞菌DC263分離類胡蘿蔔素羥化醃基因對含有來自DC263的crt^T基因(SEQIDNO:12)的基於pEZ的質粒進行測序，在基於pEZ的質粒的3kb插入片段上沒有鑑定出類胡蘿蔔素鞋化酶基因.為了對側翼區的更多區域進行測序，按照上文對DC263的描述，按照製造商的說明，用來自Epicentre(Madison,WI)的pWEB粘粒克隆試劑盒構建了粘粒文庫。在微量滴定板中的lOO^L含有IOOMg/mL氨苄青黴素的LB中生長大約600個粘粒克隆，30"下700rpm振蕩下將板溫育24小時。採用圍繞基於pEZ的質粒的c"『區設計的引物pEZ263-F:5，-GTTCGAACTGGGGAAAACGGAC-3'(SEQIDNO:14)和pEZ263-R:5'CAAAGGCGTGAACCGAAATCCG-3'(SEQIDNO:15)，通過PCR篩選粘粒文庫。分離含有延伸通過cW『區的大約40kb插入片段的陽性粘粒克隆F3-4。製備粘粒DNA，採用EZ-TN〈TET-l〉試劑盒(Epicentre，Madison，WI)和/或引物步移，通過隨機轉座子插入進行測序。用SequencherTM程序v4.05(GeneCodesCorp"AnnArbor，MI)組裝序列。通過進行BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul，S.F"etal.，J.Mol.Biol.215:403-410(1993))鑑定編碼crtZ羥化酶基因的序列(SEQIDNOs:16)，所述BLAST可檢索與BLAST"nr"資料庫(包含所有非冗餘的GenBankCDS翻譯，來源於三維結構BrookhavenProteinDataBank，SWISS-PROT蛋白序列資料庫，EMBL和DDBJ資料庫的序列)中含有的序列的相似性。用國家生物技術信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法分析序列與"nr"資料庫中含有的所有公共可獲得的DNA序列的相似性。在所有讀框中翻譯DNA序列，並且用NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.andStates,D,J.，NatureGenetics,3:266-272(1993))比較與nr"資料庫中含有的所有公共可獲得的蛋白序列的相似性。BLAST分析鑑定了與p-胡蘿蔔素具有同源性的ORF。最高命中是與來自產鹼菌種的P-胡蘿蔔素羥化酶(GenBank⑧編號Q44262)具有51%的胺基酸同一性。表3顯示了基於BLASTXnr算法的數據，其中具有以預期值報導的值，也分離了SphingomonasmelonisDC18的含有crtW的粘粒，並且按照上文對泡囊短波單胞菌DC263的描述相似地測序.但是，在含有SphingomonasmelonisDC18cW^的粘粒中沒有發現DC18的cWZ羥化酶基因。從NovosphingobiumaromaticivoransATCC700278分離類胡蘿蔔素幾化酶基因為了鑑定更多的類胡蘿蔔素羥化酶基因，檢索了NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的部分基因組序列資料庫。將來自Agrobacteriumaurantiacum(SEQIDNO:18)的P-胡蘿蔔素羥化酶(CrtZ)用於對Novosphingobiumaromaticivorans的基因組資料庫進行BLAST檢索。鑑定出來自Novosphingohiumaromaticivorans的假定蛋白(GenBank⑧蛋白編號No.ZP—00094836.1;SEQIDNOs.19和20)表現出與土壤桿菌CrtZ的52%胺基酸同一性。然後將該假定蛋白用於對nr資料庫進行BLAST檢索。最高命中是與Pantoeaagglomeranspv.Milletiae的CrtZ具有57%同一性。BLAST分析的大量其它"命中"是與來自其它生物的P-胡蘿蔔素羥化蘇的同一性。分析了來自Novosphingobiumaromaticivorans的假定蛋白的p-胡蘿蔔素羥化酶活性。也採用VectorNTI中的多序列比對算法將此處鑑定的兩種CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶的核苷酸和胺基酸序列與一些已知的類胡蘿蔔素羥化酶基因進行的比較。表4顯示了逐對比較的核苷酸序列同一性和胺基酸序列同一性的百分比。分離的兩種cWZ基因僅僅與已知cWZ基因具有低到中度同源性，並且彼此是非常趨異的。表3從不同細菌物種分離的類胡蘿蔔素鞋化酶基因的最高BLAST命中tableseeoriginaldocumentpage60tableseeoriginaldocumentpage61實施例5證實類胡蘿蔔素羥化酶功能本實施例描述了新的類胡蘿蔔素羥化酶基因在生產p-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌林中的表達，通過將P-胡蘿蔔素轉化為玉米黃素，證明了每種羥化酶基因的功能。用於該研究中的生產P"胡蘿蔔素的菌林是含有質粒pDCQ330的大腸桿菌菌林.通過PCR擴增來自崎細菌菌株的推定的羥>^|基因.用引物crtZ^DC263一F:5，曙ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGTCCrGGCCGACGATGATC'(SEQIDNO:21)和crtZrDC263一R:5'-TAGATCAGGCGCCGTTGCTGGATGA-3'(SEQEDNO:22)^增來自泡嚢短波單胞菌DC263的otZ.用引物41ZSPH—F:5^ACTAGTICrAGATAAGGAGGAATAAACCATGCAGACGCITGCCGCG"3，(SEQIDNO:23沐SPH一ZR:5*-GCTAGCOCTAGGITAGCOGTOCACTGCCTC(SEQIDNO:24)擴增來自ATCC700278的cWZ。將PCR產物克隆到pTrcHis2-TOPO⑧(Invitrogen)栽體中，篩選含有正向插入物的克隆。這得到了表達來自DC2的cWZ基因的pDCQ370TA和表達來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的c/tZ基因的pTrcHis2-ZS(Sphingo)。將這些構建體轉化到含有pDCQ330的積累卩-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌林中。按照實施例l的描述，通過HPLC(圖3)分析轉化體中的類胡蘿蔔素。在5.96min洗脫的佔優勢的峰具有(456nm，480nm)的吸收謙和569的分子量m/z,這與玉米黃素合成標準物相同。玉米黃素標準物購自CaroteNature(Lupsingen，Switzerland).玉米黃素的合成明確證明了兩種新的CZ基因的羥化酶功能。實施例6生產奸青素的質粒的克隆本實施例描述了通過表達來自泡嚢短波單胞菌DC263或NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo,700278的CZ基因，以及cW『基因和p-胡蘿蔔素合成基因簇而構建生產壞青素的質粒。克隆含有來自泡囊短波單胞菌DC263的crtZ的生產奸青素的質粒首先，通過除去CTLV基因，從pDCQ329構建p-胡蘿蔔素合成基因簇CT化J7醜。為了促進克隆，也除去了"J基因末端的五co及/位點。用引物crt-260—F:5'"GAATTCACTAGTACCAACCATGGATAGCCATTATG"3'(SEQIDNO:25)和crt-260SOE一R:5'-ATCAGGTCGCCTCCGCCAGCACGACTTTCAGTTGAATATCGCTAGCrGTTG"3'(SEQIDNO:26)擴增otE基因。用引物crt-260SOE_F:5'-CAACAGCTAGCGATATTCAACTGAAAGTCGTGCTGGCGGAGGCGACCTGAT-3'(SEQIDNO:27)和crt-260RI一R:5-CATTmTdTCCCTGGTTCGACAGAGTTCAACAGCGCGCGCAGCGCTT-3'(SEQIDNO:28)擴增c/tF基因。用糾性AAC密碼子代替Ew及I位點中的AAT密碼子，以除去五coRI位點.採用引物crt-260一F和crt-260RI一R，通過SOEingPCR將crtEY基因連接在一起。用引物crt-260RI_F:5'-AAGCGCTGCGCGCGCTGTTGAACTCTGTCGAACCAGGGAAGAAAAAATW(SEQIDNO:29)和crt-260一R:5'-GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA-3'(SEQIDNO:30)擴增crT歷片段。採用引物crt-260—F和crt-260_R，通過另一次SOEingPCR將基因連接在一起。將含有CT&F/B基因的4.5kbEc^及I片段克隆到pBHRl的五o及I位點，得到pDCQ340。證明了含有pDCQ340的大腸桿菌生產P-胡蘿蔔素。然後，將來自DC263的cW『和c,"基因克隆到pDCQ340上的otEMB簇的上遊。用引物crtW-263_F:5'-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGCGGCAAGCGAACAGGATW(SEQIDNO:31)和crtW-263一R:5'-TCTAGACTAGCTGAACAAACTCCACCAW(SEQIDNO:32)擴增來自DC263的crTW。用引物crtZr263—F2:5'-TCTAGAAAGGAGGAATAAACCATGTCCTGGCCGACGATGATC-5'(SEQIDNO:33)和crt2^263—R2:5'-ACTAGTCAGGCGCCGTTGCTGGATGA-3，(SEQIDNO:34)4T增來自DC263的cWZ。將PCR產物克隆到pTrcHis2-TOPO⑧栽體中，分別得到pDCQ342TA和pDCQ352。將含有c"W的來自pDCQ342TA的0.8kbSpeKY6"I片段克隆到pDCQ340的化el位點中。得到的pDCQ342含有基因簇上遊的然後將含有ctYZ的來自pDCQ352的0.5kbAT^I-5^1片段克隆到pDCQ342上的c"『上遊的^el位點。這得到了生產蝦青素的質粒pDCQ344，其含有從pBHRl栽體上的氯黴素抗性基因啟動子(屍oiO表達的c/YZ附J7B基因簇。克隆含有來自NovosphinpobiumaromaticivoransATCCNo.700278的crtZ的生產奸青素的質粒來自Novosphingobiumaromaticivorans的與來自SphingomonasmelonisDC18的cW^F在內源性甲基單胞菌啟動子戶Aps7(US10/689200;在此引入作為參考)控制下共表達。用上遊引物5'-CCATGGGCTAGCTAAGGATTGGGGTGCGT-3'(SEQIDNO:35)和下遊引物5'-CCATGGACTAGTGTGATGTGCTCCGAAAGT-3，(SEQIDNO:36)從甲基單胞菌種16a基因組DNA擴增屍A/w7啟動子.將含有屍/i/)s/的288bpTVcoI片段克隆到pBHRl的TVcoI位點，得到pDCQ363.用來自pTrcHis2-ZS(Sphingo)的5^1和AT^I消化來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的cWZ，克隆到pDCQ363的分el位點中，得到pDCQ364。用引物crt\V_sphingo_F5'-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGACCGTC03'(SEQIDNO:37)和crtW一sphingo一R5'-ATCTAGATTACCGGTCTTTGCTTAACGACCG"3'(SEQIDNO:38)擴增來自SphingomonasmelonisDC18的C『。將含有的^el-AT6fll片段克隆到pDCQ364的5^1和位點中。在得到的構建體pDCQ365中，來自SphingomonasmelonisDC18的c/Y『和來自NovosphingobiumaromaticivoransATCCNo.700278的c/tZ在內源性甲基單胞菌啟動子/Vi/;W的控制下作為一個轉錄單位共表達。然後將含有該mirZ轉錄單位的7V"I片段克隆到P-胡蘿蔔素合成質粒pDCQ330的iVcoI位點，得到生產奸青素的質粒pDCQ366。實施例7在大腸桿菌和甲基單胞菌中生產蝦青素本實施例描述了用於將生產蝦青素的質粒轉化到兩種不相關的微生物宿主細胞，如大腸桿菌和甲基單胞菌種16a(ATCCPTA-2402)中的方法，以基於以前報導的方法生產蝦青素(US10/997844;在此引入作為參考)。簡言之，通過三親林接合交配(US10/99"44)將質粒轉移到甲基單胞菌16a中.在含有卡那黴素(50pg/mL)的LB培養基中使含有pRK2013(ATCCNo.37159)的大腸桿菌輔助菌林和含有質粒pDCQ344或pDCQ366的大腸桿菌10G或DH10B供體菌林生長過夜，在LB中洗滌三次，重懸於代表最初培養體積的大約60倍濃度的體積的LB中。甲基單胞菌種16aMWM1200菌林含有c/ti>7Wcrt7V2基因簇的雙交換敲除，其破壞天然C卯類胡蘿蔔素的合成(US10/997844).採用USO9/941947中描述的通用條件，使MWM1200菌林作為受體生長.簡言之，301C下持續振蕩下在血清塞Wheaton瓶(WheatonScientific,WheatonIL)中使甲基單胞菌種16aMWM1200菌抹生長，其中採用至少8:1的氣/液比(即160mL總體積中的20mL確酸鹽液體"BTZ-3"培養基)。甲基單胞菌16A的硝酸鹽培養基硝酸鹽液體培養基，在此也稱作"確定的培養基"或"BTZ-3"培養基，包含多種與下文所示溶液l混合的鹽(表5和6)，或其中指出硝酸鹽被15mM氯化銨代替。溶液1提供了痕量礦物質的100倍濃縮的儲液的組成。表5溶液"tableseeoriginaldocumentpage65*將上述克數在900mLH20中混合，調節到pH-7，添加H20到終體積1L。保持冷凍表6tableseeoriginaldocumentpage66**溶解於卯OmLH20中。調節到pH-7，添加H20到1L。對於瓊脂板在1L培養基中加入15g瓊脂，高壓滅菌，冷卻到50TC，混合，鋪板'用於培養的標準氣相在空氣中含有25%甲烷。在這些條件下在BTZ-3培養基中培養甲基單胞菌種WaMWM1200受體菌抹48h，在BTZ-3中洗滌3次，重懸於代表最初培養體積的150倍濃度的體積的BTZ-3中。以1:1:2的比例在含有0.5%(w/v)酵母提取物的BTZ-3瓊脂板表面混合供體細胞、輔助細胞和受體細胞糊。301C下將瓊脂板在25%甲烷中維持16-72小時，以發生接合，此後收集細胞糊，重懸於BTZ-3中。將稀釋液鋪板在含有卡那黴素(50yg/mL)的BTZ-3瓊脂上，301C下在25%甲烷中溫育最多1周。將橙色-紅色轉接合子劃線到含有卡那黴素(50Mg/mL)的BTZ-3瓊脂上。為了分析類胡蘿蔔素組成，在24孔板(Qiagen)上培養甲基單胞菌轉接合子，每孔含有lmL含有卡那霧素(50pg/mL)的BTZ-3'用Airpore膜(Qiagen)覆蓋板，在添加25%甲烷作為唯一碳源的AnaeroPack系統(MitsubishiGasChemicalCo"Inc.，Japan)上溫育。30TC下以250rpm將AnaeroPackTM振蕩2-3天。30TC下250rpm振蕩條件下將含有蝦青素質粒的大腸桿菌細胞在25ml含有卡那黴素(50Mg/mL)的LB中生長2-3天。通過離心收穫細胞，提取沉澱，如實施例1所述通過HPLC分析類胡蘿蔔素含量，來自含有pDCQ344的大腸桿菌IOG或甲基單胞菌16aMWM1200的提取物的HPLC分析如圖4所示.蝦青素佔含有pDCQ344的大腸桿菌或甲基單胞菌生產的總類胡蘿蔔素的大約80%.在5.2-5.3min洗脫的蝦青素峰在480nm具有最大吸收，並且具有597的分子量m/z，這與蝦青素的合成標準物相同。在5,8-5.9min洗脫的最小峰在464iun具有最大吸收，並且具有的分子量m/z，這與adonixanthin的合成標準物相同。壞青素和adonixanthin標準物購自CaroteNature(Lupsingen,Switzerland).來自含有pDCQ366的大腸桿菌DH10B或甲基單胞菌16aMWM1200的HPLC分析如圖5所示。從大腸桿菌和甲基單胞菌生產了蝦青素，作為在該程序中4.4-4.6min時洗脫的佔優勢的類胡蘿蔔素。除了一些小峰，在11.2min洗脫的峰佔甲基單胞菌中總類胡蘿蔔素的10%,該峰在448nm、474nm、504nm具有最大吸收，並且具有536的分子量m/z，這與血清素生物合成的中間體番茄紅素符合。權利要求1.編碼類胡蘿蔔素羥化酶的分離的核酸分子，其選自(a)編碼SEQIDNO17所示胺基酸的分離的核酸分子；(b)包含第一核苷酸序列的分離的核酸分子，所述第一核苷酸序列編碼與包含SEQIDNO17所示胺基酸的多肽具有至少95％同一性的類胡蘿蔔素羥化酶；(c)在以下雜交條件下與(a)雜交的分離的核酸分子0.1XSSC，0.1％SDS，65℃和用2XSSC，0.1％SDS洗滌，然後用0.1XSSC，0.1％SDS洗滌；和(d)與(a)、(b)或(C)互補的分離的核酸分子。2.權利要求l的分離的核酸分子，如SEQIDNO:16所示。3.由權利要求l的分離的核酸分子編碼的多肽。4.嵌合遺傳構建體，包含與合適的調節序列可操作性連接的權利要求1或2的分離的核酸分子。5.轉化的宿主細胞，包含權利要求4的嵌合遺傳構建體。6.權利要求5的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自細菌、酵母、絲狀真菌、藻類和綠色植物.7.權利要求6的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自麴黴屬、木黴屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、發酵單胞菌屬、土壤桿菌屬、赤桿菌屬、綠菌屬、著色菌屬、黃桿菌屬、噬纖維菌屬、紅細菌屬、紅球菌屬、鏈黴菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、異常球菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基微菌屬、曱基孢囊菌屬、產鹼菌屬、集胞藍細菌屬、聚球藍細菌屬、魚腥藍細菌屬、硫桿菌屬、甲烷桿菌屬、克氏桿菌屬和粘球菌屬，8.權利要求6的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自大豆、油菜籽、胡椒、向曰葵、棉花、玉米、菸草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高梁、稻、擬南芥、十字花科植物、甜瓜、胡蘿蔔、芹菜、歐芹、番茄、馬鈴薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆科植物、豌豆、黑麥、亞麻、闊葉樹、針葉樹和飼料草。9.獲得編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子的方法，該方法包括(a)合成至少一種相應於SEQIDNO:16所示序列的一部分的寡核苷酸引物；和(b)用步驟(a)的寡核苷酸引物擴增存在於克隆栽體中的插入片段；其中擴增的插入片段編碼類胡蘿蔔素羥化酶，10.生產羥化類胡蘿蔔素化合物的方法，該方法包括(a)提供生產具有至少一個P-芷香酮型環的環狀類胡蘿蔔素的宿主細胞；(b)用編碼類胡蘿蔔素輕化酶的核酸分子轉化(a)的宿主細胞，所述核酸分子選自(i)權利要求l或2的核酸分子；和(ii)編碼SEQIDNO:20所示胺基酸序列的核酸分子；和(c)在合適的條件下使(b)的轉化的宿主細胞生長，從而生產羥化類胡蘿蔔素。11.權利要求10的方法，其中所述羥化類胡蘿蔔素選自蝦青素、玉米黃素、P-隱黃素、3-羥基海膽酮、3'-羥基海膽fi^、adonirubin、adonixanthin、四羥基-P，P'-胡蘿蔔素-4，4'-二嗣、四鞋基-J3，P，-胡蘿蔔素曙4-酮、眉藻黃素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黃素、3曙羥基陽胡蘿蔔素、3-羥基-4-酮基個胡蘿蔔素、細菌玉紅黃素、bacteriorubixanthinal和黃體素。12.權利要求10的方法，其中所述環狀類胡蘿蔔素選自P-胡蘿蔔素、角黃素、P-隱黃素、3-羥基海膽酮、3'-羥基海膽嗣、海膽嗣、adonirubin、y-胡蘿蔔素、4-酮基-y-胡蘿蔔素、脫氧-屈曲黃素和a-胡蘿蔔素。13.權利要求10的方法，其中所述轉化的宿主細胞選自細菌、酵母、絲狀真菌、藻類和綠色植物。14.權利要求13的方法，其中所述轉化的宿主細胞選自曲審屬、木審屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、發酵單胞菌屬、土壤桿菌屬、赤桿菌屬、綠菌屬、著色菌屬、黃桿菌屬、噬纖維菌屬、紅細菌屬、紅球菌屬、鏈審菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、異常球菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、曱基微菌屬、甲基孢囊菌屬、產鹼菌屬、集胞藍細菌屬、聚球藍細菌屬、魚腥藍細菌屬、硫桿菌屬、甲烷桿菌屬、克氏桿菌屬和粘球菌屬.15.權利要求13的方法，其中所述轉化的宿主細胞選自大豆、油菜籽、胡椒、向日葵、棉花、玉米、菸草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高梁、稻、擬南芥、十字花科植物、甜瓜、胡蘿蔔、芹菜、歐芹、番茄、馬鈴薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆科植物、豌豆、黑麥、亞麻、闊葉樹、針葉樹和飼料草.16.權利要求13的方法，其中所述轉化的宿主細胞是曱基營養生物。17.權利要求16的方法，其中所述甲基營養生物是甲烷營養生物.18.權利要求17的方法，其中所述甲烷營養生物是曱基單胞菌16a(ATCCPTA2402)'19.調節生物中環狀的鞋化類胡蘿蔔素生物合成的方法，該方法包括(a)提供包含類胡蘿蔔素生物合成途徑的宿主細胞，所述宿主細胞生產具有至少一個P-芷香嗣型環的環狀類胡蘿蔔素；(b)用編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子轉化(a)的宿主細胞，所述核酸分子選自(i)權利要求1或2的核酸分子；和(ii)編碼SEQIDNO:20所示胺基酸序列的核酸分子；和(c)使(b)的轉化的宿主細胞在使羥化類胡蘿蔔素生物合成受到調節的條件下生長。20.權利要求19的方法，其中編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子被上調。21.權利要求20的方法，其中編碼類胡蘿蔔素鞋化酶的核酸分子在多拷貝質粒中超量表達。22.權利要求21的方法，其中編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子與誘導型或受調節的啟動子可操作性連接。23.權利要求19的方法，其中編碼類胡蘿蔔素輕化酶的核酸分子被下調。24.權利要求19的方法，其中編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子以反義方向表達。25.權利要求19的方法，其中通過將外源DNA插入編碼區而破壞編碼類胡蘿蔔素羥化酶的核酸分子。全文摘要提供了從泡囊短波單胞菌DC263分離的用於生產羥化類胡蘿蔔素的新CrtZ類胡蘿蔔素羥化酶。此外，發現以前從Novosphingobiumaromaticivorans鑑定的一種假定蛋白具有類胡蘿蔔素羥化酶活性。兩種羥化酶基因都表現出與以前報導的其它CrtZ羥化酶的低同源性。羥化酶在異源宿主細胞中的表達使得能夠生產羥化類胡蘿蔔素。文檔編號C12N9/02GK101432436SQ200580027567公開日2009年5月13日申請日期2005年8月16日優先權日2004年8月16日發明者L·陶,N·塞德科瓦,Q·程申請人:納幕爾杜邦公司