一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒的製作方法

2023-05-13 12:54:06

專利名稱：一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)所致的一種傳染性疾病。據世界衛生組織(WHO)提供的數據，2002年世界結核病的形勢為感染人數約30億，新髮結核病例880萬。其中，新塗陽結核病例390萬，發病率比2001年增長I. 1%，新發病例中耐多藥比例為3. 2%，結核病的死亡人數達180萬。回顧性調查結果表明，中國MTB的總耐藥率為27. 8%，初始耐藥率和獲得耐藥率分別為18. 6%和46. 5%，耐多藥率為10.7%，其中初始和獲得性耐多藥率分別為7. 6%和17. 1%。由於耐藥結核桿菌的流行，使結核病成為由單一微生物導致死亡的主要原因，佔世界人口數的1%，佔可預防死亡數的26%。隨著分子生物學理論和技術的發展，MTB的耐藥機制及耐藥的分子基礎逐步被闡明，建立了快速檢測MTB耐藥基因的方法，為MTB快速藥物敏感性試驗開闢了一條新的途徑。研究表明MTB產生耐藥性機制包括藥物失活酶、胞壁通透性改變、靶結構基因突變和代謝途徑改變等，而主要機制是菌內藥物作用靶基因的突變所致。利福平和異煙肼是治療結核最主要的一線藥物，通過各種分子生物學工具對這兩種藥物的耐藥性的遺傳基礎進行了深入研究，結果顯示，在正常情況下，利福平(RFP)與RNA聚合酶B亞基(rpoB)特異性結合，通過阻斷RNA的合成而起到抑制細菌生長的作用，rpoB基因在利福平的藥物選擇壓力下發生突變而改變所編碼的rpoB亞基構象，從而降低與利福平的親和力。rpoB基因突變一般發生在該基因內一個高度保守的81bp區域內(507-533位27個胺基酸密碼子)。其中最常見的密碼子突變點為531位絲氨酸(Ser)—亮氨酸(Leu) (53ITCG — TTG)，526位組氨酸(His)—酪氨酸(Tyr) (526CAC — GAC)，此外，常見的點突變還有511CTG — CCG，533CTG — CCG (Taniguchi H. Molecularmechanisms of multidrug resistance inMycobacterium tuberculosis[J]. J Uoch,2000,22 (3) :269-282)。異煙肼耐藥性的分子基礎比較複雜，已發現幾個涉及異煙肼體內代謝過程中活性中間體形成有關的基因，其中與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG和/或烯醯基還原酶編碼基因inbA等基因突變有關。這兩種酶都直接或間接的參與異煙肼中間體的形成。katG基因常見的密碼子突變點為第315發生突變(315AGC — ACC、315AGC — AAC, Herrara L, Valverde A, Saiz P, et al. Molecular characterizationofisoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis clinical strains isolatedinthe Philippines [J]. Int J Antimicrob Agents, 2004, 23 (6) 572-576.)它的發生頻率約為67.2%。inhA基因的耐異煙肼突變主要發生在其啟動子區的-15T位脫氧核糖核苷酸QnhA基因在其啟動子區的-15C突變為T，Basso LA，Zhang R，Musser JM, etal. Mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis enzymaticcharacterization of enoyl reductase mutants identified inisoniazid-resistantclinical isolates [J]. J Infect Dis, 1998,178 (3) :769-775.)上。結核分枝桿菌的臨床檢測一直以來主要依靠藥物敏感試驗，但傳統的在固體培養基上進行的藥物敏感試驗周期長。敏感性低，嚴重影響了患者的早期診斷和治療。生物學方法為耐藥結核病的快速檢測打開了廣闊的前景。在許多的核酸擴增方法中，PCR方法被最廣泛地應用於臨床結核的檢測目前常用的結核桿菌基因突變檢測方法如下(I) DNA測序法(DNA sequencing)對耐藥基因片段的PCR產物進行直接測序，然後與標準敏感菌株的同一 DNA片段比較，分析鹼基突變的位置與分布，但是此方法比較繁瑣，且所需設備多集中在一些大的測序公司，難於普及。(2) PCR-SSCP法PCR-SSCP，即聚合酶鏈反應一單鏈構象多態性(polymerasechainreact ion-single stranded conforma-tional polymorphism, PCR-SSCP),但是此方法檢測單鹼基的變化的DNA片段長度應小於200bp，且從小片段中不能得到較完整的耐藥信息，且隨DNA長度的增加靈敏度下降。(3)限制性片段長度多態性分析(restriction fragmant length polymorphism,RFLP) RFLP分析是限制性內切酶、核酸電泳、印跡技術、探針雜交技術的綜合應用。此法特異性高，但是只能分析已知序列特定位點的基因突變。(4)多列探針檢測法(line probe assay, LiPA) LiPA成本昂貴,較難普及。(5)基因晶片技術雖已取得很大進展，但仍存在缺陷，比如在合成探針時可能會有錯誤的核苷酸混入。另外，其操作過程複雜，所需材料昂貴，都阻礙了該項技術的推廣。因此，建立一種簡單快速的突變檢測方法對與早期診斷結核病和防治結核病的傳播具有重要意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種鑑定結核桿菌耐藥性的專用引物。本發明提供的專用引物，其由一個以上引物組組成，每個所述引物組針對一種耐藥基因，所述每個引物組擴增的靶序列為包括突變位點在內的所有等位基因片段；每個所述引物組包括用於擴增所述靶序列的特異性引物和一條共用引物。所述耐藥基因為耐利福平基因和/或耐異煙肼基因；所述特異性引物的3』末端鹼基與所述等位基因片段的突變位點的鹼基相同或互補。所述專用引物由如下3個引物組組成用於擴增耐利福平基因的引物組由4條用於擴增GenBank Accession Number為 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、531TCG — TTG、533CTG — CCG突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物和I條共用引物I組成；所述4 條用於擴增 GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、53ITCG — TTG.533CTG — CCG 突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列分別為序列表中序列5、4、3和2 ；所述共用引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ;
用於擴增耐異煙肼基因的引物組A由I條用於擴增GenBank Accession Number為NC_000962第1674202-1675011位核苷酸的inhA基因的inhA_15T突變位點對應的等位基因片段的特異性引物和I條共用引物2組成； 所述用於擴增GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸的inhA基因的inhA-15T突變位點對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列為序列表中序列7 ；所述共用引物2的核苷酸序列為序列表中序列6 ；用於擴增耐異煙肼基因的引物組B由2條用於擴增GenBank Accession Number為 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的 katG 基因的 315AGC — AAC、315AGC — ACC突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物和共用引物3組成；所述用於擴增GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的katG基因的315AGC — AAC、315AGC — ACC突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列分別為序列表中序列9和序列10 ；所述共用引物3的核苷酸序列為序列表中序列8。「511CTG — CCG、526CAC — GAC,53ITCG — TTG、533CTG — CCG」中的 511、526、531、533為突變的胺基酸的位置(密碼子的位置)，「一」表示突變，「一前面的鹼基」為未突變的胺基酸的密碼子，「一後面的鹼基」為突變的胺基酸的密碼子。「315AGC — ACC、315AGC — AAC」中的315位為突變的胺基酸的位置(密碼子的位
置)，「一」表示突變，「一前面的鹼基」為未突變的胺基酸的密碼子，「一後面的鹼基」為突變的胺基酸的密碼子。inhA_15T中的-15T位表示將inhA基因在其啟動子區的-15的核苷酸C突變為核苷酸T。本發明的第二個目的是提供一種檢測結核桿菌的耐藥性的試劑。本發明提供的試劑，由所述的專用引物和專用探針組成；所述專用探針的數目與所述引物組的數目相同，一種所述專用探針與所述專用引物中的一個引物組擴增的靶序列特異結合。所述耐藥性為耐利福平和/或耐異煙肼；所述專用探針均為螢光標記探針,所述螢光標記探針的標記物具體為螢光素；所述螢光標記探針的標記物具體為螢光素；所述螢光素具體為6-羧基螢光素(FAM)或六氯螢光素(HEX)；所述專用探針由如下3種組成專用探針I為與所述用於擴增耐利福平基因的引物組擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針I的5』末端標記FAM，所述專用探針I的核苷酸序列為序列表中的序列
11;專用探針2為與所述用於擴增耐異煙肼基因的引物組A擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針2的5』末端標記HEX，所述專用探針2的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；專用探針3為與所述用於擴增耐異煙肼基因的引物組B擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針3的5』末端標記HEX，所述專用探針3的核苷酸序列為序列表中的序列13。
本發明的第三個目的是提供一種檢測結核桿菌的耐藥性的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由所述的試劑、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR緩衝液組成；所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 2 ii M ;所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為200 ii M ;所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中的濃度為0. 075U/ U L ；所述Mg2+在所述的PCR試劑中的濃度為200 U M。含有所述的試劑或所述的PCR試劑的試劑盒也是本發明保護的範圍。所述的專用引物或所述的PCR試劑或所述試劑盒在檢測結核桿菌的耐藥性中的應用也是本發明保護的範圍；所述耐藥性為耐利福平和/或異煙肼。本發明第三個目的是提供一種輔助檢測待測樣品中結核桿菌的耐藥性的方法。本發明提供的方法包括如下步驟用所述的專用引物或所述的試劑或所述的PCR試劑或所述試劑盒對待測樣品進行實時螢光雙重TaqmanPCR擴增，若螢光PCR儀FAM通道有擴增螢光，則所述待測樣品耐利福平，若螢光PCR儀HEX通道有擴增螢光，則所述待測樣品耐異煙肼。實時螢光雙重TaqmanPCR技術是分別針對不同的結核耐藥基因的特異性序列設計探針，並按基因耐藥種類(利福平/異煙肼)的不同標記不同的螢光，通過檢測不同通道的螢光信號，來進行結核耐藥基因的區分檢測。這種技術與傳統實時螢光PCR技術不同，通常使用的實時螢光PCR技術是一個PCR反應體系中只使用一種螢光標記的探針，結果只能通過螢光信號的變化判斷某一 PCR產物的擴增。如果某些基因座位有多個等位基因(如HLA-DRB位點或地中海貧血突變基因等)，用這種螢光法檢測就很繁雜，甚至很難完成。而雙重Taqman螢光PCR技術則是針對各等位基因設計序列特異性引物，並在目標序列上遊引物和下遊引物之間設計序列特異性探針，所述PCR擴增中，以待測樣品的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為62°C ；所述待測樣品為含有結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的痰液。本發明的實驗證明，本發明提供的專用的引物和專用的探針，可以通過高效靈敏的雙重Taqman實時突光PCR技術和序列特異性引物擴增技術(Sequence specificprimer,SSP)相結合，在較短時間內檢測待測樣品中結核桿菌的耐藥性。還提供了檢測臨床生物樣品中結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒，臨床生物樣品可以為臨床痰液、支氣管灌洗液、血液、腹水、腦脊液等。檢者痰液、血液、支氣管灌洗液、腹水以及腦脊液中結核分枝桿菌基因組DNA。本發明還利用了雙重Taqman實時螢光PCR技術，按基因耐藥種類(利福平/異煙肼)的不同標記不同的螢光，通過檢測不同通道的螢光信號，來進行結核耐藥基因的區分檢測。這樣大大提高了檢測的靈敏度和擴增效率，使用本發明的方法和試劑盒，從樣本的處理到判讀基因型檢測結果僅需3小時左右的時間。因此，本發明的方法和試劑盒特別適用於臨床標本的快速檢測和大樣本的普查。


圖I為實時螢光定量PCR反應模式示意圖
圖2為各靶DNA擴增片段靈敏度實驗結果圖3為樣本檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、檢測結核分枝桿菌耐藥基因突變的引物和探針I、引物的設計和合成為了特異、高效地擴增待檢核酸樣品中的目的基因，從GenBank中調出結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)全基因組 DNA(BX842578)序列，針對rpoB (NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸)，katG (NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸)，inhA(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)基因多態性位點，按照引物設計的一般性原則，採用Primer Premier5. 0和01igo6. 0軟體分別設計併合成了實時螢光PCR所用的正向和反向引物。引物組I:rpoB_comF2 :5，AGCCGATGACCACCCAGGAC 3，(序列 I)533_R3 :5』 AGACCGCCGAGCCCCG 3』 (序列 2)531_Ri2 :5，CCGAGCCCCAGCGCCA 3』 (序列 3)526_R3 :5，CGGCAGTCGGCGCTTGTC 3，(序列 4)511_W7 :5，TTCTGGTCCATGAATAGGCTCG 3，(序列 5)引物組2:inhA_comR2 :5』 GCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCC 3』 (序列 6)inh_F12 :5，GTCACCCCGACAACCTAGCA 3，(序列 7)引物組3:katG_comRl :5，GCTCCCACTCGTAGCCGTACAGGAT 3，(序列 8)katG(315g-a)F7 :5，GTAAGGACGCGATCACGAA 3』 (序列 9)katG(315g-c)F6_2 :5，AAGGACGCGATCACGAC 3』(序列 10)2、探針的合成和標記針對rpoB, inhA, katG基因多態性位點，設計併合成了 3條探針。為了保證各探針均能在同一溫度下與特定的靶DNA成功地配對，須將探針的Tm值和GC含量嚴格控制在特定範圍內。探針的5』端標記螢光基團(FAM/HEX)，3』端標記淬滅基團(Eclipse)。PCR反應中使用的寡核苷酸探針分別是探針1:5』 AGGCGATCACACCGCAGACGTTG 3』 (序列 11，標記 FAM，針對 rpoB 基因)探針2 :5』 CCGGAAATCGCAGCCACGTT 3』 (序列 12，標記 HEX，針對 inhA 基因)探針3 :5』 CTGTTGTCCCATTTCGTCGGGGTGT 3』 (序列 I3，標記 HEX，針對 katG 基因)實施例2、實時螢光PCR的條件摸索I、模板的製備根據NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸、NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸、NC_000962第2153889-2156111位核苷酸，分別人工合成rpoB基因、inhA基因、katG基因，經過測序人工合成的rpoB基因、inhA基因、katG基因的核苷酸序列分別與NC_000962第 759807-763325 位核苷酸、NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸、NC_000962 第2153889-2156111 位核苷酸一致。將人工合成的rpoB基因、inhA基因、katG基因分別於pGEM-T EasyVector (Promega公司，目錄號A1380)連接,分別得到野生型質粒rpoB、野生型質粒inhA、野生型質粒katG。經過測序
野生型質粒rpoB為將rpoB (NC_000962第759807-763325位核苷酸)基因與pGEM-TEasy Vector連接得到的質粒。野生型質粒inhA為將inhA(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)基因與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒。野生型質粒katG為將katG(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)基因與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒。含有rpoB突變位點(533位)的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)為模板，rpoB_comF2、533_R3為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的為第533位胺基酸(密碼子)的CTG突變為CCG，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒即為突變533CTG — CCG位點突變質粒。含有rpoB突變位點(531位)的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，rp0B_C0mF2、531_R12為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的為第531位胺基酸(密碼子)的TCG突變為TTG，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM_T Easy Vector連接得到的質粒即為突變531TCG — TTG位點突變質粒。含有rpoB突變位點(526位)的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，rp0B_C0mF2、526_R3為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的為第526位胺基酸(密碼子)的CAC突變為GAC，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒即為突變526CAC — GAC位點突變質粒。含有rpoB突變位點(511位)的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，rp0B_C0mF2、511_W7為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的為第511位胺基酸(密碼子)的CTG突變為CCG，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒即為突變511CTG — CCG位點突變質粒。含有katG基因315AGC — AAC突變的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，katG_comRl、katG(g-a)F7為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與katG基因(NC_000962第2153889-2156111)相比，不同的為第315位胺基酸(密碼子)的AGC突變為AAC，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-TEasy Vector連接得到的質粒即為突變315AGC — AAC位點突變質粒。含有katG基因315AGC — ACC突變的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，katG_comRl、katG(g-c)F6為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與katG基因(NC_000962第2153889-2156111)相比，不同的為第315位胺基酸(密碼子)的AGC突變為ACC，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-TEasy Vector連接得到的質粒即為突變315AGC — ACC位點突變質粒。
含有inhA突變點的痰液(由解放軍第三0九醫院提供)，inhA_comR2、inh_F12為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，送去測序，結果為該PCR產物的核苷酸與inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)相比，不同的是將第-15位核苷酸C突變為T，其餘均相同；將該PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接得到的質粒即為突變inhA_15T位點突變質粒。2、實時螢光PCR檢測靈敏性實時螢光PCR的反應模式示意圖如圖I所示，其中，上遊引物分別為序列表中的序列1、6、8，下遊引物分別為序列表中的序列2，3，4，5，7，9，10，Taqman探針為序列表中的序列 11，12，13。PCR反應液的最佳反應體系如下20ul反應體系中0. 4ul引物(引物的終濃度為0. 2uM)；0. 4ul Mg2+(Mg2+的終濃度為 200uM)；I. 6u I dNTP (dNTP 的終濃度為 200uM)；2ul Buffer(購自 Qiagen China，產品目錄號為 203203)，0. 3ul DNA聚合酶(DNA聚合酶的終濃度為0. 075U/ul)；0. 4ul已標記的探針(探針的終濃度為0. 2uM)；用水補足體積。PCR反應的最佳反應條件如下95°C 15min(預變性)，95°C 15s，62°C 40s (退火和延伸合併)(40個循環)。取出上述最佳擴增反應液，置於冰盒上，樣品取2ul，加入核酸反應管中。每次檢測應設陰性和陽性對照，陰陽性對照品加入量均為2ul。陽性對照為野生型質粒rpoB、野生型質粒inhA和野生型質粒katG,陰性對照為不加入模板。採用上述體系和條件，對步驟3製備的模板進行不同程度的稀釋，進行實時螢光定量PCR，引物為引物組I、引物組2和引物組3，探針為探針1-3。結果如圖2所示，其中，A為rpoB基因51IT — C位點擴增圖，模板為51ICTG — CCG位點突變質粒為rpoB基因526CAC — GAC位點擴增圖，模板為526CAC — GAC位點突變質粒；C為rpoB基因531TCG — TTG位點擴增圖，模板為531TCG — TTG位點突變質粒；D為rpoB基因533CTG — CCG位點擴增圖，模板為533CTG — CCG位點突變質粒；E為inhA基因突變位點15C — T位點擴增圖，模板為inhA 15C — T位點突變質粒；F為katG基因315G — C位點擴增圖，模板為katG315G — C位點突變質粒；G為katG基因315G — A位點擴增圖，模板為katG315G —A位點突變質粒。2，3，4，5分別表示樣本含量為102，103，104，IO5拷貝/ml, W為野生型質粒rpoB、野生型質粒inhA或野生型質粒katG, N為陰性對照,擴增大小均在預期範圍。「511CTG — CCG、526CAC — GAC,53ITCG — TTG、533CTG — CCG」中的 511、526、531、533為突變的胺基酸的位置(密碼子的位置)，「一」表示突變，「一前面的鹼基」為未突變的胺基酸的密碼子，「一後面的鹼基」為突變的胺基酸的密碼子。「315AGC — ACC、315AGC — AAC」中的315位為突變的胺基酸的位置(密碼子的位
置)，「一」表示突變，「一前面的鹼基」為未突變的胺基酸的密碼子，「一後面的鹼基」為突變的胺基酸的密碼子。
inhA-15T中的-15T位表示將inhA基因在其啟動子區的-15C突變為T。從圖中可以看出，該方法可以使低拷貝數的樣品DNA得到很好的擴增效果，其檢測下限達到IO2拷貝/ml反應體系，優化的體系及PCR條件，可以提高核酸擴增的特異性和聞效性，從而大大提聞了檢測靈敏度，有利於防止和減少汙染。實施例3、檢測樣品中結核分枝桿菌的耐藥性I、不同的生物樣品實時螢光定量PCR檢測採用實施例I得到3個引物組和3種探針，用實施例2優化的條件與體系，對155份臨床塗陽樣本(痰液，已知含有結核分枝桿菌，由解放軍第三0九醫院提供)進行實時螢光定量PCR檢測。檢測判斷標準為如果實時螢光PCR儀FAM通道有擴增螢光，則判斷為結核分枝桿菌rpoB基因某一位點突變，該臨床樣品存在抗利福平抗性；若實時螢光PCR儀HEX通道有擴增螢光，則判斷為結核分枝桿菌inhA基因或katG基因某一位點有突變，該臨床樣品存在抗異煙肼抗性。結果為耐利福平株I例，耐異煙肼株13例，耐利福平和異煙肼株33例，野生型株(注不存在耐利福平和耐異煙肼的突變基因)106例，I例未檢出。上述檢測結果與臨床塗片結果符合率達99%。部分實時螢光PCR的結果如圖3所示，從圖中可以看出，FAM通道有螢光擴增曲線，而HEX通道無螢光擴增曲線，判定該樣品為耐利福平樣品。為了證明用實施例I得到3個引物組和3種探針檢測的準確性，對其中155例臨床樣本的PCR產物進行序列測定，結果表明使用實施例I得到3個引物組和3種探針檢測I例耐利福平株的PCR產物測序結果如下編號為I的耐利福平株的PCR產物具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)53ITCG — TTG得到的核苷酸；13例耐異煙肼株的PCR產物測序結果如下編號為2的耐利福平株的PCR產物具有inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)_15C — T得到的核苷酸；編號為3-14的耐利福平株的PCR產物具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — C得到的核苷酸；33例耐利福平和異煙肼株的PCR產物測序結果如下編號為15-20的耐利福平株的PCR產物即具有inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)-15C — T得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸；編號為21的耐利福平株的PCR產物即具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — C得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)51IT — C得到的核苷酸；編號為22-23的耐利福平株的PCR產物即具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — A得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸；編號為24-47的耐利福平株的PCR產物即具有katG基因(NC—000962第2153889-2156111位核苷酸)315G —C得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC—000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸。從上述可以看出測序結果和使用實施例I得到3個引物組和3種探針檢測結果基本吻合，證明本發明的方法有很高的準確性。2、13種常見非結核分枝桿菌實時螢光定量PCR檢測結果判定釆用實施例I得到3個引物組和3種探針，用實施例2優化的條件與體系，對濃度均為lmg/ml的13種常見非結核分枝桿菌(均由中國藥品生物製品鑑定所提供)進行特異性測試，13種常見非結核分枝桿菌如下鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium subsp. avium Chester) ATCC 25291 ;胞內分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare (Cuttino and McCabe) Runyon) ATCC13950 ;療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum Prissick and Masson)ATCC 19981 ;海分枝桿菌(Mycobacterium marinum Aronson)ATCC 927 ;猿猴分枝桿菌(Mycobacterium simiaeKarassova et al.) ATCC 25275 ;勘薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii Hauduroy)ATCC 12478 ;偶然分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum subsp. fortuitum da Costa Cruz)ATCC 6841 ;耳止垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis (Trevisan) Lehmann and Neumann)ATCC 19420 ;母牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis Karlson and Lessel)ATCC 19210 ；淺黃分枝桿菌(Mycobacterium gilvum Stanford and Gunthorpe)ATCC 43909 ;草分枝桿菌(Mycobacterium phlei Lehmann and Neumann)ATCC 11758 ;龜分枝桿菌胺腫亞種(Mycobacterium abscessus)ATCC 19977。結果為均未出現假陽性。
權利要求
1.一種鑑定結核桿菌耐藥性的專用引物，其由一個以上引物組組成，每個所述引物組針對一種耐藥基因，所述每個引物組擴增的靶序列為包括突變位點在內的所有等位基因片段； 每個所述引物組包括用於擴增所述靶序列的特異性引物和一條共用引物。
2.根據權利要求I所述的專用引物，其特徵在於 所述耐藥基因為耐利福平基因和/或耐異煙肼基因。
3.根據權利要求I或2所述的專用引物，其特徵在於 所述特異性引物的3』末端鹼基與所述等位基因片段的突變位點的鹼基相同或互補。
4.根據權利要求1-3中任一所述的專用引物，其特徵在於 所述專用引物由如下3個引物組組成 用於擴增耐利福平基因的引物組由4條用於擴增GenBank Accession Number為NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、531TCG — TTG、533CTG — CCG突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物和I條共用引物I組成； 所述 4 條用於擴增 GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、53ITCG — TTG、533CTG — CCG 突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列分別為序列表中序列5、4、3和2 ；所述共用引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ; 用於擴增耐異煙肼基因的引物組A由I條用於擴增GenBank Accession Number為NC_000962第1674202-1675011位核苷酸的inhA基因的inhA_15T突變位點對應的等位基因片段的特異性引物和I條共用引物2組成； 所述用於擴增 GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸的inhA基因的inhA-15T突變位點對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列為序列表中序列7 ； 所述共用引物2的核苷酸序列為序列表中序列6 ； 用於擴增耐異煙肼基因的引物組B由2條用於擴增GenBank Accession Number為NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的 katG 基因的 315AGC — AAC、315AGC — ACC 突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物和共用引物3組成； 所述用於擴增 GenBank Accession Number 為 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的katG基因的315AGC — AAC、315AGC — ACC突變位點分別對應的等位基因片段的特異性引物的核苷酸序列分別為序列表中序列9和序列10 ； 所述共用引物3的核苷酸序列為序列表中序列8。
5.一種檢測結核桿菌的耐藥性的試劑，由權利要求1-4中任一所述的專用引物和專用探針組成； 所述專用探針的數目與所述引物組的數目相同，一種所述專用探針與權利要求1-4中任一所述的專用引物中的一個引物組擴增的靶序列特異結合。
6.根據權利要求5所述的試劑，其特徵在於 所述耐藥性為耐利福平和/或耐異煙肼。
7.根據權利要求5或6所述的試劑，其特徵在於所述專用探針均為螢光標記探針，所述螢光標記探針的標記物具體為螢光素。
8.根據權利要求5-7中任一所述的試劑，其特徵在於 所述螢光素為6-羧基螢光素或六氯螢光素。
9.根據權利要求5-8中任一所述的試劑，其特徵在於 所述專用探針由如下3種組成 專用探針I為與所述用於擴增耐利福平基因的引物組擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針I的5』末端標記6-羧基螢光素，所述專用探針I的核苷酸序列為序列表中的序列11 ; 專用探針2為與所述用於擴增耐異煙肼基因的引物組A擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針2的5』末端標記六氯螢光素，所述專用探針2的核苷酸序列為序列表中的序列12 ； 專用探針3為與所述用於擴增耐異煙肼基因的引物組B擴增的靶序列特異結合的探針，所述專用探針3的5』末端標記六氯螢光素，所述專用探針3的核苷酸序列為序列表中的序列13。
10.一種檢測結核桿菌的耐藥性的PCR試劑，由權利要求5-9中任一所述的試劑、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR緩衝液組成； 所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為O. 2μΜ ; 所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為200 μ M ; 所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中的濃度為O. 075U/ μ L ； 所述Mg2+在所述的PCR試劑中的濃度為200 μ M0
11.含有權利要求5-9中任一所述的試劑或權利要求10所述的PCR試劑的試劑盒。
12.權利要求1-4中任一所述的專用引物在檢測結核桿菌的耐藥性中的應用。
13.權利要求5-9中任一所述的試劑或權利要求10所述的PCR試劑在檢測結核桿菌的耐藥性中的應用。
14.權利要求11所述試劑盒在檢測結核桿菌的耐藥性中的應用。
15.根據權利要求12-14中任一所述的應用，其特徵在於 所述耐藥性為耐利福平和/或異煙肼。
16.一種輔助檢測待測樣品中結核桿菌的耐藥性的方法，包括如下步驟用權利要求1-4中任一所述的專用引物或權利要求5-9中任一所述的試劑或權利要求10所述的PCR試劑或權利要求11所述試劑盒對待測樣品進行實時螢光雙重TaqmanPCR擴增，若螢光PCR儀6-羧基螢光素通道有擴增螢光，則所述待測樣品耐利福平，若螢光PCR儀六氯螢光素通道有擴增螢光，則所述待測樣品耐異煙肼。
17.根據權利要求16所述的方法，其特徵在於 所述PCR擴增中，以待測樣品的基因組DNA為模板。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其特徵在於 所述PCR擴增的退火溫度為62°C。
19.根據權利要求16-18中任一所述的方法,其特徵在於 所述待測樣品為含有結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的痰液。
全文摘要
本發明公開了一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法和試劑盒。本發明提供的鑑定待測樣品中結核桿菌的耐藥性的專用引物和專用探針，其中，所述專用引物包括多個引物組，每個所述引物組包括多條用於擴增同一目的基因的每個突變位點對應的等位基因的特異性引物和一條共用引物；所述專用探針包括多種探針，所述每種探針與對應所述引物組中的所述共用引物和所有所述特異性引物的靶序列特異結合。本發明的實驗證明，本發明提供的專用的引物和專用的探針，可以通過高效靈敏的雙重Taqman實時螢光PCR技術和序列特異性引物擴增技術(Sequence specific primer，SSP)相結合，在較短時間內檢測待測樣品中結核桿菌的耐藥性。
文檔編號C12Q1/68GK102618625SQ201110030149
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者李洪敏, 王思賢, 高華方, 魏運榮 申請人:中國人民解放軍第三O九醫院, 博奧生物有限公司, 清華大學