一種選育小麥條銹病持久抗性材料的方法與流程
2023-05-13 12:34:51
本發明屬於小麥抗病育種領域，具體涉及一種選育小麥條銹病持久抗性材料的方法。
背景技術：
小麥條銹病是由小麥條形柄鏽菌(pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌性氣傳病害，可導致小麥區域性減產0.1-5％，嚴重時減產達5-25％。我國是世界上最大的小麥條銹病流行區，曾多次爆發條銹病大流行，據統計，2002-2012年我國條銹病平均發生面積約420萬hm2/年，對小麥生產構成巨大威脅。小麥條鏽菌夏孢子可隨氣流進行遠距離傳播的特性，使其能迅速引起病害垮地區循環流行，屬大區流行病害。
利用抗條銹病基因選育抗病品種是控制條銹病最經濟和環保的方式。基於對小麥條銹病的抗性反應，小麥條銹病抗性基因分為兩類：全生育期抗性(苗期抗性)和成株期抗性。全生育期抗性(苗期抗性)通常持續整個生育階段，該抗性基因具有小種專化性，抗性水平高，易於觀察，屬質量性狀遺傳。而成株期抗病基因一般對廣泛的病原菌均有一定抗性，抗性水平低，不易觀察，屬數量性狀遺傳。由於在小麥條銹病育種中，育種者更加傾向於使用抗性水平高、易於觀察的全生育期抗性基因，對小麥條鏽菌施加了巨大的選擇壓，導致條鏽菌優勢生理小種變異快、新生理小種易出現，這是導致小麥條銹病抗性快速喪失的主要原因。開發利用抗性持久且不具小種專化性的成株期抗性基因，是控制條銹病的一個長治有效措施。但面臨的問題是單個或少數成株期抗性基因或者qtl提供的抗性達不到生產中對小麥品種抗性水平的要求。
技術實現要素：
本發明的目的包括：
提供一種解決苗期抗性和成株期抗性基因單獨利用局限的育種方法；
提供一種選育小麥條銹病抗性持久、穩定育種材料的方法。
具體的，本發明提供了一種選育小麥條銹病持久抗性材料的方法，包括以下步驟：
1)收集小麥條銹病菌種，接種鑑定篩選出全生育期抗性材料p1；
2)以p1為母本，以含yr18成株期兼抗型材料p2為父本，配置雜交，獲得雜交種f1；
3)以f1為母本，以p1為輪迴親本，進行多代回交；從bc1f1至bc5f1，每代回交前，先選擇回交後代中的全生育期抗病株，在抽穗前摘取單株葉片提dna，採用yr18成株期兼抗型共顯性標記進行檢測，確保所選母本含有yr18成株期兼抗型基因，至得到抗性穩定的材料。
優選的，步驟1)所述小麥條銹病菌種為cyr29、cyr30、cyr31、cyr32、cyr33、v26和/或水源14，所述鑑定為室溫混合小種高壓鑑定；
步驟1)所述接種的接種材料為10p4-8、13p2-7和/或14p532。
優選的，步驟2)所述含yr18成株期兼抗型父本材料為13kg458和/或13kg662。
優選的，步驟3)所述回交為採用夏繁加代技術回交；
步驟3)所述yr18成株期兼抗型共顯性sts標記為cslv34；
步驟3)所述的檢測方法為分子標記檢測，其中pcr擴增體系共20μl,包括2μl10×buffer、1utaqdna聚合酶、0.4μldntps、0.5μl引物、50ng模板dna，其中4種dntp的濃度各為10mmoll–1，taqdna聚合酶的濃度為2.5uμl–1，正、反向引物的濃度均為4μmoll–1；pcr擴增程序為：94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,5個循環；94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環；最後94℃變性1min,57℃退火30s,72℃延伸5min；
所述引物的序列為：
正向引物：5′-gttggttaagactggtgatgg-3′；
反向引物：5′-tgcttgctattgctgaatagt-3′。
進一步的，將步驟3)pcr擴增產物進行電泳檢測，擴增產物中出現150bp的條帶，則材料含有yr18成株期兼抗型基因。
本發明還公開了以上任一項方法選育出的材料作為小麥抗條銹病品系參加品系比較實驗或作為育種中間材料的用途。
所述yr18成株期兼抗型基因的核苷酸序列，可參見文獻:krattingersg,lagudahes,spielmeyerw,singhrp,huerta-espinoj,mcfaddenh,bossolinie,selterll,kellerb.aputativeabctransporterconfersdurableresistancetomultiplefungalpathogensinwheat.science,2009,323:1360–1363
所述yr18成株期兼抗型共顯性sts標記cslv34，可參見文獻：lagudahes,mcfaddenh,singhrp,huerta-espinoj,barianahs,spielmeyerw.moleculargeneticcharacterizationofthelr34/yr18slowrustingresistancegeneregioninwheat.theorapplgenet,2006,114:21–30。有益效果
本發明方法採用混合小種高壓鑑定和多代回交技術，將苗期抗病基因與yr18等成株期抗病基因結合，可高效培育得到條銹病持久抗性育種材料，為抗鏽育種提供優異中間材料。
附圖說明
圖1小麥條銹病持久抗性高效選擇技術流程圖
圖2聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測結果圖
其中，☆符號表示單株含有目的基因，可選擇做回交母本。
具體實施方式
實施例一、室溫混合小種高壓鑑定選擇全生育期抗性材料p1試驗。
將所收集的cyr29、cyr30、cyr31、cyr32、cyr33、v26、水源14等菌種混合備用，在溫室中採用盆栽方式種植待篩選材料，每個材料播種5-8粒，待生長至1心1葉期，採用塗抹法接種混合菌種，接種後用加溼器加溼24h，保持黑暗條件，室溫控制在10-16℃，之後調節室溫至20℃左右，光照時間12h，接種後15-20d，待感病對照川育12充分發病後，鑑定待測材料的苗期抗病性，篩選出10p4-8、13p2-7、14p532等苗期抗病性好的優異材料。
實施例二、p1×p2雜交獲得f1代試驗。
以實施例1所篩選出的優異材料(10p4-8、13p2-7、14p532等)為母本p1，以已知含yr18成株期兼抗型材料(如13kg458、13kg662等)為父本p2，進行雜交組合配置，獲得f1材料。
實施例三、回交試驗及田間鑑定
利用實施例二所獲得的f1材料為母本，以實施例二所述的同一含yr18成株期兼抗型材料(如13kg458、13kg662等)p2為父本，雜交獲得bc1f1種質；下一代又以bc1f1為母本，以p2為父本，雜交獲得bc2f1；照此方式，直至bc6f1，得到抗病目標性狀及農藝性狀穩定的材料yrp。以上實施過程在田間優勢多小種誘發條件下開展，所選擇的回交母本單株苗期及抽穗後條鏽抗性表型均為高抗。誘發材料與回交試驗材料相間種植，分別於1心1葉期，3葉期和抽穗前採用塗抹法接種混合優勢小種，苗期鑑定在第一接種後20-30d進行，成株期鑑定在抽穗後鑑定。正季世代在成都新都試驗農場開展，夏季繁殖加代在西昌螺髻山進行。
實施例四、回交後代的全生育期抗病株yr18成株期兼抗型基因鑑定試驗。
在實施例三所選擇的母本材料雜交前先提取dna，利用共顯性sts標記cslv34進行yr18成株期兼抗型基因篩選，pcr反應體系共20μl,包括2μl10×buffer、1utaqdna聚合酶(2.5uμl–1)、0.4μldntps(4種dntp的濃度均為10mmoll–1)、0.5μl引物(4μmoll–1)、50ng模板dna。pcr程序為94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,5個循環；94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環；最後94℃變性1min,57℃退火30s,72℃延伸5min。pcr擴增產物通過6％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳進行檢測，預期擴增產物為150bp(含目的基因)和229bp(不含目的基因)。選擇含擴增產物為150bp的單株為實施例三中的回交母本。
6％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測試驗：
1、玻璃板準備：將一塊為平板和一塊為凹槽板用清水充分衝洗乾淨，再用無水乙醇擦洗一遍，然後通風晾乾。
2、塗板：待酒精幹後，在凹槽板上均勻塗抹剝離矽烷，晾乾；在平板上均勻塗抹親和矽烷(親和矽烷原液8ul+冰乙醇8ul+無水乙醇2ml)，晾乾。
3、裝板：玻板在下，電泳槽板在上，將邊條置於2板之間的兩側，對齊後，用蘭對夾子將波板與電泳槽板夾緊，水平放置。
4、灌膠；量取50ml6％的聚丙締酷胺凝膠溶液，加入350ulaps(即10％的過硫酸錠和28ultemed)，倒入灌膠器並混勻，緩慢均勻的從灌膠口將膠灌入，然後將梳子的平直面插入膠口中，注意不要起汽泡，放置1小時左右。
5、預電泳：取下夾子，拔出倒插的梳子，將膠板放入電泳糟，卡緊，灌入緩衝液，即ixtbe。80w衡功率電泳半小時。
6、點樣：拔出梳子，用移液槍吹乾淨灌膠口的廢膠，將梳子順插入灌膠口，再用移液槍將毎個梳孔吹乾淨，開始點樣。
7、電泳：80w衡功率電泳1小時左右。
8、銀染：將膠板從電泳槽中取下，分開兩玻璃板，將帶膠的玻璃板膠面朝上放入銀染15min，銀染過程需要避光。
9、水洗：將玻璃板從銀染液取出，用蒸鏈水快速水洗15s。
10、顯影：將水洗完的玻璃板放入顯影液，直至條帶清晰。
11、再次水洗：用自來水輕接衝洗一會，將膠面上的naoh洗掉，放置晾乾。
12、統計觀察：將玻璃板放置在觀片燈上可直接統汁條帶數據；
部分回交後代的凝膠檢測結果，如說明書附圖2所示。
序列表
四川省農業科學院作物研究所
一種選育小麥條銹病持久抗性材料的方法
2017
2
patentinversion3.3
1
21
dna
人工序列
1
gttggttaagactggtgatgg21
2
21
dna
人工序列
2
tgcttgctattgctgaatagt21